꿀벌에서 두뇌 Homogenate에서 Phospholipase C 활동의 탐지

요약

꿀벌 두뇌의 다른 지역에서 phospholipase C (PLC)에 pharmacologic 에이전트의 억제 효과 테스트 하려면 우리는 그 지역에서 PLC 활동을 측정 하는 생 화 확 적인 분석 결과 제시. 이 분석 결과 PLC 활동 조직 들 뿐만 아니라 다른 행동을 전시 하는 꿀벌 들을 비교 하는 데 유용 수 있습니다.

초록

꿀벌은 복잡 한 행동과 학습, 메모리, 및 분업 등 더 높은 두뇌 기능을 평가 하기 위한 모형 유기 체. 버섯 몸 (MB)은 복잡 한 꿀벌 행동의 신경 기질 수 제안 더 높은 두뇌 센터 이다. 이전 연구 유전자와 단백질을 차동는 MBs 및 다른 뇌 영역에 표시 됩니다 확인, 각 지역에 있는 단백질의 활동은 아직 완전히 이해 되지. 두뇌에 있는이 단백질의 기능을 공개, 약리학 적인 분석 가능한 접근 이지만 약리학 적인 조작 사실 이러한 두뇌 지구에서 단백질 활동 변경 확인을 첫 번째 필요.

우리는 이전 phospholipase C (PLC) 다른 두뇌 지역에 보다 MBs에 인코딩 하는 유전자의 높은 식 식별 하 고 약리학 꿀벌 행동에 PLC의 참여 평가. 그 연구에서 우리는 화학적 두 pharmacologic 에이전트를 테스트 하 고 그들은 PLC는 MBs 및 다른 뇌 영역에서 활동 감소 확인. 여기, 우리는 꿀벌 뇌 homogenate에서 PLC 활동을 검출 하는 방법에 대 한 자세한 설명을 제시. 이 분석 결과 시스템에서 homogenates 서로 다른 뇌 영역에서 파생 된 합성 fluorogenic 기판으로 반응 하 고 PLC 활동에서 발생 하는 형광은 계량 두뇌 지구 사이 비교. 우리는 또한 동일한 시스템을 사용 하 여 PLC 활동에 특정 약물의 억제 효과의 평가 설명 합니다. 이 시스템은 다른 생 형광 화합물 및 분석 결과 구성 요소와 조직의 흡 광도 의해 영향을 가능성이 높습니다, 하지만이 시스템을 사용 하 여 PLC 활동의 측정은 안전 하 고 전통적인 분석 결과 사용 하 여 보다 쉽게는 방사선된 기판을 필요합니다. 간단한 절차와 조작 PLC 활동 두뇌와 다른 사회적 작업에 관련 된 꿀벌의 다른 조직에서 검사 수 있습니다.

서론

유럽 꿀벌 (Apis mellifera L.)는 eusocial 곤충, 그리고 여성 꿀벌 표시 노동의 연령에 따라과 계급 종속 복제. 예를 들어 '노동자' 라고 하는 꿀벌의 메 마른 계급, 젊은 개인이 오래 된 것 들 꼴 꿀 및 꽃가루 하이브¹밖에 서 하는 동안이 broods 피드. 학습 및 메모리 채집 반복적으로 음식 소스와 그들의 둥지 사이 앞뒤로 이동 해야 합니다 때문에 좋은 음식 소스 춤을 통해 그들의 nestmates의 위치를 의사 소통 능력은, 꿀벌의 삶에 매우 중요 하다 통신¹. 이전 학문 설명 MB, 곤충에 더 높은 두뇌 센터는 꿀벌^2,,34의 학습 및 기억 능력에 관여 했다. 차동 표현한 유전자와 단백질 꿀벌^{5,6,7,8,,910 의 다양 한 두뇌 지역에서 발견 되었습니다. 11}, 각 뇌 영역의 독특한 기능 관련 제안. 약리학 적인 억제 또는 관심사의 단백질의 활성화는 꿀벌 행동^12,,1314에 단백질의 기능을 잘 사용된 접근, 그것은 알 모든 약물 여부 꿀벌 두뇌의 다른 지역에서 기능적 효과 있다. 같은 약물의 기능 유효성 검사 행동 약리학의 연구에서 결론을 강화 것입니다.

여기, 우리는 PLC, 마우스 인식^15,,1617,18에 연루 효소 중 하나에 집중 한다. PLC는 칼슘을 이노 시 톨 1,4,5-trisphosphate (IP₃) 및 diacylglycerol (DAG)^19,,2021에 phosphatidylinositol 4, 5 bisphosphate (핍₂)를 저하 하 여 신호를 트리거합니다. IP₃ IP₃ 수용 체 (ER), 바인딩과 그물에 응급실에서 칼슘 이온의 출시로 이어지는 열립니다. 나온된 칼슘 calmodulin와 칼슘 calmodulin 인당 단백질 키 니 아 II (CaMKII)와 단백질 키 니 아 제 C (PKC) DAG의 존재를 활성화합니다. 두 단백질 kinases는 학습 및 메모리^22,23,이 과정에서 PLC의 참여와 참여. Plc는 하위 유형, PLCβ, PLCγ, PLCε,²⁰그들의 구조 따라 등으로 분류 됩니다. 각 PLC 하위 컨텍스트²⁰에서 활성화 되 고 그 하위 인코딩 유전자 차동 다른 조직에 표현 됩니다. 우리는 이전 증명 꿀벌 MBs 유전자는 나머지 뇌 영역²⁴, 보다 높은 수준에서 PLCβ 및 PLCε 하위 인코딩 익스프레스 고 두 팬 PLC 억제제 (edelfosine, 네오 마이 신 황산 [네오 마이 신])에서 PLC 활동 감소 다른 지역 두뇌와, 참으로, 꿀벌²⁴의 학습 및 기억 능력에 영향을 미칠.

전통적으로, PLC의 효소 활동 방사선된 핍₂²⁵, 적절 한 훈련, 장비 및 시설 필요를 사용 하 여 측정 되었습니다 했다. 최근, PLC의 합성 fluorogenic 기판 설립된²⁶, 표준 실험실에서 PLC 활동을 평가 하기 쉽게 되었습니다. 여기, 우리 fluorogenic 기판을 사용 하 여 꿀벌의 다른 뇌 영역에 PLC 활동을 감지 하 고 이후에이 조직에 PLC에 edelfosine의 네오 마이 신 억제 효과 테스트 하는 자세한 프로토콜을 제시. 프로토콜 기본 조작만 필요, 그것은 꿀벌 다른 사회적 작업에 할당 된 다른 조직에서 PLC 활동 또는 뇌의 연구에 적용할 수 있습니다.

프로토콜

1입니다. 구하고 꿀벌의 캡처

1. 꿀벌 식민지는 현지 대리점에서 구입.
2. 곤충 그물을 사용 하 여, 그들의 뒷 다리에 꽃가루 가방 하이브를 반환 하는 사실을 꿀벌 잡아. 표준 50 mL 플라스틱 원뿔 튜브에 꿀벌을 전송 하 고 캡 튜브 (그림 1). 얼음이 꿀벌을 anesthetize에 튜브를 넣어.
   참고: 양 봉 벌 침 방지 하기 위해 지정 된 재킷을 착용 하십시오. 간호 꿀벌 실험에 따라 수집 될 수 있습니다. 간호사 꿀벌을 잡으려고 왁 스 빗에 꿀벌의 행동을 관찰 하 고 브루 드 셀 날개 또는 핀셋을 사용 하 여 흉부 애벌레 먹이 그들의 머리를 찌를 간호사 꿀벌을 잡아. 그런 다음, 꿀벌 50 mL 플라스틱 튜브로, 튜브, 모자 놓고 1.2 단계에서 언급 한 얼음에 넣어.
3. 무작위로 12 채집을 캡처하십시오.
   참고:이 프로토콜 6 많은 결과 많은 당 두 꿀벌을 사용 합니다. 여러 개의 꿀벌 1 개의 관에 잡힐 수 있습니다 및 각 주차장에 꿀벌 나중 결합으로 하나의 튜브에 꿀벌의 수, 중요 하지 않다 (단계 3.1.1 참조). 튜브에 고온 부상 꿀벌 튜브 멋진 여름에 계속.

2입니다. 꿀벌 뇌의 해 부

1. 실험실에서 anesthetize 꿀벌을 적어도 30 분⁶ 얼음에 50 mL 튜브를 놓습니다.
2. 치과 왁 스의 조각을 반 접어 해 부 무대를 준비 하려면 (결과 크기는 약 3.5 x 7.5 c m) 플라스틱 접시 (60 x 15 m m)에 그것을 밀어.
   참고: 접힌된 왁 스 단단히 곤충 핀을 보유 하고있다.
3. 쌍 안 현미경에서 핀셋으로 자사의 시체에서 꿀벌의 머리를 분리 하 고 상승 위치 (그림 2A)에 머리의 앞쪽을 각 안테나의 기지에서 곤충 핀을 삽입 하 여 치과 왁 스에 그것을 해결 합니다.
   참고: 세척 소독된 물 또는 에탄올을 사용 하 여 사용 하기 전에 핀셋.
4. 그것을 충당 하기 위해 머리에 충분 일 분 해결책 (0.13 mol/L NaCl, 5 mmol/L KCl, 그리고 1 mmol/L CaCl₂-2 H₂O)를 붓는 다. 머리는 솔루션에 뜨는 경우는 핀으로 다시 머리 피어스. 얼음 처럼 차가운 식 염 수 솔루션을 사용 하 여 필요한 경우.
   참고: 그러나,이 찬 염 없이 작동합니다.
5. 핀셋 (그림 2B)를 사용 하 여 안테나를 제거 합니다.
6. 안테나의 고 경도 화합물 눈, 메스를 사용 하 여 테두리에 기지 근처 가로 컷을 확인 합니다. 다음, 머리의 상단에서 가로 잘라를 확인 하십시오. (그림 2C) 뇌에 창을 열려면 표 피를 제거 합니다.
   참고: 필요한 경우 에탄올 또는 사용 하기 전에 소독된 물 메스를 씻어.
7. ocelli를 한다 (그림 2D) 핀셋을 사용 하 여 뇌의 앞쪽 표면에는 retinae를 제거 합니다.
8. 확장 겹 눈의 테두리에서 잘라 dorsally ventrally, 메스 (그림 2E)를 사용 하 여 합니다. 다음, 바로 아래 눈 표 피 (그림 2F) 핀셋을 삽입 하 여 겹 눈의 표 피와 retinae 사이 결합 조직의 제거.
9. 겹 눈의 표 피를 삭제 합니다. 핀셋으로 겹 눈의 retinae의 지 느 러 미 끝을 선택 하 고 신중 하 게 retinae (그림 2G)을 벗기다 복 부 방향으로 핀셋을 이동.
10. 조심 스럽게 핀셋 (그림 2H)를 사용 하 여 뇌의 앞쪽 표면에 남아 있는 기관 제거.
11. 두뇌 사이 조직, 핀셋를 사용 하 여 주위 결합 조직을 잘라내어 머리 캡슐 (그림 2H)에서 뇌를 해 부.
12. (그림 2나) 핀셋을 사용 하 여 두뇌의 후부 표면에 한다 벗기십시오.
13. 메스를 사용 하 여 잘라는 MBs 및 MBs (그림 2J)의 일부인 수직 엽 옆 다른 두뇌 지구 사이 연결.
14. 해 부 MBs 장소와 남은 뇌 조직을 1.5 mL 튜브에 빠르게 드라이 아이스 나 액체 질소 (그림 2K) 그들을 동결. -80 ° C에서 냉동된 조직 사용까지 저장 합니다.
    참고: 지정 된 장갑과 찬 화상 및 질 식 방지 하기 위해 환기와 액체 질소를 처리 합니다. 드라이 아이스도 장갑과 신중 하 게 처리 되어야 합니다. 프로토콜 여기 일시 중지 될 수 있습니다. 해 부 및 저장 조직 되어야 하는 뇌의 단백질 저하를 방지 하려면 한 번에 한 벌을 수행.

3입니다. 뇌 Homogenates의 준비

1. 균질 버퍼 이루어진 50 mmol/L HEPES의 10 µ L 추가-코 (pH 7.2), 70 mmol/L KCl, 및 1.0 mmol/L CaCl₂ 는 냉동에 뇌 조직 그리고 수동으로 플라스틱 유 봉과 압력을 적용 하 여 1.5 mL 튜브에 조직 균질. 조직 적어도 200 스트로크 x.
   참고: 얼음 3에 설명 된 조작을 수행 합니다. 유 봉 오른쪽 맞춤을 사용 하 여 충분히 조직 부 관에는 쉽게 균질 버퍼에 부동.
   1. 무 균된 조직 솔루션에에서 다음 조직에 전송 하 고 같은 방식으로 조직을 균질.
      참고: 각 많은 꿀벌이이 단계에서 결합 됩니다. 이 프로토콜 6 많이 사용합니다.
2. 균질 버퍼의 30 µ L를 추가 합니다.
3. 약 900 x g²⁷ 와 4 ° C에서 10 분 동안 무 균된 조직 샘플을 원심
4. 새로운 1.5 mL 튜브에는 상쾌한을 전송 하 고 다시 약 9500 g²⁷ 와 4 ° c.에 20 분 동안 원심
5. 새로운 1.5 mL 튜브에 상쾌한 장소. 사용까지-20 ° C에서 homogenate를 저장 합니다.
   참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.
6. Bicinchoninic 산 (BCA) 분석 결과 사용 하 여 단백질 농도 결정 합니다.
   1. (따라서에 homogenate diluting eightfold) 멸 균 물의 17.5 µ L로는 homogenate의 2.5 µ L를 희석 하 고 모든 희석된 homogenate를 사용 합니다.
      참고: 샘플링 homogenate는 micropipette를 사용 하 여 그것의 높은 점성 때문에 신중 하 게 수행 되어야 합니다.
   2. 사용 하 여 0, 0.1, 0.2, 0.4, 1.0, 및 2.0 mg/mL 소 혈 청 알 부 민 (BSA)의 20 µ L에 표준으로 BCA 분석 결과 수행 합니다.
      참고: 변경의 필요에 따라 BCA 분석 결과 규모 homogenate 표준 샘플의 볼륨에 따라. 프로토콜 여기 일시 중지 될 수 있습니다.

4. PLC 반응 두뇌 Homogenates에서

1. 50 µ / L에서 소독된 물에 녹아 있는 fluorogenic 기판 WH-15²⁶ 의 재고 솔루션을 준비 하 고-80 ° c.에 그것을 저장합니다
   참고: 퇴색을 방지 하기 위해 호 일 기판을 포함 하는 솔루션을 커버 합니다.
2. 반응 혼합물의 10 µ L에서 다음 구성 달성 하기 위해 필요한 볼륨에 반응 premixture 준비: 50 mmol/L HEPES-코 (pH 7.2), 70 mmol/L KCl, 1.0 mmol/L CaCl₂, 2.0 mmol/L dithiothreitol, 50 mg/L BSA, 및 12.5 µ / L WH-15.
3. 필요한 경우 균질 버퍼, homogenate 희석.
4. 혼합 반응 premixture와 반응 혼합물의 10 µ L의 최종 볼륨을 달성 하기 위해 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 튜브에 있는 단백질의 1.3 µ g를 포함 하는 homogenate.
   1. 통계 분석에 대 한 두 가지 유형의 제어 혼합물 준비: homogenate 하지만 혼합물 (컨트롤 1), 혼합물으로 하지 ㅁ-15와 반대로 (제어 혼합물 2).
      참고: 반응 혼합물과 단백질 저하와 PLC의 반응을 방지 하기 위해 얼음에 제어 섞어 준비 합니다. 제어 혼합물 1과 2는 각각 homogenate 및 무료 기판, 형광을 검출 하는 데 사용 됩니다.
5. 튜브를 제거 하 고 25 ° c.에 30 분 동안 열 cycler에서 품 어
6. 25 mmol/L 에틸렌 글리콜 비스 (β-aminoethylether)의 2 µ L을 추가 하 여 반응을 중지-N, N, N', N'-tetraacetic 산.
   참고: 적절 한 단백질 양의 반응 시간 실험 마다 다릅니다. 따라서, 반응 조건 최적화, 그것 형광 선형으로 증가 될 때까지 단백질 양과 보육 시간을 변경 하 여 예비 실험 단계 4.1 5.3에서에서 설명한 절차를 반복 하 여 필요할 수 있습니다. 참고로, 다른 두뇌 지구에서 파생 된 homogenate을 사용 하는 경우 반응 보통 작동 선형 1.3 µ g 또는 30 분, 하지만 선형 단백질의 더 적은 단백질의 적어도 2.7 µ g 또는 90 분의 또는 lo는 보육 시간 감소 nger입니다.

5. PLC 활동에서 발생 하는 형광의 탐지

1. 반응 혼합물 및 약 310 x g²⁸ 에서 5 분에 대 한 제어 혼합물 centrifuge 고 384-잘 microplate 형광 검출에 대 한 적용에 다른 우물에는 상쾌한의 10 µ L를 전송.
   참고: 페이딩 및 먼지와 오염을 방지 하기 위해 호 일 접시 커버.
2. 플러시는 microplate에 대 한 원심 분리기를 사용 하 여 미 판.
3. Microplate 리더에 접시를 설정 하 고 기술 3 중으로 형광을 검출.
   참고: 여기 및 방출 파장은 344 및 530 nm, 각각. (Microplate 리더)에 따라 해당 하는 경우 혼합 5 샘플 혼합물 각 검색 전에 s. 프로토콜은 여기 중지 될 수 있습니다.

6. 테스트 Pharmacologic 에이전트의 금지 조치의

1. Edelfosine와 네오 마이 신에 적절 한 농도의 재고 솔루션을 준비 하 고 사용까지 그들을 저장: 5.0 mmol/L에-20 ° C; edelfosine 550 mmol/L와 4 ° C에서 네오 마이 신
2. 설명 된 대로 반응 premixture를 준비할 때 단계에서 4.2., 적절 한 최종 농도 달성 하기 위해 premixture에 억제제를 추가: edelfosine, 1.0 mmol/L; 네오 마이 신, 0.55 m m o l/l.
3. 4.4 단계에서 반응 premixture 하 고 적절 한 제어 혼합물에는 homogenate를 추가 합니다.
   1. 세 가지 유형의 제어 혼합물 준비: 제어 혼합물 1;는 homogenate와 억제제, 하지만 하지 기판 투입 기판 및 억제제만 하지 homogenate 제어 혼합물 2;로 추가 그리고 억제 물, 하지만 하지는 homogenate 또는 기판 제어 혼합물 3로.
4. PLC 반응 및 형광 단계 4.5 5.3에에서 설명 된 대로의 검출을 수행 합니다.

7. 통계 분석

1. 섹션 4에서에서 설명한 혼합물을 사용 하 여 PLC 활동의 탐지를 위해 다음과 같이 homogenate 또는 무료 기판에서 방출 하는 형광을 빼서 PLC와 기판 사이의 반응에서 파생 하는 형광을 계산 합니다.
   
   플로리다 (PLC 활동) = Fl (반응 믹스)-{Fl (ctrl 1) + Fl (ctrl 2)}
   ​
   참고: Fl (PLC 활동), 플로리다 (반응 믹스), 플로리다 (ctrl 1)와 플로리다 (ctrl 2) PLC 활동에서 파생 된 진실 fide 형광을 나타내는, 형광 검출 반응 혼합물, 및 제어 혼합물에 1, 2, 각각.
   1. 4.1-5.3, 단계에서 설명한 대로 혼합물에서 형광 측정 후 단계 7.1에서에서 방정식 그리고 플로리다 (PLC 활동) 각 homogenate에 대 한 기술 3 중의 뜻에 따라 플로리다 (PLC 활동)을 계산 합니다.
   2. 7.1.1 단계에서 얻은 기술 3 중의 평균 Fl (PLC 활동)를 사용 하, 생물 복제는 MBs와 다른 두뇌 지역 평균 Fl (PLC 활동)를 다시 계산 하 고 뇌 조직 간의 값을 비교.
2. 억제제 섹션 6에에서 설명 된 혼합물을 사용 하 여 존재 PLC 활동의 시험, 형광 homogenate, 기판와 억제 물 사이 반응에서 파생 된 다음과 같이 계산 합니다.
   
   Fl (와 억제제 PLC 활동) = Fl (반응 믹스)-{Fl (ctrl 1) + Fl (ctrl 2)} + Fl (ctrl 3)
   
   참고: 여기, Fl (와 억제제 PLC 활동)는 진실 fide 형광 PLC는 억제제의 활동에서 유래한. Fl (반응 믹스), 플로리다 (ctrl 1), 플로리다 (ctrl 2)와 플로리다 (ctrl 3) 형광 신호 제어 혼합물 1, 반응 혼합물에서 감지 제어 혼합물 2, 및 제어 혼합물 3, 각각 있습니다.
   1. 혼합 단계 6.1 6.4에에서 설명 된 대로에 형광 측정 후 단계 7.2에서에서 방정식에 따라 Fl (와 억제제 PLC 활동)을 계산 합니다. 그런 다음, 각 homogenate에 대 한 기술 3 중의 평균 Fl (와 억제제 PLC 활동)를 얻을.
   2. 7.2.1 단계에서 계산한 평균 값을 사용 하 여, 각 뇌 조직에서 파생 된 생물 복제의 의미 Fl (와 억제제 PLC 활동)를 계산 합니다. Fl (와 억제제 PLC 활동)과 7.1.2 각 뇌 조직에 단계에서 얻은 Fl (PLC 활동)를 비교 합니다.

결과

Homogenates 뇌에에서 단백질 농도:
우리는 사실을 꿀벌을 사용 하 여 homogenates을 준비. 원래 homogenates에서 계산된 단백질 농도 그림 3에 나와 있습니다. 원래 homogenate에 대략적인 단백질 농도 했다 다음과 같습니다: 1.5 m g/mL는 MBs에서 그리고 다른 두뇌 지역에 2.3 mg/mL. 우리가 사용 하는 많은 당 두 꿀벌 그리고 6 많은 분석 했다.

뇌 Homogenates에서 PLC 활동의 탐지:
파일럿 실험에서 우리는 MBs에서 보다 다른 두뇌 지구에서 높은 형광을 감지. 따라서, 우리는 다른 두뇌 지역의 homogenate를 사용 하 여 예비 실험을 반복 하 고 반응 시간 (즉

토론

단백질 활동의 생화학 검사는 심히 중요 한 효소의 활동 억제제, 기판 등 다양 한 분자에 의해 영향을 함께 따라서, 변경할 수 있습니다 때문에 두뇌에 신호 분자를 이해 하기 위한 동물 행동 (예, 학습 및 메모리)⁵. 꿀벌 연구, 순환 앰프 종속 단백질 키 니 아 제 A, 순환 GMP 종속 단백질 키 니 아 제, PKC, phosphorylated CaMKII, 및 adenylate 있고 같은 효소에 따라 다양 한 두뇌 지구에서 차동 표현 될 보고 immunohistochemistry^{5,10,29,,3031}. 그러나 뇌 영역 간의 효소 활동에 차이, 단지 부분적으로 보고

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Pierce BCA 단백질 분석 키트	ThermoFisher Scientific	23227	단백질 농도 측정을 위한 시약 키트
Pierce 소 혈청 알부민 표준 앰플 2mg/mL	ThermoFisher Scientific	23209	BCA 분석에 사용되는 표준 샘플
파라핀 왁스	GC	13B1X00155000141	해부 단계로 사용되는 치과용 왁스
곤충 핀	Shiga	No. 0	스테인리스, 솔리드 헤드
PLCglow	KXT Bio	KCH-0001	의 형광 기판
	Corning	4511	저용량, 검은색 원형 바닥판
Gemini EM 마이크로플레이트 리더	분자 장치
Edelfosine	Santa Cruz Biotechnology	sc-201021	pan-PLC 억제제
Neomycin 황산염	Santa Cruz 생명 공학	sc-3573	pan-PLC 억제제