망막 조직을 인간의 양수 막과 동물 모델에 이식의 준비 위에 경작 인간의 pluripotent 줄기 세포에서 파생 된 망막 색소 상피 세포의 구성 하는 방법을 설명 합니다.
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이 논문에서
요약
초록
눈의 여러 가지 병 적인 조건에는 기능 또는 망막 안료 상피 (RPE)의 생존에 영향을. 이러한 망막 화 (RP) 및 연령 관련 황 반 변성 (AMD)의 일부 형태를 포함합니다. 세포 치료는 이미 인 간에 있는 예비 결과 격려와 함께 이러한 질병을 치료를 제안 하는 가장 유망한 치료 전략 중 하나 이다. 그러나,는 이식의 준비의 방법의 기능적 결과 비보에 상당한 영향을 있다. 실제로, 세포 현 탁 액으로 투입 하는 RPE 세포는 망막 조직으로 이식 하는 같은 셀 보다 덜 기능적 이다. 여기, 우리 엔지니어 RPE 조직과 vivo에서 이식에 대 한 준비를 간단 하 고 재현 가능한 방법을 설명합니다. 인간의 pluripotent 줄기 세포에서 파생 된 RPE 세포 생물학 지원, 인간의 양수 막 (햄)에 시드 있습니다. 인공 건설 기계에 비해,이 지원 Bruch의 막 생 RPE 세포 연결 된 가까운 지하실 막의 이점이 있다. 그러나, 그것의 조작 쉽지 않다, 그리고 우리가 그것의 적절 한 경작에 대 한 몇 가지 전략 및 준비에 비보를 접목 개발.
서론
RPE 생존 및 대뇌는 그것은 밀접 하 게 관련 된1의 항상성 위해 결정적 이다.입니다. 여러 가지 병 적인 조건 변경의 기능 및 생존, RP 등 AMD.
RP는 RPE 세포 또는 두2,3, 대뇌의 기능에 영향을 주는 상속된 monogenic 돌연변이의 그룹입니다. 그것은 특히 RPE에 영향을 주는 돌연변이 세포 RP2의 5 %는 추정. AMD는 다른 조건이 RPE 레이어 변경 최고의 궁극적으로 중앙 시각 손실. AMD은 유전과 환경 요인의 복잡 한 상호 작용에 의해 발생 하 고 노인4,,56에 영향을 줍니다. 계획에 따르면 AMD 20207에 의해 전세계 196 백만 환자에 대 한 우려 됩니다. 이러한 장애에 대 한 효과적인 치료법 존재 하 고 제안 하는 전략 중 하나 죽은/작동 하지 않는 기존 RPE 세포8
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프로토콜
이 프로토콜에 사용 되는 모든 인간의 재료 유럽 연합 규정에 따라 사용 되었다. 이 연구에 사용 된 인간의 ES 세포 라인 독특한 배아에서 파생 되었다. 부부는 배아를 기증 했다 완벽 하 게 통보 했다 고 익명 기부에 대 한 그들의 동의 주었다. 임상 등급 인간 ES 세포 라인이이 배아에서 파생 된, 틀, 자격, 되었고 제대로 문서화로 슬 린 셀 (영국)에 의해. 햄 (APHP, Hôpital 세인트루이스) 병원 지침에 따르면 태 반 기증에 대 한 동의 서명 하는 어머니에 제왕 절 동안 무 균 조건 하에서 조달 했다.
1입니다. 문화 미디어 및 시 약의 준비
-
RPE 세포 배양 매체의 준비
- RPE 세포 배양 매체를 준비 하려면 추가 4% 혈 청 대체 (20 mL 500 mL의 최종 볼륨에 대 한), 희석 1000 x 2-mercaptoethanol (500 mL의 최종 볼륨에 대 한 500 µ L), 및 1 %Eagle′s 최소 필수 매체 (MEM) 비 본질적인 아미노산 솔루션 (최종 5 mL 500 mL의 볼륨)를 수정된이 글 Dulbecco의 매체 (DMEM) 높은 포도 당 (475 mL 500 mL의 최종 볼륨에 대 한).
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결과
햄은 RPE 세포의 뿌리기 전에 제거 되어야 한다 상피 층 포함. 막의 효소 치료는 떨고 아래 thermolysin와 함께 수행 됩니다. 순서 대로 하지 아니 막 (상피는 1 개의 측에)의 극성을 잃고, 그것은 어떤 구성 (그림 1A) 공급자에 따라 다를 수는 지원에 고정. 이 단계에서 그것의 지원에 막의 접착을 확인 하 고 필요한 경우 클립을 추가. 문화 삽입에 고정 시 막에 있는 구멍을 만드는 피하기 위해 신중 하 게 작업 하 고 (그림 1B)을 향하도록 하는 지하실 멤브레인와 함께 그것의 극성을 유지 합니다. 세포는 세포 막에 씨를 뿌리고, 그들은 이러한 구멍에서 탈출 수 그리고 마지막 셀 농도 감소 될 것 이다. 구멍의 존재는 현미경 또는 문화 삽입 내부 PBS를 추가 PBS 누수 되는 경우를 확인 하 여 구상 될 수 있습니다. 어떤 막 구멍을 폐기 해야한다.......
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토론
우리는 생물 학적 비 계 및 동물 모델에 이식에 대 한 준비에 RPE 세포의 문화에 대 한 메서드를 설명합니다. 프로토콜의 중요 한 단계 중 하나는 젤라틴으로 포함 될 때까지 절차를 따라 햄의 방향의 정비 이다. 실제로, 막의 네이티브 상피 제거 되 고 그것의 지하실 막 노출된9된다. RPE 세포 지하실 막이 위에 씨앗을 품고 있다. 젤라틴을 포함 하기 위한 준비, 시 정의 된 온도에서 모든 제품을 사용 하는 중요 한 됩니다. 실제로, 젤라틴은 4 ° C와 바디 온도 (37 ° C)9에서 액체에서 단단한 수 속성이 있습니다. 온도 존경 하지, 젤라틴 응고 수 있다 또는이 효과 적절 하지 단계에서 액 화.
몇 가지 생물 학적 건설 기계 제안 되었습니다, 멧의 막25 또는 햄26처럼. 특히, 햄, 제왕 절 개
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공개 사항
올리비에 Goureau 중인 인간 만능 줄기 세포에서 망막 세포의 생성에 관련 된 특허에 발명자 이다. 다른 저자는 공개 없다.
감사의 글
저자는 여기 설명 하는 방법 설정 하는 동안 그들의 입력에 대 한 제롬 Larghero와 발레리 Vanneaux (Hôpital 세인트 루이스, 파리, 프랑스)에 감사 하 고 싶습니다.
이 작품은 ANR에서 교부 금에 의해 지원 되었다 [GPiPS: ANR-2010-RFCS005; SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02], Fondation 부 라 검색 Médicale [바이오 공학 프로그램-DBS20140930777] LABEX 부활 [ANR-10-LABX-73] 올리비에 Goureau와 크리스텔 Monville에서. 그것은 NeurATRIS는 변환 연구 인프라 (Investissements d'Avenir) 신경 과학 [ANR-11-INBS-0011] 및 INGESTEM, 국가 인프라 (Investissements d'Avenir)에 biotherapies에 대 한 만능 기술에 의해 지원 되었다 고 차별화 된 줄기 세포 [ANR-11-INBS-000] 크리스텔 Monville에. 카림 벤 M'Barek DIM Stempole 및 LABEX 부활 [ANR-10-LABX-73] 장학금에 의해 지원 되었다. 줄기 협회 프랑세즈 contre 레 Myopathies (AFM)에서 지 원하는 희귀 질환에 대 한 Biotherapie....
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 멸균 생물안전 캐비닛 | TechGen International | 해당 | |
| 없음 흡인을 위한 액체 폐기물 처리 시스템 | Vacuubrand | BVC 21 | |
| CO2-제어 +37 &데그; C 세포 인큐베이터 | Thermo Electron Corporation | BVC 21 NT | |
| 200 &마이크로; L 피펫: P200 | Gilson | F144565 | |
| 1 mL 피펫: P1000 | Gilson | F144566 | |
| 피펫 에이드 | Drummond | 75001 | |
| +4 &데그; C 냉장고 | Liebherr | 해당 없음 | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Fine scissors | WPI | 501758 | |
| Forceps (x2) | WPI | 555227F | |
| 수조 | Grant subaqua pro | SUB6 | |
| 정밀 밸런스 | Sartorius | CP225D | |
| 원심분리기 | Eppendorff | 5804 | |
| 현미경 | Olympus | SC30 | |
| 수평 흔들기 | 쉐이커 IKA-WERKE | IKA MTS 214D | |
| Vortex | VWR | Lab Danger S40 | |
| 일회용 메스 | WPI | 500351 | |
| 플라스틱 파라핀 필름 | VWR | PM992 | |
| 0.200 &마이크로; m 일회용 주사기 필터 | SARTORIUS | 16532 | |
| 주사기(바늘 제외) 50mL | Dutscher | 50012 | |
| 병 250mL | Dutscher | 28024 | |
| 15mL 멸균 Falcon 튜브 | Dutscher | 352097 | |
| 50mL 멸균 Falcon 튜브 | Dutscher | 352098 | |
| 배양 인서트 | Scaffdex | C00001N | |
| 60 mm 세포 배양 disches: B6 | Dutscher | 353004 | |
| 12 웰 세포 배양 플레이트 | Corning | 3512 | |
| 6-웰 배양 플레이트 | Corning | 3506 | |
| 면도날 | Ted Pella, Inc | 121-9 | |
| 시아노아크릴레이트 접착제 | Castorama 3178040670105 | ||
| PBS 1x (500 mL) | Sigma | D8537 | |
| Thermolysine | Roche | 5339880001 | |
| DMEM, 고포도당, GlutaMAX | Invitrogen | 61965-026 | |
| KSR CTS (KnockOut SR XenoFree CTS) | Invitrogen | 12618-013 | |
| MEM-NEAA (100x) | Invitrogen | 11140-035 | |
| b-mercaptoethanol (50 mM) | Invitrogen | 31350-010 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| CO2-independent medium | GIBCO | 18045-054 | |
| Gelatin | MERCK | 104078 | |
| human amniotic membrane | Tissue bank St Louis hospital (Paris, France) | 적용되지 않음 |
참고문헌
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368 (9549), 1795-1809 (2006).
- Daiger, S. P., Sullivan, L. S., Bowne, S. J.
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재인쇄 및 허가
