방법 논문

인간 배아 줄기 세포에서 파생 된 이식 적합 한 망막 색소 상피 조직 공학

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DOI:

10.3791/58216

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2018년 9월 6일

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1U861, I-Stem, Association Française contre les Myopathies (AFM), Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), 2U861, I-Stem, Association Française contre les Myopathies (AFM), Université Evry Val-d'Essonne (UEVE), 3I-Stem, Association Française contre les Myopathies (AFM), Centre pour L’Etude des Cellules Souches (CECS), 4Banque de tissus humain, Hôpital Saint Louis, Assistance Publique - Hôpitaux de Paris (AP-HP), 5Sorbonne Université, INSERM, CNRS, Institut de la Vision, F-75012

이 논문에서

요약

망막 조직을 인간의 양수 막과 동물 모델에 이식의 준비 위에 경작 인간의 pluripotent 줄기 세포에서 파생 된 망막 색소 상피 세포의 구성 하는 방법을 설명 합니다.

초록

눈의 여러 가지 병 적인 조건에는 기능 또는 망막 안료 상피 (RPE)의 생존에 영향을. 이러한 망막 화 (RP) 및 연령 관련 황 반 변성 (AMD)의 일부 형태를 포함합니다. 세포 치료는 이미 인 간에 있는 예비 결과 격려와 함께 이러한 질병을 치료를 제안 하는 가장 유망한 치료 전략 중 하나 이다. 그러나,는 이식의 준비의 방법의 기능적 결과 비보에 상당한 영향을 있다. 실제로, 세포 현 탁 액으로 투입 하는 RPE 세포는 망막 조직으로 이식 하는 같은 셀 보다 덜 기능적 이다. 여기, 우리 엔지니어 RPE 조직과 vivo에서 이식에 대 한 준비를 간단 하 고 재현 가능한 방법을 설명합니다. 인간의 pluripotent 줄기 세포에서 파생 된 RPE 세포 생물학 지원, 인간의 양수 막 (햄)에 시드 있습니다. 인공 건설 기계에 비해,이 지원 Bruch의 막 생 RPE 세포 연결 된 가까운 지하실 막의 이점이 있다. 그러나, 그것의 조작 쉽지 않다, 그리고 우리가 그것의 적절 한 경작에 대 한 몇 가지 전략 및 준비에 비보를 접목 개발.

서론

RPE 생존 및 대뇌는 그것은 밀접 하 게 관련 된1의 항상성 위해 결정적 이다.입니다. 여러 가지 병 적인 조건 변경의 기능 및 생존, RP 등 AMD.

RP는 RPE 세포 또는 두2,3, 대뇌의 기능에 영향을 주는 상속된 monogenic 돌연변이의 그룹입니다. 그것은 특히 RPE에 영향을 주는 돌연변이 세포 RP2의 5 %는 추정. AMD는 다른 조건이 RPE 레이어 변경 최고의 궁극적으로 중앙 시각 손실. AMD은 유전과 환경 요인의 복잡 한 상호 작용에 의해 발생 하 고 노인4,,56에 영향을 줍니다. 계획에 따르면 AMD 20207에 의해 전세계 196 백만 환자에 대 한 우려 됩니다. 이러한 장애에 대 한 효과적인 치료법 존재 하 고 제안 하는 전략 중 하나 죽은/작동 하지 않는 기존 RPE 세포8에 대 한 보상 하기 위해 새로운 RPE 세포의 이식입니다.

투입 될 최종 제품의 배합의 모드 기능 최고의 결과 보장 하기 위해 필수적 이다. 그들의 생존, 통합 및 기능9,10,,1112 에 관한 우려를 제기 하는 RPE 세포로는 셀 서 스 펜 션, 배달, 쉽고 간단 방법 임에도 불구 하 고 주입 , 13. 과학자는 지금 개발 하 고 더 복잡 한 공식 제공 설계 망막 조직9,13,14,,1516. 이러한 맥락에서 우리는 체 외에서 RPE 조직 이식9에 사용할 수 있는 생성 하는 원래 방법 개발.

인간 미 발달 줄기 (ES) 세포에서 파생 된 RPE 세포 은행이이 프로토콜에 사용 됩니다. 그러나, 대안 RPE 세포 은행 (인간 유도 만능 줄기 세포, 기본 RPE 세포, 등) 다른 셀 소스에서 다른 방법으로 분화 하 고이 프로토콜에 대 한 적절 한 있습니다. 그것은 포함 하는 감독된 차별화 cytokines 그리고/또한 작은 분자17,18,19,20,,2122를 사용 하 여 프로토콜.

이식 하는 비 계에 설계 조직을 준비 한다. 지난 몇 년 동안, 다른 건설 기계는 폴리머 또는 생물 기원13,,2324의 매트릭스에 기반으로 개발 되었다. 여기, 생물 학적 기판 사용 햄, 하지만 denuded Bruch 막 같은 다른 기판에 구현 될 수 있습니다. 여기에 설명 된 메서드는 RPE 네이티브 환경에 더 관련 된 생물 비 계를 사용 하 여 이점이 있습니다.

인간의 ES 세포 유래 RPE 세포 완전히 조약돌 단층으로 구성 하기 위해서는 적어도 4 주 동안 교양. 그 단계에서 얻은 상피 기능적 이며9편광. 마지막으로,이 조직 쉽게 주름로 그것을 한번 더 강성과 탄성 주입 절차 동안 그것을 보호 하기 위해 하이드로 겔 캐리어의 얇은 층에 포함 됩니다. 이 제품은 다음 접목까지 4 ° C에 저장 됩니다.

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프로토콜

이 프로토콜에 사용 되는 모든 인간의 재료 유럽 연합 규정에 따라 사용 되었다. 이 연구에 사용 된 인간의 ES 세포 라인 독특한 배아에서 파생 되었다. 부부는 배아를 기증 했다 완벽 하 게 통보 했다 고 익명 기부에 대 한 그들의 동의 주었다. 임상 등급 인간 ES 세포 라인이이 배아에서 파생 된, 틀, 자격, 되었고 제대로 문서화로 슬 린 셀 (영국)에 의해. 햄 (APHP, Hôpital 세인트루이스) 병원 지침에 따르면 태 반 기증에 대 한 동의 서명 하는 어머니에 제왕 절 동안 무 균 조건 하에서 조달 했다.

1입니다. 문화 미디어 및 시 약의 준비

  1. RPE 세포 배양 매체의 준비
    1. RPE 세포 배양 매체를 준비 하려면 추가 4% 혈 청 대체 (20 mL 500 mL의 최종 볼륨에 대 한), 희석 1000 x 2-mercaptoethanol (500 mL의 최종 볼륨에 대 한 500 µ L), 및 1 %Eagle′s 최소 필수 매체 (MEM) 비 본질적인 아미노산 솔루션 (최종 5 mL 500 mL의 볼륨)를 수정된이 글 Dulbecco의 매체 (DMEM) 높은 포도 당 (475 mL 500 mL의 최종 볼륨에 대 한).
  2. 전송/보존 매체의 준비
    1. 전송/보존 매체를 준비 하려면 CO2페니실린-스 (5 mL 500 mL의 최종 볼륨에 대 한)의 1%를 추가-독립 매체 (495 mL 500 mL의 최종 볼륨에 대 한) 4 ° c.에 그것을 유지 하 고
  3. 물의 Resuspension thermolysin 효소의
    1. Thermolysin의 재고 솔루션의 준비
      1. Thermolysin의 재고 솔루션을 준비, 실내 온도-20 ° C에 저장 된 thermolysin 분말을 녹여.
      2. 효소 활동 변수 배치에서 배치 될 수 있습니다, 사용할 수 일괄 처리의 thermolysin 가루와 함께 제공 된 분석의 인증서에 따라이 작업을 계산 합니다. 분할은 "활동 중립 Protease 계산 = ANPC" (분석의 인증서에 표시 된) 181 (이 티로신의 분자량)에 의해. 결과 얻은 제공 된 thermolysin 분말 (U/유리병)의 총 효소 활동에 해당 합니다.
      3. 총 효소 활동 (U/유리병) 200 (U/mL)로 나눈 값에 해당 하는 물의 볼륨을 추가 하 여 200 U/mL에서 재고 솔루션을 준비 합니다.
      4. 위쪽 및 아래쪽에 추가 된 물 pipetting으로 효소를 분해. 소용돌이 30 s 및 확인에 대 한 솔루션 여부 분말 완전히 일시 중지 되었습니다. 더 많은 pipetting 전체 해산에 대 한 필요할 수 있습니다.
      5. 약 수 재고 솔루션-20 ° c.에 그것을 저장 하 고
    2. Thermolysin의 작업 솔루션의 준비
      참고: thermolysin 솔루션 햄 치료 당일에 준비 되어야 한다.
      1. 해 동 thermolysin-20 ° c.에 저장 된 200 U/mL에서의 주식 aliquots 1 U/mL의 마지막 효소 활동을 얻기 위하여 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)에 재고 솔루션 200 x 희석. 1-4 햄 패치 치료 40 mL를 준비 합니다.
      2. Thermolysin 솔루션을 사용 하 여 0.2 µ m 필터 사전 통해 필터링.
  4. 젤라틴의 물의 Resuspension
    1. 20% 젤라틴 솔루션 및 블록의 준비
      참고: 20% 젤라틴 솔루션 및 블록 수 있습니다 준비까지 사용 하기 전에 1 주.
      1. CO2를 따뜻한-42 ° c (최대 1 h) 30 분 물 욕조에 독립 매체. 50 mL 튜브에 추가의 40 mL에 젤라틴의 10 g CO2예 열-독립 매체 및 소용돌이 솔루션.
      2. 42 ° c.에 30-60 분 젤라틴 해산 소용돌이 균질 솔루션을 각 10 분.
      3. 일단 해결책은 균질, 4 6 cm 문화 요리 20% 젤라틴 솔루션의 4 mL를 추가 합니다. 거품을 하지 마십시오. 요리를 보호 하기 위해 플라스틱 파라핀 영화를 추가 하 고 4 ° c.에 강화 하기 위해 솔루션을 수
    2. 8% 젤라틴 용액의 준비
      참고: 8% 젤라틴 솔루션 사용 하기 전에 날 준비 그리고 4 ° c.에 저장
      1. CO2를 따뜻한-42 ° C (최대 1 h) 30 분 동안에 독립 매체. 50 mL 튜브에 추가의 46 ml 젤라틴 4 g CO2예 열-독립 매체 및 소용돌이 솔루션.
      2. 42 ° c.에 30-60 분 젤라틴 해산 플라스틱 파라핀 영화 튜브를 보호 하 고 계속 물 욕조에 37 ° C에서 같은 날 사용 하는 경우를 추가 하거나 나중에 사용 하는 경우 4 ° C에서 그것을 저장 합니다.

2. Thermolysin 치료 인간 양수 막의

  1. 인간의 양수 막 세척
    1. 햄 작은 조각 (약 30 x 30 mm) PBS에 4 ° C에서 이미 나일론 비 계에 고정 또는 고정으로 제공 했습니다. 제공 하는 경우 30 분 동안 인큐베이터에서 37 ° C에서 막 해 동 냉동.
    2. 세포 막 세척:
      1. PBS의 80 mL를 포함 하는 250 mL 병에서 1-4 막 장소. 많은 병을 사용 하 여 필요에 따라.
      2. 5 분 동안 고속에 판 통에 각 병을 흔들어 다음 PBS를 삭제 합니다. PBS와 반복의 80 mL를 추가 합니다.
  2. Thermolysin 치료
    1. 포함 하는 막 병 당 thermolysin (1 U/mL)의 작업 솔루션의 40 mL를 추가 (1-4 막 병; 당 한 번에 최대 3 병).
    2. 450 rpm 그리고 소용돌이에 5 분 동안 병을 흔들어 30 그들 s. 1 x 반복.
    3. Thermolysin 솔루션을 삭제 하 고 PBS의 80 mL를 추가 합니다.
    4. 450 rpm에서 5 분 동안 병을 흔들어. PBS를 삭제 하 고 PBS의 80 mL를 추가 합니다. 3 배를 반복 합니다.

3. 문화 삽입에 인간의 양수 막의 고정

  1. 햄 하나, 하나를 제거 하 긴 살 균 겸 자 (그는 병의 바닥을 도달할 수 있다)를 사용 하 고 각 햄 PBS의 10 mL를 포함 하는 10 cm 문화 접시에 전송.
  2. 10 mL PBS의 포함 된 새로운 10 cm 문화 접시, 아래로 나일론 막의 한을 놓습니다. 2 나일론에 멤브레인을 해결 하는 데 사용 되는 4 개의 클립을 분리 합니다.
  3. 나일론 및 막 사이 문화 삽입의 작은 링을 삽입 합니다.
  4. 막 작은 반지를 완전히 덮는 다는 것을 확인 하십시오. 막 위에 문화 삽입의 두 번째 부분을 클립. 햄의 지하실 막 문화 삽입 내부 직면 하고있다. 마지막 두 클립을 분리 합니다.
  5. 잘라, 멸 균가 위로, 문화 삽입 필요한 경우 외부 막의 초과. 12-잘 접시에 문화 삽입에서 고정 막 전송 집게를 사용 하 여 PBS를 더하고 37 ° C, 5% CO2인큐베이터에 접시를 저장.
  6. 다른 멤브레인과 (3.2 3.5 단계)에서 이러한 작업을 반복 합니다.

4. 해빙 및 인간 양수 내 세포 막에 망막 안료 상피 세포의 시드

  1. 망막 색소 상피 세포의 해빙
    1. RPE 세포 은행 극저온 유리병 당 1 백만 세포에서 액체 질소에서 고정입니다. 필요에 따라 많은 극저온 튜브를 녹여 (350000 세포 막 당 시드 있습니다).
    2. 극저온 유리병 당 RPE 매체의 3 mL를 포함 하는 15 mL 튜브를 준비 합니다. 일단 병 동 각 튜브를 셀을 전송 합니다. 다른 튜브에 대 한이 작업을 반복 합니다.
    3. 균질 (위쪽 및 아래쪽을 몇 번을 플라스틱 resuspend RPE 중간에 셀) 셀 솔루션의 10 µ L과 1.5 mL 튜브에 그것을 전송. Trypan 블루의 10 µ L를 추가 합니다. 세 실에서이 솔루션의 장소 15 µ L 다음 가능한 셀 (파란색에서 색 하지) 4 X 목표 현미경의 수를 계산 합니다. 다른 튜브에 대 한이 작업을 반복 합니다.
    4. 한편, 원심에서 110 x g 5 분 삭제에 대 한 15 mL 튜브는 상쾌한 고 700000 셀/mL에서 셀 resuspend.
  2. 인간 양 막 세포 막으로 망막 색소 상피 세포의 시드
    1. 포함 하는 인큐베이터에서 막 12 잘 플레이트를 제거 합니다.
    2. PBS 발음 준비 단계 4.1.4 문화 삽입의 센터에에서 세포 현 탁 액의 500 µ L를 추가 합니다. (잘) 내 문화 삽입 외부 RPE 매체의 1 mL를 추가 합니다. 다른 막에 대 한 반복 합니다.
    3. 포함 하는 인큐베이터에서 막 12-잘 접시를 놓습니다.

5. 인간의 양수 내 세포 막에 망막 안료 상피 세포 배양의 유지 보수

  1. 중간 2 갱신 월요일과 금요일 때까지 적어도에 보통 주당 x 문화권의 일 30.
  2. 각 잘 문화 삽입 내외 매체를 발음 하 고 신선한 매체 (문화 삽입 외부 1 mL 및 내부 500 µ L)으로 갱신. 37 ° C, 5% CO2배양 기에서 접시를 놓습니다.

6. 망막 안료 상피 패치 이식에 대 한 준비

참고: 하루 30 문화에서 시작, 조직이 식을 위한 준비 이다.

  1. 따뜻한 물 목욕 30 분 동안 37 ° C에서 8% 젤라틴 솔루션 작성 찬 CO2와 vibratome의 내부 챔버-독립 매체 (4 ° C)에서.
  2. 장소는 vibratome로 20% 젤라틴 블록.
    1. 냉장고에서 20% 젤라틴의 블록을 포함 하는 6 cm 문화 접시를 가져가 라. 메스를 사용 하 여, 5 cm x 5 cm 블록을 잘라. Cyanoacrylate 접착제 또는 해당 지원 블록의 상단 측면을 붙여 넣습니다.
    2. 장소는 vibratome에 새로운 블레이드입니다.
    3. 면도날의 동일한 수준에 올 때까지 블록의 레벨을 조정 합니다.
    4. 신선한 CO2지원 주위 목욕을 채우기-4 ° c.에 독립 매체 Vibratome 블록 균일 하 게 잘라 때까지 중간 속도 사용 하 여, 매끄러운 표면에 지도 함께 블록을 잘라. 0 위치를 설정 합니다.
    5. 그것은 완전히 건조 될 때까지 젤라틴의 블록 주위 매체 발음 그리고 포함 하는 37 ° c.에 인큐베이터에서 조직 12 잘 문화 접시
    6. 집게를 사용 하 여 신중 하 게 젤라틴 블록 위에 문화 삽입을 엽니다. 커트가 위, 막 (세포 배양 하지 했다 반지) 외부 세포를 포함 하지 않는의 모든 부분. 전체 잔여 중간 발음
    7. 멤브레인을 커버 하기 위해 37 ° C에 액체 8% 젤라틴 용액 1 mL를 추가 합니다. 초과 조심 스럽게 제거. 응고에 젤라틴을 허용 하도록 5-8 분을 기다립니다.
    8. 신선한 CO2추가-막 덮여 때까지 목욕 (4 ° C)에서 독립 매체.
    9. 절단, 블록 동작 하는 방법을 알고 남은 중간 속도-100 µ m의 위치에 vibratome와 함께. 섹션의 끝에, 조직의 방향을 유지 하기 위해 주의 해야 합니다.
    10. 메스, 잘라 섹션의 방향을 식별 하는 코너.
    11. 주걱으로 젤라틴에 포함 된 멤브레인을 수집 하 고 받는 사람 눈으로 접목까지 4 ° C에서 보존 매체 가득 6 잘 플레이트에 배치.
    12. 이식 시 수술 현미경 (쥐에 대 한 1-3, 비 인간 영장류에 대 한 10-15 m m2 ) 받는 사람 눈의 크기에 임 플 란 트의 크기를 조정 합니다.

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결과

햄은 RPE 세포의 뿌리기 전에 제거 되어야 한다 상피 층 포함. 막의 효소 치료는 떨고 아래 thermolysin와 함께 수행 됩니다. 순서 대로 하지 아니 막 (상피는 1 개의 측에)의 극성을 잃고, 그것은 어떤 구성 (그림 1A) 공급자에 따라 다를 수는 지원에 고정. 이 단계에서 그것의 지원에 막의 접착을 확인 하 고 필요한 경우 클립을 추가. 문화 삽입에 고정 시 막에 있는 구멍을 만드는 피하기 위해 신중 하 게 작업 하 고 (그림 1B)을 향하도록 하는 지하실 멤브레인와 함께 그것의 극성을 유지 합니다. 세포는 세포 막에 씨를 뿌리고, 그들은 이러한 구멍에서 탈출 수 그리고 마지막 셀 농도 감소 될 것 이다. 구멍의 존재는 현미경 또는 문화 삽입 내부 PBS를 추가 PBS 누수 되는 경우를 확인 하 여 구상 될 수 있습니다. 어떤 막 구멍을 폐기 해야한다...

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토론

우리는 생물 학적 비 계 및 동물 모델에 이식에 대 한 준비에 RPE 세포의 문화에 대 한 메서드를 설명합니다. 프로토콜의 중요 한 단계 중 하나는 젤라틴으로 포함 될 때까지 절차를 따라 햄의 방향의 정비 이다. 실제로, 막의 네이티브 상피 제거 되 고 그것의 지하실 막 노출된9된다. RPE 세포 지하실 막이 위에 씨앗을 품고 있다. 젤라틴을 포함 하기 위한 준비, 시 정의 된 온도에서 모든 제품을 사용 하는 중요 한 됩니다. 실제로, 젤라틴은 4 ° C와 바디 온도 (37 ° C)9에서 액체에서 단단한 수 속성이 있습니다. 온도 존경 하지, 젤라틴 응고 수 있다 또는이 효과 적절 하지 단계에서 액 화.

몇 가지 생물 학적 건설 기계 제안 되었습니다, 멧의 막25 또는 햄26처럼. 특히, 햄, 제왕 절 개

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공개 사항

올리비에 Goureau 중인 인간 만능 줄기 세포에서 망막 세포의 생성에 관련 된 특허에 발명자 이다. 다른 저자는 공개 없다.

감사의 글

저자는 여기 설명 하는 방법 설정 하는 동안 그들의 입력에 대 한 제롬 Larghero와 발레리 Vanneaux (Hôpital 세인트 루이스, 파리, 프랑스)에 감사 하 고 싶습니다.

이 작품은 ANR에서 교부 금에 의해 지원 되었다 [GPiPS: ANR-2010-RFCS005; SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02], Fondation 부 라 검색 Médicale [바이오 공학 프로그램-DBS20140930777] LABEX 부활 [ANR-10-LABX-73] 올리비에 Goureau와 크리스텔 Monville에서. 그것은 NeurATRIS는 변환 연구 인프라 (Investissements d'Avenir) 신경 과학 [ANR-11-INBS-0011] 및 INGESTEM, 국가 인프라 (Investissements d'Avenir)에 biotherapies에 대 한 만능 기술에 의해 지원 되었다 고 차별화 된 줄기 세포 [ANR-11-INBS-000] 크리스텔 Monville에. 카림 벤 M'Barek DIM Stempole 및 LABEX 부활 [ANR-10-LABX-73] 장학금에 의해 지원 되었다. 줄기 협회 프랑세즈 contre 레 Myopathies (AFM)에서 지 원하는 희귀 질환에 대 한 Biotherapies 연구소의 일부입니다-Téléthon.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
멸균 생물안전 캐비닛TechGen International해당
없음 흡인을 위한 액체 폐기물 처리 시스템VacuubrandBVC 21
CO2-제어 +37  &데그; C 세포 인큐베이터Thermo Electron CorporationBVC 21 NT
200  &마이크로; L 피펫: P200GilsonF144565
1  mL 피펫: P1000GilsonF144566
피펫 에이드Drummond75001
+4  &데그; C 냉장고Liebherr해당 없음
VibratomeLeicaVT1000S
Fine scissorsWPI501758
Forceps (x2)WPI555227F
수조Grant subaqua proSUB6
정밀 밸런스SartoriusCP225D
원심분리기Eppendorff5804
현미경OlympusSC30
수평 흔들기쉐이커 IKA-WERKEIKA MTS 214D
VortexVWRLab Danger S40
일회용 메스WPI500351
플라스틱 파라핀 필름VWRPM992
0.200 &마이크로; m 일회용 주사기 필터SARTORIUS16532
주사기(바늘 제외) 50mLDutscher50012
병 250mLDutscher28024
15mL 멸균 Falcon 튜브Dutscher352097
50mL 멸균 Falcon 튜브Dutscher352098
배양 인서트ScaffdexC00001N
60  mm 세포 배양 disches: B6Dutscher353004
12 웰 세포 배양 플레이트Corning3512
6-웰 배양 플레이트Corning3506
면도날Ted Pella, Inc121-9
시아노아크릴레이트 접착제Castorama 3178040670105
PBS 1x (500  mL)SigmaD8537
ThermolysineRoche5339880001
DMEM, 고포도당, GlutaMAXInvitrogen61965-026
KSR CTS (KnockOut SR XenoFree CTS)Invitrogen12618-013
MEM-NEAA (100x)Invitrogen11140-035
b-mercaptoethanol (50  mM)Invitrogen31350-010
Penicillin/StreptomycinInvitrogen15140122
CO2-independent mediumGIBCO18045-054
GelatinMERCK104078
human amniotic membraneTissue bank St Louis hospital (Paris, France)적용되지 않음

참고문헌

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