방법 논문

Cas9 Ribonucleoproteins를 사용 하 여 노크 아웃 기본 및 확장 된 인간 NK 세포의 생성

DOI:

10.3791/58237

⸱

2018년 6월 14일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Childhood Cancer and Blood Disease, Nationwide Children's Hospital, 2Nuffield Division of Clinical Laboratory Sciences, Radcliffe Department of Medicine, University of Oxford, 3Center for Clinical and Translational Research, Nationwide Children's Hospital Research Institute

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기, 선물이 유전자 Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs)를 사용 하 여 기본 또는 확장 된 인간의 자연 킬러 (NK) 세포를 수정 하는 프로토콜. 이 프로토콜을 사용 하 여 인간 NK 세포 성장 인자-b 수용 체 2를 변형 (TGFBR2) 및 hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1)에 대 한 결핍을 생성 했습니다.

초록

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CRISPR/Cas9 기술 많은 세포 유형, 하지만 지금까지 유전자 배달에 게놈 엔지니어링 가속 되 고 안정적인 유전자 수정 기본 NK 세포에 도전 되었습니다. 예를 들어 transgene 배달 lentiviral 또는 retroviral 변환을 사용 하 여 실질적인 절차 관련 된 NK 세포 apoptosis 때문 NK 세포 유전자 조작의 제한 된 수율 결과. 여기 Cas9 ribonucleoprotein 복합물 (Cas9/RNPs)를 사용 하 여 인간의 기본 및 확장 된 NK 세포의 게놈 편집용 DNA 무료 방법을 설명 합니다. 이 메서드는 TGFBR2 와 의 효율적인 녹아웃 NK 세포에 HPRT1 유전자 허용. RT-PCR 데이터 유전자 식 수준에 중요 한 감소 그리고 대표적인 셀 제품의 세포 독성 분석 실험 제안 RNP 수정 NK 세포 TGFβ에 덜 민감한 되었다. 유전자 변형된 세포 조사 mbIL21 표현 된 자극에 의해 확장 된 게시물 electroporation 수 지류 세포.

서론

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암 immunotherapy 최근 몇 년 동안에서 고급 되었습니다. 유전자 변형 공상 항 원 수용 체 (자동차) T 세포는 암 immunotherapy에 성공적으로 배포 하는 설계 된 면역 세포의 훌륭한 예입니다. 이 셀 최근에 대 한 처리를 위한 FDA에 의해 승인 되었다 CD19 + B 세포 악성 종양, 하지만 성공 지금까지 몇 대상 항, 베어링 질병에 국한 되었으며 같은 제한 된 항 원 레파토리를 대상으로 하는 것은 면역 탈출 하 여 실패 하는 경향이. 또한, 자동차 T 세포 이식-비교-호스트 질병 수용자 T 세포에 의해 발생의 헌 T 세포의 사용에 집중 되었습니다 했다. 반면, NK 세포는 종양 표적 항 원 독립적인 방식으로 죽 일 수 있으며 GvHD, 그들에 게 암 immunotherapy6,7,,89에 대 한 좋은 후보를 발생 하지 않습니다.

CRISPR/Cas9 기술 최근 엔지니어링 면역 세포에서 사용 되었습니다 하지만 NK 세포는 플라스 미드 유전자 재프로그래밍 항상 도전 하고있다. 이것은 lentiviral 및 retroviral 변환 상당한 절차 관련 된 NK 세포 apoptosis와 유전자 조작된 NK 세포4 의 제한 된 생산 유발 등 DNA 의존 방식에서 transgene 배달에 어려움으로 인해 되었습니다. , 9.

많은 타고 난 면역 세포 표현 병원 체 관련 된 분자 패턴에 대 한 수용 체의 상부와 같은 Retinoic 산을 유도할 수 있는 유전자 나 (장비-난), 어떤 외국 DNA의 과장 된 인식의 사용. 유전 수정10DNA 기반 방법을 사용 하 여 때 이러한 통로의 억제 NK 세포에 더 높은 변환 효율을 수 있게 되었습니다.

여기는 DNA 무료 게놈의 편집 기본 및 확장 된 인간 NK 세포 Cas9 ribonucleoprotein 복합물 (Cas9/RNPs)를 활용 하 여 사용 하기 위한 방법을 설명 합니다. Cas9/RNPs는 세 가지 구성 요소, 재조합 Cas9 단백질에 complexed 합성 단일 가이드 RNA complexed crRNA와 tracerRNA의 구성으로 이루어져 있습니다. 이러한 Cas9/RNPs 기능 복합물으로 그들의 배달으로 인해 외국 DNA 종속 접근 높은 효율으로 게놈 목표를 고착 할 수 있다. 또한, Cas9/RNPs 세포에서의 신속한 통관 apoptosis 유도 등 대상 오프 효과 줄일 수 있습니다. 따라서, 그들은 노크-아웃, 또는 동종 재결합6,7에 대 한 DNA와 결합 될 때 노크 기능 생성을 사용할 수 있습니다. 우리는 Cas9/RNPs의 그 electroporation 보였다 NK 세포에서 유전자 조작의 이전 제약을 극복 하는 간단 하 고 비교적 효율적인 방법입니다.

TGFβ는 활성화 및 NK 세포의 기능을 억제 하는 주요 면역 억제 사이토카인 이다. 그것은 TGFβ 통로 대상으로 면역 세포 기능을 높일 수 있습니다 제안 되었습니다. 우리 TGBR2 ectodomain TGFβ11. 을 바인딩하는 인코딩 지역 대상 대표 결과이 유전자의 mRNA 발현의 수준에 상당한 감소를 표시 하 고 추가 수정 된 NK 세포가 TGFβ에 저항력이 될 입증. 또한, 수정 된 셀 유지 생존 및 증식 잠재력, 그들은 확장 된 게시물 electroporation에 비친된 피더 세포. 을 사용 하 여 될 수 있다 따라서, 다음 메서드는 유전자에 대 한 NK 세포를 조작 하는 유망한 접근 방식을 추가 임상 또는 연구 목적.

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프로토콜

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건강 한 기증자 버 피 코트에서 중앙 오하이오 지역 미국 적십자 소스 자료로 얻은 했다. 이 연구는 제도적 검토 보드의 전국 어린이 병원으로 면제 연구 될 결정 했다.

1. 인간 NK 세포 정화 및 확장

  1. 버 피 코트12에서 PBMCs를 격리 합니다.
    1. 35 mL Ficoll-Paque의 15 mL에 버 피 코트 샘플의 레이어.
    2. 브레이크 없이 20 분에 대 한 400 x g에서 centrifuge 고 인터페이스에서에서 PBMC를 수집 합니다.
    3. PBS의 적어도 동등한 볼륨을 추가 하 여 복구 된 PBMCs 세 번 씻고, 400 x g에서 5 분간 centrifuging와 PBC 발음 세척. NK 세포 RosettesSep13이 단계에서 격리 된 수 있습니다.
  2. 비친 10 x 106 mbIL21-표현으로 자극 하 여 NK 세포를 확장 급지대 셀 0, 7, 14 일에. 10%를 포함 하는 신선한 RPMI 미디어 바꿉니다 FBS, 1% 글루타민, 1% 페니실린 스, 그리고 100 IU/mL의 일리노이-2 전체 미디어 볼륨 매일.

2. gRNA 디자인 및 선택

  1. 대상, 온라인 도구, 예를 들면, NCBI, 앙상블을 사용 하 여 특정 게놈 loci를 선택 하십시오.
    예를 들어.
    설명: 변형 시키는 성장 인자 beta 수용 체 2 (TGFBRR2) ectodomain
    기록 보기: PF08917
    InterPro 보기: IPR015013
    위치: 49-157 aa
    대상된 시퀀스: 엑손 TGFBR2 유전자 (ENSG00000163513)의 4
  2. 디자인은 gRNAs, http://crispr.mit.edu 등 'Benchling' CRISPR 디자인 웹 도구 사용 하 여
    1. 2.1 단계에서 선택 하는 DNA 순서에 입력 합니다. 대상 게놈으로 인간 (hg 19)를 선택 합니다. CRISPR 가이드 (20 뉴클레오티드 팸 시퀀스 다음: NGG) 앞에서 입력 한 시퀀스에서 검색 됩니다. 그것은 또한 선택 된 게놈을 통해 가능한 오프 대상 일치를 표시합니다.
    2. 최고의 3 gRNAs는 그들의 표적에 및 오프 대상 요금에 따라 가장 높은 점수를 선택 하십시오. 예를 들어 표 1 exon TGFBR2 유전자의 4 CRISPR 디자인 웹 도구에 의해 제안 된 대상으로 설계 된 CRISPR RNAs를 보여준다.
  3. 합성 순서 특정 crRNAs로 CRISPR RNAs를 주문.
  4. 보존, 주문 transactivating RNA (tracrRNA)는 crRNA와 부분 homology를 통해 상호 작용.

3. 디자인 삭제 뇌관을 심사

  1. T7E1 돌연변이 분석 결과 대 한 gRNA 분열 사이트를 확장 하는 뇌관 디자인.
  2. SgRNA 대상 사이트에서 작은 삽입-삭제 (indels) 되도록 예측된 분열 사이트에서 사용 뇌관 최소한 100 bp 돌연변이 분석 결과 따라 1.5 %agarose 젤에 표시 됩니다. 표 2 에서는 TGFBR2 ectodomain를 증폭 하는 데 사용 되는 뇌관을 보여 줍니다.

4. 인간의 기본 및 확장 된 NK 세포의 변환

참고: NK에 Cas9/RNPs 요소의 변환 electroporation 4d 시스템을 사용 하 여 다음과 같이 하면 됩니다.

  1. 셀 준비
    1. 기본 NK 세포에 대 한, 갓 고립 된 NK 세포 RPMI 매체 100 IU/mL 일리노이-2의 앞에 4 일 동안 품 어 하 고 하루 5 electroporation를 수행 합니다. 앞서 고 하루 변환 전에 설명한 대로 매일 미디어를 교체 합니다.
    2. 확장 된 NK 세포에 대 한, 하루 0 1: 1의 비율로 조사 피더 세포에서 세포를 자극 하 고 하루 5 또는 6 또는 7에서 electroporation를 수행 합니다. 앞서 고 하루 변환 전에 설명한 대로 매일 미디어를 교체 합니다.
    3. Electroporation 당일 100 IU/mL electroporation 및 습도 37 ° C, 5% CO2 인큐베이터에서 미리 incubate 플라스 크 셀 일리노이-2 포함 하는 신선한 RPMI의 8 mL 가득 T25 플라스 크를 준비 합니다.
      참고: 해 동된 셀 이나 2차 또는 3rd 자극 받은 셀 수 있다 electroporated 설명 된 대로 복구 후 언제 든 지.
    4. 변환 믹스의 26 µ L에 대 한 조건 당 3-4 × 106 셀을 가져가 라.
      참고: Electroporation 솔루션에서 NK 세포의 매우 높은 농도 변환 속도를 향상 시킵니다.
    5. 3 번 RNase 활동을 일반적으로 포함 된 모든 FBS를 제거 하려면 PBS 가진 세포를 씻어. 8 분 동안 300 x g에서 매번 그들을 회전 합니다.
      참고: 7 electroporation Cas/RNPs에 대 한 단일 gRNA (gRNA1, gRNA2, gRNA3)로 및 2 개의 gRNAs (gRNA1 gRNA2, gRNA1 gRNA3, gRNA2 + + gRNA3)의 조합 및 아무 Cas9/RNPs 한 컨트롤을 고려 하십시오.
  2. crRNA:tracerRNA을 형성 / 복잡 한
    1. 200 μ M의 최종 농도에 테 솔루션 x 1에서 crRNAs (gRNA1, gRNA2, 및 gRNA3) 및 tracerRNA resuspend. 표 3에서 같이 200 μ M tracerRNA와 함께 각 200 μ M gRNA의 혼합 2.2 μ.
    2. 샘플 5 분 동안 95 ° C에가 열 하 고 상 온 (15-25 ° C)를 벤치 위에 시원한 수 있습니다. 스토어 resuspended RNAs 및 crRNA: 나중 사용을 위해-20 ° C에서 tracerRNA/복잡 한.
  3. RNP 복잡 한 형성
    참고:     시간을 절약 하는 세척 동안 복잡 한 RNP 형성 단계 4.1.5.
    1. 단일 crRNA:tracrRNA 이중 반응, 표 4에 있는 예제에서와 같이 36 μ M에 Cas9 endonuclease 희석.
    2. CrRNA:tracrRNA duplexes의 조합 변환, 희석 36 μ M에 Cas9 endonuclease에 예제에서와 같이 표 5.
    3. 피 펫 팁, 30 이상 소용돌이 동안 천천히 Cas9 endonuclease crRNA:tracrRNA 쌍 신 회로 추가 1 분에 s.
    4. 15-20 분 동안 실내 온도에 혼합물을 품 어. 경우 부 화 후 혼합물을 사용 하 여 준비 하지, 사용까지 얼음에 혼합물을 유지.
  4. Electroporation
    1. P3 electroporation 솔루션 전체 보충을 추가 하 고 실내 온도에서 보관.
    2. P3 기본 4 D electroporation 솔루션의 20 μ에 셀 펠 릿 (3-4 × 106 세포 단계 4.1.5)를 resuspend. Pipetting 동안 공기 방울을 피하십시오.
      참고: 셀 P3 솔루션에 오랜 시간 동안 하지 맡겨야 한다.
    3. 즉시 세포 현 탁 액에 RNP 복잡 한 (단계 4.3)의 5 µ L를 추가 합니다.
    4. Cas9/RNPs/셀 100 μ M Cas9 electroporation 증강의 1 μ 믹스를 추가 합니다.
    5. Cas9/RNPs/셀 믹스 20 μ electroporation 스트립으로 전송 합니다.
    6. 부드럽게 샘플 스트립의 하단 커버 되도록 스트립을 누릅니다.
    7. 4 D electroporation 시스템을 시작 하 고 EN-138 프로그램을 선택 합니다.

5. 게시 변환

  1. 셀 스트립에서 3 분간 휴식 하자.
  2. 에 베트를 미리 equilibrated 문화 미디어의 80 µ L을 추가 하 고 부드럽게 플라스 크에 샘플을 전송.
  3. 변환, 후 48 시간 차단 유전자 삭제에 대 한 5 × 105 셀에서 게놈 DNA를 추출 합니다.
  4. Taq DNA 중 합 효소 키트와 함께 3.2 단계에서 설계 된 프라이 머를 사용 하 여 관심사의 유전자를 증폭.
  5. T7EI 소화에 대 한 PCR amplicon heteroduplexes를 형성 하 고 37 ° C에 T7EI 효소와 함께 30-60 분에 대 한 제품을 품 어
    참고: 분석 결과 그것은 빠르고, 단순 하 고 제공으로 심사에 대 한 선호 T7EI 측량 분석 결과 사용 하 여에 비해 전기 영동 결과 청소 합니다. 그러나,이 방법은 삽입 및 삭제를 검색할 수 없습니다 < 비 동종 끝 결합 (NHEJ) 활동 Cas9 RNPs 실험14에 의해 생성 되는 2 기지.
  6. 1.5%에 소화 DNA를 실행 agarose 젤 110 V 30 ~ 45 분, 15 분 마다 시각화 젤.
  7. MbIL21 표현으로 셀의 나머지 부분을 자극 1: 1의 비율로 피더 세포.
  8. 자극 후 5 일 정량 Pcr를 사용 하 여 유전자 식 수준에 대 한 RNA를 추출 합니다.
  9. 이전에 보고 된12calcein 분석 실험을 실시 합니다. 간단히, calcein 오전 (예, 3 µ g/mL/1000000 DAOY 셀 사용)에서 대상 셀을 로드 합니다. IL2에 밤새 껏 휴식 하 여 NK 세포 세포 독성 분석 실험에 대 한 준비 (100 IU/mL) 10 ng/mL 전후로 용 해 TGFβ. NK 세포는 하룻밤에 휴식 했다로 동일한 cytokines에 calcein 분석 실험을 실시 합니다.

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결과

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Electroporation 효율

Cas9/RNPs의 electroporation 최적화, GFP 비 대상으로 siRNA와 DNA 플라스 미드의 NK 세포로 변환 된 16 가지 프로그램 테스트. 교류 cytometry 분석 결과 엉-138 셀 생존 및 변환 효율 (35% 라이브 GFP 긍정적인 세포) (그림 1 및 그림 2) 두 입자의 높은 비율을 했다 보여주었다. 흥미롭게도,이 프로그램을 사용 하 여 Cas9/RNPs electroporation에 대 한 효율성 높은 우리가 본 TGFBR2 mRNA 식 수준 (그림 5)에서 60% 감소 했다. 또한, 유전자 변형된 NK 세포 성장...

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토론

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NK 세포의 DNA-종속 수정4,9도전 하고있다. 우리는, 따라서, 도입 직접 종합적으로 미리 형성한 ribonucleoprotein (RNPs) 복잡 하 고 Cas9 단백질 순화 된 단백질으로 기본 및 확장 된 NK 세포8로. 이 방법은 미행, 상한, 제거를 허용 하 고 다른 transcriptional 및 변환 프로세스는 RNA 중 합 효소 II는 DNA 의존 변환 메서드에 연결 된 NK 세포 apoptosis를 발생할 수 있습니다 의해 시작.

또한, 보고 하는 방법 여기 사용 순화 Cas9 단백질에 complexed electroporation 직후 활성화 하 고 신속 하 게, 그로 인하여 증가에 대상 및 현재 프로토콜을 통해 감소 하는 대상에서 효과 저하는 Cas9/RNPs 5

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공개 사항

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DAL 에서는/택배 치료제, 흑 요 석 치료제, Intellia 치료제, 머 크 연구소, 및 Miltenyi Biotec 컨설턴트 역임 했다와 주식/리더십 CytoSen 치료제에 합니다.

감사의 글

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우리는 원고 편집에 그의 친절 한 도움에 대 한 브라이언 툴 리를 인정 합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
로제트Sep™ 인간 NK 세포 농축 칵테일STEMCELL Technologies15065The RosetteSep™ Human NK Cell Enrichment Cocktail은 음성 선택에 의해 전혈에서 NK 세포를 분리하도록 설계되었습니다.
Ficoll-Paque® PLUSGE Healthcare - Life Sciences17-1440-02
Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA통합 DNA 기술은독점적인 화학적 변형을 포함하는 TracrRNA를 1072532 뉴클레아제 저항성을 증가시킵니다. Cas9 효소 Alt-R®를 활성화하기 위해 crRNA에 혼성화
; CRISPR-Cas9 crRNA통합 DNA 기술Alt-R®로 합성적으로 생산됨; CRISPR-Cas9 crRNA, intrest Alt-R®의 유전자를 표적으로 하는 설계된 gRNA의 염기서열에 기반
게놈 편집 검출 키트통합 DNA 기술1075931각 키트에는 T7EI 엔도뉴클레아제, T7EI 반응 완충액 및 T7EI 분석 대조군이 포함되어 있습니다.
플래티넘® Taq DNA 중합효소 고화질Invitrogen11304-011
4D-Nucleofector™ 시스템LonzaAAF-1002B
인간 재조합 IL-2 단백질Novartis65483-0116-07
P3 기본 세포 4D-Nucleofector™ X KitLonzaV4XP-3032포함 pmaxGFP™ 벡터, Nucleofector™ 솔루션, 보충제, 16웰 뉴클레오큐벳&트레이드; 스트립
비타겟팅: 맞춤형 siRNA, 표준 0.05 2mol ON-TARGETplusDharmaconCTM-360019
Alt-R® S.p. Cas9 Nuclease 3NLS통합 DNA 기술1074181Cas9 Nuclease
DNeasy® 블러드 & 조직 핸드북Qiagen69504
RNeasy 미니 키트Qiagen74104
Calcein AMThermoFisherC3099
TGFβBiolegend580706
Alt-R® CRISPR-Cas9 제어 키트, 인간통합 DNA 기술1072554tracrRNA, HPRT 양성 대조군 crRNA, 음성 대조군 crRNA#1, HPRT 프라이머 믹스 및 뉴클레아제가 없는 이중 완충액이 포함됩니다.
IDTE pH 7.5 (1X TE 용액)통합 DNA 기술11-01-02-02
Alt-R® Cas9 Electroporation Enhancer통합 DNA 기술1075915Cas9 Electroporation Enhancer
;에는

참고문헌

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