Cas9 Ribonucleoproteins를 사용 하 여 노크 아웃 기본 및 확장 된 인간 NK 세포의 생성

요약

여기, 선물이 유전자 Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs)를 사용 하 여 기본 또는 확장 된 인간의 자연 킬러 (NK) 세포를 수정 하는 프로토콜. 이 프로토콜을 사용 하 여 인간 NK 세포 성장 인자-b 수용 체 2를 변형 (TGFBR2) 및 hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1)에 대 한 결핍을 생성 했습니다.

초록

CRISPR/Cas9 기술 많은 세포 유형, 하지만 지금까지 유전자 배달에 게놈 엔지니어링 가속 되 고 안정적인 유전자 수정 기본 NK 세포에 도전 되었습니다. 예를 들어 transgene 배달 lentiviral 또는 retroviral 변환을 사용 하 여 실질적인 절차 관련 된 NK 세포 apoptosis 때문 NK 세포 유전자 조작의 제한 된 수율 결과. 여기 Cas9 ribonucleoprotein 복합물 (Cas9/RNPs)를 사용 하 여 인간의 기본 및 확장 된 NK 세포의 게놈 편집용 DNA 무료 방법을 설명 합니다. 이 메서드는 TGFBR2 와 의 효율적인 녹아웃 NK 세포에 HPRT1 유전자 허용. RT-PCR 데이터 유전자 식 수준에 중요 한 감소 그리고 대표적인 셀 제품의 세포 독성 분석 실험 제안 RNP 수정 NK 세포 TGFβ에 덜 민감한 되었다. 유전자 변형된 세포 조사 mbIL21 표현 된 자극에 의해 확장 된 게시물 electroporation 수 지류 세포.

서론

암 immunotherapy 최근 몇 년 동안에서 고급 되었습니다. 유전자 변형 공상 항 원 수용 체 (자동차) T 세포는 암 immunotherapy에 성공적으로 배포 하는 설계 된 면역 세포의 훌륭한 예입니다. 이 셀 최근에 대 한 처리를 위한 FDA에 의해 승인 되었다 CD19 + B 세포 악성 종양, 하지만 성공 지금까지 몇 대상 항, 베어링 질병에 국한 되었으며 같은 제한 된 항 원 레파토리를 대상으로 하는 것은 면역 탈출 하 여 실패 하는 경향이. 또한, 자동차 T 세포 이식-비교-호스트 질병 수용자 T 세포에 의해 발생의 헌 T 세포의 사용에 집중 되었습니다 했다. 반면, NK 세포는 종양 표적 항 원 독립적인 방식으로 죽 일 수 있으며 GvHD, 그들에 게 암 immunotherapy^6,7,,89에 대 한 좋은 후보를 발생 하지 않습니다.

CRISPR/Cas9 기술 최근 엔지니어링 면역 세포에서 사용 되었습니다 하지만 NK 세포는 플라스 미드 유전자 재프로그래밍 항상 도전 하고있다. 이것은 lentiv....

프로토콜

건강 한 기증자 버 피 코트에서 중앙 오하이오 지역 미국 적십자 소스 자료로 얻은 했다. 이 연구는 제도적 검토 보드의 전국 어린이 병원으로 면제 연구 될 결정 했다.

1. 인간 NK 세포 정화 및 확장

1. 버 피 코트¹²에서 PBMCs를 격리 합니다.
   1. 35 mL Ficoll-Paque의 15 mL에 버 피 코트 샘플의 레이어.
   2. 브레이크 없이 20 분에 대 한 400 x g에서 centrifuge 고 인터페이스에서에서 PBMC를 수집 합니다.
   3. PBS의 적어도 동등한 볼륨을 추가 하 여 복구 된 PBMCs 세 번 씻고, 400 x g에서 5 분간 centrifuging와 PBC 발음 세척. NK 세포 RosettesSep¹³이 단계에서 격리 된 수 있습니다.
2. 비친 10 x 10⁶ mbIL21-표현으로 자극 하 여 NK 세포를 확장 급지대 셀 0, 7, 14 일에. 10%를 포함 하는 신선한 RPMI 미디어 바꿉니다 FBS, 1% 글루타민, 1% 페니실린 스, 그리고 100 IU/mL의 일리노이-2 전체 미디어 볼륨 매일.
<....

결과

Electroporation 효율

Cas9/RNPs의 electroporation 최적화, GFP 비 대상으로 siRNA와 DNA 플라스 미드의 NK 세포로 변환 된 16 가지 프로그램 테스트. 교류 cytometry 분석 결과 엉-138 셀 생존 및 변환 효율 (35% 라이브 GFP 긍정적인 세포) (그림 1 및 그림 2) 두 입자의 높은 비율을 했다 보여주었다. 흥미롭게도,이 프로그램을 사용 하 여 Cas9/RNPs electroporation에 대 한 효율성 높은 우리가 본 TGFBR2 mRNA 식 수준 (그림 5)에서 60% 감소 했다. 또한, 유전자 변형된 NK 세포 성장.......

토론

NK 세포의 DNA-종속 수정^4,9도전 하고있다. 우리는, 따라서, 도입 직접 종합적으로 미리 형성한 ribonucleoprotein (RNPs) 복잡 하 고 Cas9 단백질 순화 된 단백질으로 기본 및 확장 된 NK 세포⁸로. 이 방법은 미행, 상한, 제거를 허용 하 고 다른 transcriptional 및 변환 프로세스는 RNA 중 합 효소 II는 DNA 의존 변환 메서드에 연결 된 NK 세포 apoptosis를 발생할 수 있습니다 의해 시작.

또한, 보고 하는 방법 여기 사용 순화 Cas9 단백질에 complexed electroporation 직후 활성화 하 고 신속 하 게, 그로 인하여 증가에 대상 및 현재 프로토콜을 통해 감소 하는 대상에서 효과 저하는 Cas9/RNPs ⁵

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
로제트Sep™ 인간 NK 세포 농축 칵테일	STEMCELL Technologies	15065	The RosetteSep™ Human NK Cell Enrichment Cocktail은 음성 선택에 의해 전혈에서 NK 세포를 분리하도록 설계되었습니다.
Ficoll-Paque® PLUS	GE Healthcare - Life Sciences	17-1440-02
Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA	통합 DNA 기술은		독점적인 화학적 변형을 포함하는 TracrRNA를 1072532 뉴클레아제 저항성을 증가시킵니다. Cas9 효소 Alt-R®를 활성화하기 위해 crRNA에 혼성화
; CRISPR-Cas9 crRNA	통합 DNA 기술		Alt-R®로 합성적으로 생산됨; CRISPR-Cas9 crRNA, intrest Alt-R®의 유전자를 표적으로 하는 설계된 gRNA의 염기서열에 기반
게놈 편집 검출 키트	통합 DNA 기술	1075931	각 키트에는 T7EI 엔도뉴클레아제, T7EI 반응 완충액 및 T7EI 분석 대조군이 포함되어 있습니다.
플래티넘® Taq DNA 중합효소 고화질	Invitrogen	11304-011
4D-Nucleofector™ 시스템	Lonza	AAF-1002B
인간 재조합 IL-2 단백질	Novartis	65483-0116-07
P3 기본 세포 4D-Nucleofector™ X Kit	Lonza	V4XP-3032	포함 pmaxGFP™ 벡터, Nucleofector™ 솔루션, 보충제, 16웰 뉴클레오큐벳&트레이드; 스트립
비타겟팅: 맞춤형 siRNA, 표준 0.05 2mol ON-TARGETplus	Dharmacon	CTM-360019
Alt-R® S.p. Cas9 Nuclease 3NLS	통합 DNA 기술	1074181	Cas9 Nuclease
DNeasy® 블러드 & 조직 핸드북	Qiagen	69504
RNeasy 미니 키트	Qiagen	74104
Calcein AM	ThermoFisher	C3099
TGFβ	Biolegend	580706
Alt-R® CRISPR-Cas9 제어 키트, 인간	통합 DNA 기술	1072554	tracrRNA, HPRT 양성 대조군 crRNA, 음성 대조군 crRNA#1, HPRT 프라이머 믹스 및 뉴클레아제가 없는 이중 완충액이 포함됩니다.
IDTE pH 7.5 (1X TE 용액)	통합 DNA 기술	11-01-02-02
Alt-R® Cas9 Electroporation Enhancer	통합 DNA 기술	1075915	Cas9 Electroporation Enhancer

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