다음-세대 16S rRNA Amplicon 시퀀싱에 의해 틱 미생물 특성

요약

여기 우리는 식별 및 벡터 내에서 미생물 커뮤니티의 16S rRNA 시퀀싱에 대 한 다음-세대 시퀀싱 프로토콜을 제시. 이 방법은 DNA 추출, 증폭 및 PCR, 시퀀싱 흐름 셀 및 생물 정보학에 계통 발생 정보를 시퀀스 데이터 일치를 통해 샘플의 바코드를 포함 한다.

초록

최근 수십 년간, 벡터 품 어진 질병이 다시 등장 있고 속도, 상당한 병 적 상태와 사망률 세계를 일으키는 놀라운 확대. 효과적이 고 널리 사용 가능한 백신은 소설 질병 완화 전략의 개발을 필요로 하는이 질병의 대부분 부족 합니다. 이 위해, 질병 통제의 한 유망한 애비뉴 벡터 미생물, 미생물 거주 벡터의 커뮤니티를 대상으로 포함 됩니다. 벡터 미생물 병원 체 역학에서 중추적인 역할을 담당 하 고는 미생물의 조작 벡터 품 어진 질병의 소수에 대 한 감소 된 벡터 풍부 또는 병원 체 전송 이어졌다. 그러나, 질병 제어 응용 프로그램에 이러한 결과 번역 벡터 미생물 생태학, 역사적으로이 분야에서 부족 한 기술에 의해 제한에 대 한 철저 한 이해를 필요 합니다. 차세대 시퀀싱 방법의 출현은 다양 한 미생물 커뮤니티의 급속 한, 높은 병렬 시퀀싱을 활성화 하 고 있다. 높은 보존 16S rRNA 유전자를 대상으로 다양 한 생태 및 실험 조건에서 벡터 내의 미생물의 characterizations 촉진 했다. 이 기술은 PCR, 시퀀싱, 흐름 셀에 로드 샘플 통해 샘플 바코드, 16S rRNA 유전자의 증폭과 생물 정보학 계통 발생 정보 시퀀스 데이터에 맞게 접근. 종 또는 속 수준 id 복제의 높은 숫자에 대 한 일반적으로 따라서 낮은 검출, 확인, 및 전통적인 경작, 현미경, 또는 조직학에 게 얼룩이 지기에서 출력의 문제를 우회 하는이 접근을 통해 달성 될 수 있다 기술입니다. 따라서,이 방법은 다양 한 조건 하에서 벡터 미생물을 특성화 하는 데 적합 하지만 현재 미생물 함수, 벡터, 또는 항생제 치료에 반응 내에서 위치 정보를 제공할 수 없습니다. 전반적으로, 16S 차세대 시퀀싱 정체성과 역할에서 질병 역학 벡터 미생물의 더 나은 이해를 위한 강력한 기술입니다.

서론

부활과 벡터 품 어진 질병의 확산을 최근 몇 십년 간에서 글로벌 인간과 야생 동물의 건강에 심각한 위협이 포즈. 이 질병의 대부분에 대 한 효과적인 백신 부족 하 고 제어 노력 벡터와 벡터-호스트 상호 작용의 복잡 한 생물 학적 특성에 의해 방해. 병원 체 전송에서 벡터 내 미생물 상호 작용의 역할을 이해 이러한 문제를 회피 하는 새로운 전략의 개발에 대 한 수 있습니다. 특히, 벡터 관련 미생물 공생, symbionts, 병원 균, 미생물로 사이 상호 작용 병원 체 전송에 대 한 중요 한 결과가 있을 수 있습니다. 압도적인 증거를 이제 벡터 미생물과 질병 말라리아, Zika 바이러스, 그리고 라임 질병^1,2,3에 대 한 능력 사이의 링크를 보여 주는 예제와 함께이 단언을 지원 합니다. 그러나, 질병 통제 예방 전략으로 이러한 결과 번역 구조, 기능, 및 벡터 microbiomes의 기원에 대 한 훨씬 더 상세한 이해를 요구 한다. 식별 및 다양 한 생태 및 실험 조건에서 벡터 미생물 커뮤니티의이 분야에서 앞으로 중요 한 경로 구성 합니다.

병원 체 벡터의 미생물 주민 확인을 ....

프로토콜

1. 틱 컬렉션 및 표면 살 균

1. 틱 틱 관련 서식, 진드기 제거에 1 m² 흰 헝겊을 끌어 호스트 종, 또는 실험실^15,16틱 양육 수집. 미세 집게를 사용 하 여 진드기를 조작-80 ° c.에서 그들을 저장 하
2. 개별 PCR 튜브에 틱 하 고 15 vortexing에 의해 표면 오염 물질을 제거 연속적으로 과산화 수소 (H₂O₂), 70% 에탄올 및 ddH₂오 500 μ s
3. 새로운 PCR 튜브에 진드기를 놓고 건조 하도록 허용 합니다.
4. 이 튜브에 기계적으로 박격포와 유 봉 (이 연구에 사용), 작은 구슬 구슬 때리는에 사용 하 여 진드기를 분쇄 하 여 틱 조직을 방해 또는 틱 메스와 떨어져 절단.

2. DNA 정화

1. 상업적으로 이용 가능한 DNA 추출 키트에 제공 된 지침에 따라 개별 틱에서 DNA를 정화. 100 μ의 최종 볼륨을 elute.
   참고: 단계 2.2-2.8의 개요 그림 1 을 참조 하십시오. ....

결과

총 3 개의 별도 달걀에서 42 틱 클러치 및 두 환경 노출 기간, 0과 토양, 2 주 미생물 시퀀싱에 대 한 처리 했다. 각 치료 그룹, 6-8 틱 샘플 복제를 포함 한 단일 클러치와 노출 시간으로 간주 됩니다. 이러한 처리 진드기 추출 물 다음-세대 시퀀서에 로드 된 하 고 필터를 통과 하는 12,885,713 쌍 간 읽기를 굴복. 이 실행에 포함 211,214 읽기 (이전 수에 포함)의 총 저조한 추출 단계에서 3 부정적인 컨트롤을 했다. 또한 각 통계에 대 한 최적의 값과 함께 실행된 품질 기준은 표 2에 자세히 나와 있습니다. OTUs는 시퀀싱 깊이, 또는 수의 독특한 시퀀스 샘플 당 읽습니다 2,129 읽기의 충분 한 것 미생물 지역 사회 (의 다양성을 적절 하 게 잡으려고 표시 샘플 당 수가 시퀀싱 노력 관련 진공 곡선 그림 2)입니다. 진공 레벨 샘플 형식에 따라 달라 집니.......

토론

16S rRNA의 다음-세대 시퀀싱와 벡터 microbiomes 병원 체 전송에 미치는 영향의 연구 활성화 미생물 식별을 위한 표준 접근 되고있다. 여기에 설명 된 프로토콜 세부 I. pacificus, 라임 병;에 대 한 벡터 종에에서 미생물 커뮤니티 어셈블리를 조사 하기 위해이 메서드를 사용 하 여 그러나, 그것은 쉽게 다른 틱 종 또는 arthropod 벡터 종 연구에 적용할 수 있습니다.

실제로, 16S rRNA 시퀀싱 미생물 분석을 위한 벡터 모기, 체체파리 파리^29,,3031, psyllids, 등의 microbiomes 연구를 광범위 하 게 사용 되었습니다. 벡터 내 미생물 확인을 위해 사용할 수 있는 다른 방법 등 현미경, 배양, 조직학에 게 얼룩이 지기. 이러한 메서드는 시퀀싱 목표.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
재료	/장비	회사	카탈로그 #
1	DNeasy Blood &의 항목 이름 조직 키트	Qiagen	69504
2	Qubit 4 형광계	ThermoFisher Scientific	Q3326
3	NanoDrop 8000 분광광도계	ThermoFisher Scientific	ND-8000-GL
4	2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix	Kapa Biosystems	KK2501
5	AMPure XP 비즈	Agen Court	A63880
6	자기 랙	ThermoFisher Scientific	MR02
6	TE 버퍼	Teknova	T0223
7	Nextera Index Kit	Illumina	FC-121-1011
8	KAPA 라이브러리 수량화 키트	Roche	KK4824
9	MiSeq 시스템	Illumina	SY-410-1003
10	MiSeq 시약 키트 v3	Illumina	MS-102-3001
	11 10 mM Tris-HCl(0.1% 트윈 포함) 20	Teknova	T7724