여기, 선물이 곤충 세포 및 잠재 단백질 식 시스템 단백질 결정 화에 대 한 분 비 하는 식물 단백질의 대량 생산에 활용에 대 한 프로토콜. 잠재 식 벡터 GP67 또는 곤충 hemolin 신호 펩 티 드 식물 곤충 세포에서 단백질 분 비 식에 대 한 수정 되었습니다.
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이 논문에서
요약
초록
그것은 구조 및 생화학 연구 재조합 분 비 진 핵 단백질을 표현 하는 과학자에 대 한 도전이 되었습니다. 잠재 중재 곤충 세포 표현 시스템 일부 포스트 번역 상 수정 재조합 진 핵 세포 분 비 단백질을 표현 하는 데 사용 하는 시스템 중 하나입니다. 분 비 단백질 단백질 glycosylation, 이황화 결합 형성, 및 다른 포스트 번역 상 수정 분 비 경로 통해 라우팅할 필요가 있다. 를 개선 하기 위해 분 비 식물 단백질의 기존 곤충 세포 표현 잠재 식 벡터 중 하나는 GP67의 추가 또는 발기인 및 다중 복제 사이트 간에 hemolin 신호 펩 티 드 순서에 의해 수정 됩니다. 이 새롭게 설계 된 수정된 벡터 시스템은 성공적으로 애기 thaliana의 수용 성 재조합 분 비 식물 수용 체 단백질의 높은 수익률을 생산. 두 애기 TDR 및 PRK3 원형질 막 수용 체의 세포 외 도메인 표현된 식물 단백질의 x 선 결정학 연구 화 시키는 했다. 수정 된 벡터 시스템 뿐만 아니라 동물의 왕국에 있는 재조합 형 분 비 단백질의 표정을 위해 잠재적으로 이용 될 수 있는 향상 된 도구입니다.
서론
특히 x 선 결정학 연구에 대 한 생화학 및 생물 characterizations 위해 균질 재조합 단백질의 대량 생산의 수 연구 실험실을 위한 필수적입니다. 대장균, 효 모, 곤충 세포, 포유류 세포, 식물 세포, 등 그들의 사이에서 많은 확고 분리 식 시스템, 잠재 중재 곤충 세포 표현 시스템은 가장 중 일반적으로 구조적으로 접힌된 대형 재조합 진 핵 단백질의 단백질 결정 화1대량 생산 기법을 사용.
잠재 식 시스템의 식 벡터는 강한 polyhedrin 또는 재조합 세포내 단백질2,3의 높은 수익률을 생산 하는 P10 발기인을 포함 하도록 설계 되었습니다. 재조합 잠재 수 있도록, 관심사의 유전자 Autographa californica nucleopolyhedroviral 멀티 게놈의 polyhedrin (polh) 로커 스를 포함 하는 곤충 벡터에 복제 됩니다. 결과 구문 다음 시퀀스 및 올바른 열려있는 독서 프레임 (ORF) 확인. 올바른 구문 다음 transfection의 과정을 통해 호스트 곤충 세포에 도입 되었습니다. 관심사의 유전자는 상 동 재조합에 의해 바이러스 성 게놈에 삽입 됩니다. 이 이벤트는 재조합 생산 하는 후 복제 바이러스 입자1언약궤 재조합 형 바이러스 성 게놈의 생산에서 발생 합니다.
곤충 세포 표현 시스템에서 가장 일반적으로 사용 되는 Sf9 및 높은 5 (Hi5) 세포 이다. Sf9 세포는 Sf21, Spodoptera frugiperda의 번데기 난소 세포에서 파생 된의 클론 분리 되며 Hi5 세포 클론 분리는 부모의 Trichoplusia ni 난소 세포 선 테네시-3684,5에서 파생 된. Hi5 셀 일반적으로 재조합 단백질6의 더 높은 양을 생성을 선택 하는 동안 공동 transfections, 바이러스 증폭 및 상 패 분석 실험, Sf9 세포에 지휘 된다. Hi5 세포는 돌연변이 바이러스를 생산 하는 그들의 추세 때문에 세대 및 바이러스 progenies의 증폭에 적합 하지 않습니다 지적 가치가 있다. 전통적으로, 25-30 ° C의 온도 범위는 곤충 세포의 경작에 좋은 것으로 간주 됩니다. 그러나, 그것은 27-28 ° C 곤충 세포 성장과 감염7,8에 대 한 최적의 온도 보고 되었습니다.
강한 신호 순서 선행 하는 유전자의 소개 secreted 단백질의 높은 식이 필요 합니다. 신호 순서 효율적으로 단백질 분 비와 포스트 번역 상 수정 적절 한 접는 및 안정화3에 필요한에 대 한 바인딩과 그물에 번역 된 재조합 단백질을 안내 것입니다. 신호 펩 티 드 순서는 잠재 봉투 단백질 GP64/67, 꿀벌 melittin, 그리고 다른 사람, 같이 잠재 중재 식 시스템3분 비 재조합 형 단백질의 표정을 촉진 하기 위해 선택 되었습니다. GP67의 신호 펩 티 드의 도입 대상 유전자9의 내장 신호 펩 티 드를 사용 하 여 비교 secreted 재조합 단백질의 식 수율을 개선 하기 위해 표시 되었습니다. Hemolin는 거 대 한 실크 나 방 Hyalophora cecropia, 박테리아 감염10시 유도의 hemolymph 단백질 이다. 유도 식의 상대적으로 높은 수준으로 인해 유전자의 신호 펩 티 드 순서 잠재 곤충 세포 시스템에서 재조합 단백질의 분 비 식 중재에 사용할 수 있습니다.
A. thaliana Tracheary 요소 차별화 금지 요인 수용 체 (TDR)와 꽃가루 수용 체 키 니 아 제 3 (PRK3) 둘 다 단백질11,12의 식물 신 부유한 반복 같은 수용 체 키 니 아 제 (LRR-RLK) 가족에 속하는 . 구조와 공장 수용 체 단백질의, 뿐만 아니라 다른 식물 분 비 단백질의 구조 및 생 화 확 적인 특성 있을이 가족의 기능을 공부 하기 위하여 잠재 곤충 세포 표현 시스템 수정 되었습니다. 단백질의 품질 및 생산 수율을 향상 시킵니다. TDR 및 PRK3의 세포 외 도메인 성공적으로 두 개의 수정된 식 벡터를 사용 하 여 잠재 곤충 세포 표현 시스템에서 표현 되었습니다. TDR 및 PRK3 단백질의 extracellular 도메인 모두 화 시키는 되는. 이 문서는 GP67 또는 발기인 및 여러 복제 사이 hemolin 신호 순서를 통합 하 여 표현과 많은 양의 두 수정된 잠재 식 벡터와 재조합 분 비 식물 단백질의 정화를 보고 사이트입니다.
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프로토콜
참고: 분 비 식물 단백질 표정 및 결정 화에 대 한 수정 된 식 벡터와 곤충 셀/잠재 시스템 사용 됩니다.
1. 식물 단백질 분 비 식 GP67 신호 펩 티 드와 잠재 식 벡터의 수정
- 5' BglII 절단 사이트13, GP67 분 비 신호 순서, 노트, BamHI, EcoRI, StuI, 사리, SpeI, XbaI, PstI, 및 XhoI (그림 1A)의 다중 복제 사이트를 포함 하는 DNA 파편을 음성 합성.
참고: BglII와 BamHI 소화 이후 같은 접착제 끝 귀착되 었 다 DNA, 선형화 벡터 단련된 결 찰 순서에 BglII 및 BamHI 사이트 여 쪼갤은 시퀀스를 변경 될 것입니다 하는 동안 소화 DNA 단편에 선 수 있습니다. BglII 또는 BamHI14. - BglII와 XhoI, DNA의 다이제스트 4 µ g 그리고 BamHI 및 XhoI14는 식 벡터 DNA의 4 µ g. Dna 농도 반응 버퍼 (50mm 칼륨 아세테이트, 20 mM 트리 아세테이트, 10 m m 마그네슘 아세테이트, 및 100 µ g/mL BSA, pH 7.9 25 ° C에서) x 1에 각 제한 효소의 10 단위를 혼합 하 고 37 ° C 4 h에서 혼합물을 품 어.
- 삭제 DNA 파편 및 선형화 벡터 DNA는 DNA 젤 추출 키트15정화.
- 400 선형화 벡터 DNA의 믹스 100 ng ng 소화 DNA의 x T4 DNA 리가 반응 버퍼 (50 mM Tris HCl, 10 m m MgCl2, 1 ATP, 그리고 10 mM DTT, pH 7.5 25 ° C에서)와 T4 DNA의 5 대 1을 포함 하는 10 µ L 결 찰 반응 혼합물에서 조각 리가입니다. 16 h 16 ° C에서 반응 혼합물을 품 어.
- 100 µ L DH5α 유능한 세포 표준 변환 프로토콜을 다음의 결 찰 혼합물의 5 µ L를 변환 하 고 암 피 실린-파운드 한 접시16에 결과 식민지를 선택 합니다. 5-10 식민지를 선택 하 고 220 rpm 및 16 h 떨고 인큐베이터에서 37 ° C에서 100 µ g/mL 암 피 실린 포함 된 파운드 매체의 2 mL에 각 식민지를 성장.
- DNA miniprep 키트17 각 플라스 미드 DNA를 추출 하 고 AGTATTTTACTGTTTTCGTAACAG 뇌관 DNA 연속 클론을 확인.
- PCR 증폭 A. thaliana TDR 유전자 조각 인코딩 잔류물 구성 합성 TDR 유전자에서 30-642 (뇌관을 앞으로: CATG GCGGCCGC CTCAAGTTTTCACCTCAACTCTTGTC, 반전 뇌관: GC GGATCC CTA GTG GTG ATG GTG GTG GTG ACCGTCTATATCTGCATTTCCGGC). 0.5 m m dNTP 믹스, 0.2 µ M 뇌관, 템플릿 DNA의 0.1 µ g, 0.4 m m MgCl2및 DNA 중 합 효소의 1 반응 단위를 포함 하는 DNA 중 합 효소 반응 버퍼에 30 사이클에 대 한 DNA를 증폭.
- 95 ° c 30에 대 한 초기 변성 PCR 주기 단계에 대 한 설정 들, 그리고 다음 30 주기 변성 95 ° C에서 30 s, 30 s 및 1 분에 72 ° C에서 5 분 동안 72 ° C에서 최종 확장 확장에 대 한 55 ° C에 어 닐 링.
- PCR 파편 및 노트와 BamHI 제한 endonuclease 효소 수정된 벡터 다이제스트. 선형화 벡터와 유전자 단편 선 400 선형화 벡터 DNA의 믹스 100 ng ng 소화 DNA의 조각 T4 DNA 리가 반응 버퍼 및 T4 DNA 리가의 5 단위를 포함 하는 10 µ L 결 찰 반응 혼합물에서. 16 h 16 ° C에서 반응 혼합물을 품 어.
- 100 µ L DH5α 유능한 세포 표준 변환 프로토콜을 다음의 결 찰 혼합물의 5 µ L를 변환 하 고 암 피 실린-파운드 한 접시16에 결과 식민지를 선택 합니다. DNA 시퀀싱에 의해 정확한 복제를 확인 합니다.
2. 식물 단백질 분 비 식 곤충 Hemolin 신호 펩 티 드와 잠재 식 벡터의 수정
- 5' BglII 절단 사이트13, 곤충 hemolin 분 비 신호 순서, 노트, BamHI, EcoRI, StuI, 사리, SpeI, XbaI, PstI, 및 XhoI (그림 1B)의 다중 복제 사이트를 포함 하는 DNA 파편을 음성 합성.
- BglII와 XhoI, DNA의 다이제스트 4 µ g 그리고 BamHI 및 XhoI14는 식 벡터 DNA의 4 µ g. Dna 농도 반응 버퍼 (50mm 칼륨 아세테이트, 20 mM 트리 아세테이트, 10 m m 마그네슘 아세테이트, 및 100 µ g/mL BSA, pH 7.9 25 ° C에서) x 1에 각 제한 효소의 10 단위를 혼합 하 고 37 ° C 4 h에서 혼합물을 품 어.
- 삭제 DNA 파편 및 선형화 벡터 DNA는 DNA 젤 추출 키트15정화.
- 400 선형화 벡터 DNA의 믹스 100 ng ng 소화 DNA의 x T4 DNA 리가 반응 버퍼 (50 mM Tris HCl, 10 m m MgCl2, 1 ATP, 그리고 10 mM DTT, pH 7.5 25 ° C에서)와 T4 DNA의 5 대 1을 포함 하는 10 µ L 결 찰 반응 혼합물에서 조각 리가입니다. 16 h 16 ° C에서 반응 혼합물을 품 어.
- 100 µ L DH5α 유능한 세포의 결 찰 혼합물의 5 µ L를 변환 하 고 암 피 실린-파운드 한 접시에 식민지를 선택 합니다. 5-10 식민지를 선택 하 고 포함 하는 100 µ g/mL 암 피 실린 220 rpm 및 16 h 떨고 인큐베이터에서 37 ° C에서의 2 mL 파운드 매체에 각 식민지를 성장.
- DNA miniprep 키트17 플라스 미드 DNA를 추출 하 고 AGTATTTTACTGTTTTCGTAACAG 뇌관 DNA 연속 클론을 확인 합니다.
- PCR 증폭를 A. thaliana 꽃가루 수용 체 키 니 아 제 3 (PRK3) 유전자 조각 잔류물 20-237 합성 PRK3 유전자 구성에서 인코딩 (뇌관을 앞으로: CATG GCGGCCGC CTACAAAACGTTAGTGAATCGGAACC, 반전 뇌관: CGC GGATCC CTA GTG GTG ATG GTG GTG GTG TGAAGGTTTCTCATCGCATTCTATATTC)입니다. 0.5 m m dNTP 믹스, 0.2 µ M 뇌관, 템플릿 DNA의 0.1 µ g, 0.4 m m MgCl2및 DNA 중 합 효소의 1 반응 단위를 포함 하는 DNA 중 합 효소 반응 버퍼에 30 사이클에 대 한 DNA를 증폭.
- 초기 변성 95 ° C 30에 대 한 설정에 대 한 PCR 주기 단계 s, 그리고 다음 30 주기 변성 95 ° C에서 30 s, 30 s 및 30에 대 한 72 ° C에서 확장 하는 55 ° C에서 어 닐 링 각 주기 및 5 분 동안 72 ° C에서 마지막 확장 내에서 s.
- PCR 파편 및 노트와 BamHI 제한 endonuclease 효소 수정된 벡터 다이제스트. 선형화 벡터와 유전자 단편 선 400 선형화 벡터 DNA의 믹스 100 ng ng 소화 DNA의 조각 T4 DNA 리가 반응 버퍼 및 T4 DNA 리가의 5 단위를 포함 하는 10 µ L 결 찰 반응 혼합물에서. 16 h 16 ° C에서 반응 혼합물을 품 어.
- 100 µ L DH5α 유능한 세포 표준 변환 프로토콜을 다음의 결 찰 혼합물의 5 µ L를 변환 하 고 암 피 실린-파운드 한 접시16에 결과 식민지를 선택 합니다. DNA 시퀀싱에 의해 정확한 복제를 확인 합니다.
3. 생산 및 잠재의 증폭 재조합 형 단백질 표정 카세트를 품고 생성
- DH10Bac 유능한 세포 잠재 식 시스템1의 프로토콜을 다음의 40 µ L 변환 구문 플라스 미드의 사용 100 ng. 48 h에 대 한 37 ° C에서 변환 접시를 품 어.
- 각 변환 플레이트에서 두 개의 백색 식민지를, 각 식민지 파운드 매체 50 µ g/mL 대, 7 µ g/mL gentamicin, 그리고 10 µ g/mL 항생물질의 2 mL에 접종. 추출 하 고 bacmid DNA 확인 잠재 식 시스템1 의 프로토콜을 따릅니다. Aliquot 20 µ L 각와 함께 두 개의 튜브에서 각 DNA-20 ° c.에 튜브를 저장
참고: 다음 단계는 무 균 작업이 필요합니다. - 27 ° C에서 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 100 µ g/mL (또는 100 I.U./mL) 문화 미디어 스 페니실린 항생제에 Sf9 세포의 단층 6 잘 플레이트 합류 점 80% 성장. 합류의 조직 문화 접시에 덮여 영역 비율에 따라 백분율을 예상 하고있다.
- 2 살 균 1.5 mL 원심 분리기 튜브에 다음과 같은 솔루션을 준비 합니다.
- 1 관: 각 transfection에 대 한 항생제 없이 unsupplemented Sf9 세포 배양 매체의 100 µ L로 bacmid DNA의 20 µ L 희석. 튜브의 측면을 터치 하 여 희석을 부드럽게 혼합.
- 2 관: 각 transfection에 대 한 항생제 없이 unsupplemented Sf9 세포 배양 매체의 100 µ L로 지질 transfection 시 약의 8 µ L를 희석. 6 x를 위아래로 pipetting으로 희석을 철저 하 게 혼합.
- 두 솔루션을 결합, 3 x를 위아래로 천천히 pipetting으로 그들을 부드럽게 혼합 하 고 실 온에서 20-40 분 동안 그들을 품 어.
- 각 잘 Sf9 단층의 세포 항생제 없이 unsupplemented Sf9 세포 배양 매체의 3 mL 2 x 세척. 각 transfection 지질-DNA 혼합물을 포함 하는 각 관에 항생제 없이 unsupplemented Sf9 세포 배양 매체의 0.8 mL를 추가 합니다. 3 x를 위아래로 천천히 pipetting으로 튜브의 내용의 부드럽게 혼합. Transfection 혼합 샘플을 오버레이 및 격판덮개에서 세척 미디어 발음.
- Transfection 혼합물의 추가 후에 품 어 27 ° c.에 5 h transfected 플레이트 10 %FBS 100 µ g/mL (100 I.U./mL) 포함 된 완전 한 Sf9 세포 배양 매체 transfection 미디어 바꿉니다 항생제 페니실린 스. 4 d 27 ° C에서 transfected 접시를 품 어.
- 수확 하 고 재조합 잠재 증폭.
- 외피의 4 d 후 살 균 15 mL 원뿔 튜브에 감염 된 접시의 상쾌한을 수집 합니다. 1010 x g 세포 파편을 제거 하 5 분에 상쾌한 스핀. 펠 릿을 삭제 하 고 깨끗 한 튜브에 상쾌한 가만히 따르다 4 ° C에서 최대 1 년 동안 그것을 저장.
참고: 이것은 P0 바이러스입니다. 그것은 시간이 더 긴 기간 aliquoted 및-80 ° C에서 저장 될 수 있습니다. - 각 재조합 바이러스를 증폭, 80% 합류 150 mm 접시에 Sf9 세포의 단층 성장. 접시에서 미디어를 발음 접시에 세포 부착에 P0 바이러스의 2 개 mL를 추가 하 고 품 어 27 ° C 배양 기에서 1 시간에 대 한 접시. 셀으로 매체를 혼합 판 매 15 분 바위.
- 10 %FBS 100 µ g/mL (100 I.U./mL)를 포함 하는 완전 한 그레이스의 미디어의 25 mL를 추가 항생제 페니실린 스. P1 통행 바이러스를 27 ° C 인큐베이터에서 3 d 격판덮개를 품 어.
- 살 균 50 mL 원뿔 튜브에 세포 파편을 제거 하 5 분에 대 한 1010 x g 에서 스핀 감염 된 접시의 상쾌한을 수집 합니다. 깨끗 한 튜브에 상쾌한 가만히 따르다 고 최대 1 년 동안 4 ° C에서 그것을 저장 합니다.
참고: P1 바이러스 수 있습니다 aliquoted-80 ° C에서 저장 시간이 더 긴 기간에 대 한. - P1에서 P2 통행 바이러스를 증폭, 90% 합류를 150 mm 접시에 Sf9 세포의 단층을 성장 하 고, 접시의 미디어를 발음 하 고, 접시, P1 바이러스의 2 개 mL를 추가 한 27 ° C 배양 기에서 1 시간을 위해 그것을 품 어.
- 3.8.2 및 3.8.3 바이러스의 P2 및 P3 구절을 단계를 반복 합니다. 2 개월 이상 P3 바이러스를 저장 하지 마십시오.
- 외피의 4 d 후 살 균 15 mL 원뿔 튜브에 감염 된 접시의 상쾌한을 수집 합니다. 1010 x g 세포 파편을 제거 하 5 분에 상쾌한 스핀. 펠 릿을 삭제 하 고 깨끗 한 튜브에 상쾌한 가만히 따르다 4 ° C에서 최대 1 년 동안 그것을 저장.
4. 단백질 식, NiNTA, 및 결정 화 정화
- 27 ° C 배양 기 통에 100 rpm에서 2 x 106 의 밀도 100 µ g/mL (100 I.U./mL) 문화 미디어 페니실린 스 항생제에 Hi5 곤충 세포의 1 L 문화. 570 x g 5 분에 셀 아래로 회전 시키십시오, 가만히 따르다는 상쾌한, 갓 생산된 P3 바이러스의 20 mL에 셀 resuspend 그리고 1 헤 부드럽게 흔들어 각 15 분 x 1 셀 resuspend 스핀 병에 대 한 실내 온도에서 보관.
- 와 100 µ g/mL (100 I.U./mL) 문화 미디어 스 페니실린 항생제의 1 l 셀을 전송 하 고 72 h. 스핀 1,010 x g 5 분에 셀 아래에 27 ° C 배양 기 통에 100 rpm에서 셀 문화는 상쾌한을 수집 합니다.
- 사용 pH 지시자 0.1 M HCl 또는 0.1 M NaOH 추가 하 여 상쾌한 8.0의 pH를 조정 하 고 최종 농도, pH 8.0, 100 mM NaCl, 20 mM Tris 버퍼 및 5mm 이미에 바인딩 버퍼를 추가를 제거 합니다. 표현된 그의 태그 재조합 단백질의 예상된 수익률에 따라 NiNTA 수 지 (10-40 mL)의 일정 금액을 추가 합니다.
- 수 지 1 h. 워시 4 ° C에서 낮은 속도와 자기 파문에 솔루션을 혼합 하 고 표준 NiNTA 정화 프로토콜18다음 바인딩된 단백질을 elute.
- 이온 교환 정제 단백질 주제와 젤 여과 착 색 인쇄기, 뿐만 아니라 다른 단백질 정화 방법, 균질 샘플을 얻을.
참고: TDR ectodomain, 20 mM Tris, pH 8, 100 mM NaCl 젤 여과 버퍼로 사용 했다. PRK3 ectodomain, 20 m m 두번째-트리 스에 대 한 pH 6, 100 mM NaCl 선호 젤 여과 버퍼로 사용 되었다.
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결과
그림 1에서 보듯이 두 수정된 pFastBac1 잠재 식 벡터는 GP67 또는 hemolin 신호 순서 대상 유전자의 본질적인 신호 순서를 대체 하는 secreted 단백질을 표현 하기 위해 사용 되었다. 바이러스 성 GP67와 곤충 hemolin 유전자 세포에 있는 높은 분 비 식 수준 입증 되었습니다. 융해 단백질이 두 신호 시퀀스 중 하나가 크게 분 비 식 수준 향상으로 예상 된다. 동일한 다 수 클로닝 위치 (MCS) 이러한 두 수정된 벡터에서 설계 했다. 노트 사이트 노트 8-뉴클레오티드 순서 보다는 가장 일반적인 6 뉴클레오티드 순서 다른 많은 금지 사이트에 있기 때문에 가장 5'-측면에 있는 MCS의 신중 하 게 배치 했다. 따라서, 노트 사이트는 대부분의 다른 제한 사이트, 제한 소화를 만들고 사용 하 여 다른 제한 사이트에 비해 더 실현 가능한 대부분 대상 유전자의 클로닝 보다 덜 대상 유전자에 존재....
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토론
크기 및 생물 학적 시스템에 단백질의 수천의 안정성에 다양성을 감안할 때, 그것은 종종 경험적 연구에 대 한 실험실을 분리 표현 시스템을 결정 하는 특정 단백질의 표현에 대 한 선택. 대장균 식 시스템은 종종19최대 규모 박테리아, 문화 미디어, 그리고 상대적으로 완화의 저렴 한 비용의 짧은 라이프 사이클에 따른 단백질 표정에 대 한 첫 번째 선택. 그러나 60 kDa,, 대장균 을 사용 하 여 보다는 더 크기와 큰 진 핵 단백질의 표현에 대 한 시스템은 종종 포함 본문 또는 집계20에서 불용 성 단백질에 결과. 그 어려운 단백질의 표정을 위해, 그리고 다른 secreted 단백질에 대 한 잠재-곤충 세포 표현 시스템 전자 대장균보다 더 유리한 수 있습니다. 진 핵 단백질 분 비를 표현 하는 경우에 특히이 수정된 잠재 곤충 세포 표현 시스템 선호 하는 선택 일 수 있었다.
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
이 작품 Guozhou Xu에 대 한 노스 캐롤라이나 주립 대학에서 새로운 교수 시작 자금에 의해 지원 되었다.
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재료
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| Herculase II Fusion DNA 중합효소 | Agilent | 600677-51 | |
| Thermal Cycler | 의 PCR 증폭용BIO-RAD | 모델 C1000 터치 | |
| 인큐베이터 셰이커 | 뉴 브런 즈윅 과학 | 모델 I 24 | 박테리아 배양 성장을위한 |
| 고객 DNA 합성 | GENSCRIPT | ||
| BamHI (HF) | New England Biolabs | R3136S | 제한 엔도 뉴 클레아제 |
| BglII | New England Biolabs | R0144S | 제한 엔도 뉴 클레아제 |
| NotI (HF) | New England Biolabs | R3189S | 제한 엔도뉴클레아제 |
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| 6웰 플레이트 | Thermo Fisher Scientific | 08-772-1B | 바닥이 평평한 |
| 150 mm 플레이트 | Thermo Fisher Scientific | 353025 | 100/케이스 |
| 1.5 ml 마이크로 원심분리기 튜브 | USA Scientific | 1415-2500 | 500 튜브/백 |
| 15 ml 원뿔형 스크류 캡 원심분리기 튜브 | USA Scientific | 1475-0511 | 25 튜브/백 |
| 50 ml 원추형 스크류 캡 원심분리기 튜브 | USA | Scientific 1500-1211 | 25 튜브/백 |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30430 | NiNTA 수지 |
| pH 지시자 스트립 | EMD Millipore Corporation | 1.09535.0001 | 산도 0 - 14 |
참고문헌
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