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방법 논문

질병-특정 항 체의 생성에 대 한 항 원 리

11.5K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/58285

⸱

2018년 10월 25일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Janssen R&D, 2Department of Microbiology and Immunology, University of North Carolina, 3UNC Food Allergy Initiative, University of North Carolina, 4Department of Pediatrics, University of North Carolina, 5Department of Chemistry, University of Alberta, 6Department of Molecular Medicine, Scripps Research Institute, 7Department of Medical Microbiology and Immunology, University of Alberta

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

설명 된 항 원 자주 나노 입자와 자극 B 세포 활성화에서 생체 외에서 그리고 vivo에서에서 그들의 사용의 준비가 이다. 일관 되 고 강력한 항 체 응답 새로운 땅콩 알레르기 모델의 개발을 주도. 항 원 리를 생성 하기 위한 프로토콜은 다른 항 원 및 예방 모델을 확장할 수 있습니다.

초록

항 체 응답은 다양 한 병원 체를 중요 한 보호 면역을 제공합니다. 뿐만 아니라, 어떻게 병원 성 항 체 응답에 알레르기 및 면역 질환 개발 이해 예방 접종에 대 한 강력한 항 체 생성에 높은 관심을 확인 하 고 남아 있습니다. 생성 하는 강력한 항 원 특정 항 체 응답은 아닙니다 사소한. 마우스 모델에서 그것은 종종 유발된 항 체의 수준에 변화의 큰 거래 하는 보조로 예방 접종의 여러 라운드를 필요 합니다. 한 예로 어디 더 강력 하 고 재현할 수 모델 마우스 숫자와 보조의 사용을 최소화 하는 도움이 될 것 이라고 하는 땅콩 알레르기의 마우스 모델에서 이다. 여기에 제시 된 땅콩 알레르기 알레르기의 높은 재현성 마우스 모델이입니다. 두 가지 주요 요인에 의존 하는이 새로운 모델: (1) 항 원 특정 splenocytes adoptively; 쥐의 많은 수에 걸쳐 항 원 특정 메모리 B 및 T 세포의 수를 정상화 순진한 받는 사람 마우스에 땅콩 응 마우스에서 전송 그리고 (2) 받는 사람 마우스 이후 주요 땅콩 알레르기 (Ara h 2)를 표시 하는 자주 나노 입자의 형태에 강한 multivalent immunogen로 밀어 주었다. 이 모델의 주요 장점은 보조의 여러 주사 받은 동물의 수를 최소화 하면서 각 연구에 사용 된 동물의 수를 낮추고 궁극적으로 그것의 재현성. 면역성이 리의 모듈 어셈블리 병원 성 항 체를 포함 하는 다른 알레르기 또는 면역 모델에 상대적으로 손쉬운 적응성을 제공 합니다.

서론

음식 알레르기, 미국에서 어린이의 8%와 지난 유행에서 증가 했다 10 년1. 땅콩에 알레르기 어린이의 1%에 영향을 하 고는 일반적으로 능가 해2. 비록 몇 가지 유망한 임상 시험 진행 구두 immunotherapy (OIT), 설 immunotherapy (슬릿), 및 epicutaneous immunotherapy (EPIT)를 포함 하 여 음식 알레르기의 치료에 대 한 현재 아무 치료 FDA 승인 전략은 땅콩 알레르기 성 개인3,,45,6,7,8믹싱되어에 대 한 따라서, 알레르기 성 개인 엄격 하 게 알레르기를 피하기 위해 알레르기를 방지 해야 합니다. 많은 질문 남아 민감성의 노선 및 음식 알레르기 개발의 메커니즘을 기본.

마우스 모델은 새로운 tolerogenic와 둔감 치료9,10,,1112개발 뿐만 아니라 알레르기의 기계 장치를 공부 하기 위한 유용한 도구입니다. 이것은 특히 사실 때문에 주요 땅콩 알레르기 (Ara h 2; Ah2) 간에 또한 몇몇에서 지배적인 알레르기 설명 마우스 모델13,14. 땅콩 알레르기의 마우스 모델 아니라, 관용의 메커니즘 연구에 귀중 한 동안, 결점은 그 변수 하 수 adjuvants의 사용을 필요로. 더 강력한 immunogens 같은 모델의 본질적인 가변성을 최소화 하기 위해 한 가지 방법은 것입니다. 표시는 알레르기 항 원 리는 또한 효율적으로의 속성을가지고 하는 동안 잠재적으로 B 세포 수용 체 (BCR)를 통해 B 세포를 활성화 하는 능력 때문에 좋은 옵션 때문에 B 세포는 강하게 multivalent 항 원에 의해 활성화 됩니다, 비 구체적으로 항 원 제시 하 여 채택 되 고를 통해 T 세포 격실을 못쓰게 셀.

여기, 우리 동산 손쉬운 및 모듈형 전략을 사용 하 여 자주 나노 입자에 항 원 단백질에 대 한 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 시연 대리 항, 안티-IgM Fab 조각 사용 하 여, 얼마나 강력한 같은 항 원 리 자극 B 세포 활성화에 있을 수 있습니다. Ah2 항을 표시 하는 항 원 리 수 여 감도의 새로운 마우스 모델을 개발 하기 위해 사용 되었다. 이 모델에서 splenocytes에서 확인 된 땅콩 알레르기 생쥐, 땅콩 전용 메모리 B 및 T 세포를 포함 하는 순진한 congenic 쥐로 전송 됩니다. 메모리 항 체 응답 Ah2에 대하여 항 체를 유도 하기 위하여 받는 쥐로 Ah2 함께 활용 된 리의 주입에 의해 유발 됩니다. 녹는 Ah2 하나만 부스트를 이어서 Ah2 특정 항 체를 야기할 강한 과민 반응이이 마우스는 이후에 Ah2 도전 때. 이 방법은 바람직한 땅콩 알레르기 모델 이며 결과 유틸리티 다른 마우스 모델에서 지시 하는 항 원에 의해 구동 있을 수 있습니다 제안 마우스 알레르기 반응을 겪고 매우 균일 한 방식으로 반응 하 고는 보조를 받지 못한, 알레르기 그리고 아마도 autoantigens입니다.

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프로토콜

지질 하 리에 단백질 결합의 일반적인 방법 이다 이전 작업15크게을 기반으로 합니다. 아래 설명 하는 모든 동물 절차 있다 채 플 힐 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에서 북캐롤라이나의 대학에 의해 승인 되었습니다. 땅콩 알레르기 모델에서 사용 하는 모든 마우스는 BALB/cJ 여성 나이의 3 주에에서 구입. 앨버타의 대학 동물 보호와 사용 위원회 (ACUC) 6 주 이상 C57Bl/6 쥐에서 vivo 전 분석에 대 한 마우스 spleens의 사용을 포함 하는 실험을 승인 했습니다.

1. PEGylated 지질을 항 원 단백질의 활용

  1. 250 mL 진공 플라스 크를 1500-30000 Daltons (Da)의 분류 범위 복사해올된 dextran 젤 구슬의 3 세대를 추가 합니다. 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) 60 mL을 추가 하 고 지속적으로 자기 볶음 바 저 어. 플라스 크를 밀봉 하 고 최소 1 시간 저 어 접시에 드 가스 처리를 시작 하는 진공을 연결 합니다.
  2. 마감 매출 마 개와 함께 1.0 cm x 30 cm 유리 착 색 인쇄기 열, PBS 씻어 열을 추가 합니다. 회전율 마 개를 열고 열을 배출. 열에 드 기름된 구슬의 슬러리를 추가 세척, 다음. 열은 약 24 cm의 비드 높이에 포장 될 때까지 지속적으로 슬러리를 추가 합니다.
  3. 열에는 '머리' 약 4-5 cm의 PBS의 위에 포장된 구슬, 다음 단계를 준비 해야 합니다.
    1. 1-2 피트 열의 상단 선반에 도달 하 고 아래쪽 열에 삭제 하 고 열의 상단에 반환 하는 루프를 만들 정도로 오래 튜빙의 조각을 측정 하 여 중력 흐름 사이 펀을 만듭니다. 튜빙의 한쪽을 떠나 튜브의 한쪽 끝에 이직 스 토퍼를 추가 합니다. PBS 및 열 위의 선반에 500 mL 병으로 오픈 튜브 끝을 놓습니다.
    2. 회전율 스 토퍼와 함께 끝을 10 mL 주사기를 연결 합니다. 배관 라인에 이직 스 토퍼 밸브 열고 튜브를 통해 PBS를 그립니다. PBS에는 튜브를 통해 방법의 3/4에 도달 했습니다, 일단 신속 하 게 주사기를 제거 하 고 열의 상단에 이직 스 토퍼 추가-액체는 열에 실행 되어야 합니다.
      참고: 열 상단 왼쪽 PBS의 '머리'의 금액은 1, 3 cm 사이 이어야 한다. 씻어 열을 최소한 3 열 볼륨입니다.
  4. 그것의 분자량 (MW)에 따라 지질에 연결 될 단백질 (두더지)의 금액을 결정 합니다.
    참고: 염소 반대로 마우스 IgM의 Fab 조각 (자체는 IgG)는 B 세포의 polyclonal 자극에 대 한 보편적인 대리 항으로 여기. 따라서, 염소 IgG의 Fab 조각 약 48 kiloDalton (kDa)의 MW는, 1.3 밀리 그램의 총 수량에서 상업적으로 사용할 수 있습니다. 따라서, 연결 하는 단백질의 양은 27.1 µmol 이다.
  5. 관심사의 단백질의 소멸 계수를 결정 합니다. 280에서 단백질 흡 광도 측정 하는 경우 알 수 없는, nm를 분 광 광도 계는 A280 두더지의 수에 의해 계산 단계 1.4에서에서 분할을 사용 하 여.
    참고: 멸종 280에 IgG 염소의 팹의 계수 nm 64,600 M-1이다.
  6. 그 추적을 보장 하기 위해 아민이 포함 된 양의 버퍼 제거, desalt 단계 1.1-1.3에서에서 만든 열에 단백질 및 단백질 분수 1.5 mL microcentrifuge 튜브 (분수 당 ~ 500 µ L)으로 수집.
    1. 회전율 스 토퍼 밸브는 칼럼의 상단에 연결 된 고 열의 상단을 제거 합니다. 아니라면 이미, 열에의 하단에 회전율 마 개 밸브를 열고 열고 PBS의 '머리' 구슬의 상단을 안타 때까지 기다립니다.
    2. 천천히 추가 관심사의 단백질에는 유리를 사용 하 여 구슬의 상단에 파스퇴르 피 펫, 구슬의 상단에 방해를 최소화 하기 위해 주의 되 고.
    3. 일단 단백질 해결책의 '머리'에 구슬의 상단에 도달 했습니다, 추가 1 mL의 PBS 부드럽게 통해 파스퇴르 피 펫. 세 번 반복 합니다. PBS를 4-5 cm의 머리 만들고 반복 단계 1.3 씻어 열을 추가 합니다.
      참고:이 단계 라면 없는 아민을 포함 하는 버퍼는 현재 특정 생략 될 수 있습니다.
  7. A280 값을 측정 하 여 단백질을 포함 하는 분수를 결정 하 고 분수는 단백질의 약 90% 복구를 주는 수영장.
    참고:이 일반적으로 단백질 1.5 2 배를 dilutes. 풀링 후 단백질 농도 결정 합니다. 원심 집중 장치를 사용 하 여 필요한 경우이 단계에서 단백질을 집중 한다.
  8. 2.5 어 금 니 동등 물 heterobifunctional crosslinker의 단백질을 추가 합니다.
    1. 첫째, 무게 약 5 mg succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) 프로 피 온 산 (SPDP, MW = 314 g/mol) microcentrifuge 관으로. 해산 하는 SPDP, 분자량 단백질 농도가지고 고 250 x 2.5 어 금 니 과잉 반응에 줄 것 이다 100 x 솔루션을 생성 하기 위해 그것을 곱하면 볼륨을 결정 합니다.
      참고: 예를 들어 경우 단백질 농도 50 µ M, 12.5 m m에 SPDP의 솔루션은 필요 합니다. SPDP의 5 mg,이 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)의 1.27 mL에 해당합니다.
  9. 1: 100 희석에 관심사의 단백질에 SPDP를 추가 합니다. 약 1 시간에 대 한 실 온 (RT)에서 진동 통에 반응을 놓습니다.
  10. 초과 SPDP를 제거 하 고 생 이황화 bond(s) 후속 감소 단계에서 단백질에서 보호, equilibrate, 및에서 만든 열을 씻어 단계 1.1-1.3에서 100 mM 아세트산 나트륨 (NaOAc) pH 5.5에서 만들거나 사용을 위해서 동일한 열이 버퍼입니다.
  11. 후에 SPDP 가진 1 시간 외피, desalt 100mm NaOAc에에서 equilibrated 열에 단백질. 수행이 단계는 동일한 방식으로 단계 1.6 eluent는 100mm NaOAc (pH 5.5)을 사용 하 여 제외 하 고. 분수를 수집 하 고 결정 A280, 수영장 가기 분수. PBS에 열의를 씻으십시오.
  12. DTT의 2.5 M의 솔루션을 준비 (MW = 154 g/mol) 더블에 증류수 (ddH2O). 5-10 분에 대 한 단백질의 풀링된 분수를 25 mM DTT를 추가 합니다.
  13. 단백질의 A280 을 측정 하 고 소멸 계수 이것을 나누어. 또한, A343결정 합니다. 단백질 (280)와 링커 (343)의 몰에 따라 연결 비율을 계산 합니다.
    Nanodrop 분 광 광도 계를 사용 하는 경우 참고: A340 자동 보정을 해제 합니다. A343 측정 피리 딘 2-thione 그룹의 흡 광도 나타냅니다 (소멸 계수 = 7550 M-1) 그는 DTT에 의해 SPDP cross-linker에서 제거. 링커의 어 금 니 비율: 단백질의 넓은 범위에 SDPD의 2.5 어 금 니 과잉을 가진 반응을 수행할 때 1.2-1.5의 단백질 비율은 일반적으로 가능.
  14. 위에서 설명한 대로 PBS로 세척 열 풀링된 분수를 실행 합니다. 분수를 수집 하 고 결정 A280, 최고 분수 수영장. 분수를 풀링 후 A280에 의해 단백질의 농도 결정 합니다.
  15. DSPE 말뚝 준비 Maleimide (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000)-(2000)-Maleimide. 이 10:1 어 금 니 비율에서 단백질에 추가 될 것입니다. 원하는 농도 달성 하기 위해 (2000)-Maleimide DSPE-말뚝의 100 배 재고를 준비 합니다.
    1. 예를 들어 단백질 농도 1.14 단계 후 10 µ M, (2000)-Maleimide 10 m m DSPE-말뚝의 재고를 준비. 신중 하 게 DSPE 말뚝 밖으로 무게, (2000)-Maleimide (MW 3000 g/mol =) DMSO의 적절 한 금액을 추가. Sonicating 부드러운 vortexing의 여러 라운드는 완전히 해산 그것을 얻을 수 있습니다.
  16. 단계 1.14에서에서 분수의 총 볼륨을 확인 하 고 둥근 바닥 플라스 크 (RBF) 작은 (10-25 mL)에 신중 하 게 솔루션을 전송. 100의 적절 한 금액을 추가 DSPE-말뚝 (2000)-Maleimide 단백질에 1 x 10 어 금 니 과잉, 최종 농도 달성 하기 위해 x. 부드럽게는 DMSO 완전히 분산 되도록 솔루션을 소용돌이 친다.
  17. 봉인 된 RBF에 반응 질소에서 하룻밤을 실행 합니다. 고무 격 막 사용 하 고 증기 두건에.
    1. 진공 청소기에 부착 된 튜브의 끝에 3 mL 주사기에 부착 된 20 G 바늘으로 심장 puncturing 의해 분위기를 제거 하 고 진공 3-5 s에 대 한 설정.
    2. 질소 분위기를 바꿉니다. 채우기는 풍선 질소로 반으로 잘라 3 mL 주사기에 부착 하 고 20 G 바늘을 연결 합니다. 찔린 질소와 둥근 바닥 플라스 크 내부의 분위기를 채우기 위해 심장 합니다. 분위기와 질소로 교체 한 번 더의 제거를 반복 하 고 두고 하룻밤 사이 연결 된 질소 풍선.
  18. (에 의하여 단계 1.1-1.3) 1.0 c m x 50 c m 유리 착 색 인쇄기 열에 4000-150000 Da의 분류 범위와 별도 교차 연결 된 dextran 젤 비드 열을 준비 합니다.
  19. 다음 날, 준비 단계 1.17 실행 (수행 단계 1.6에서에서 사용 되는 방법)에서 둥근 바닥 플라스 크에서 단백질 제거 (1.18 단계)에서 복사해올된 dextran 젤 비드 열.
    참고: 열에 로드 총 금액 2 mL 더 이상 이어야 한다. 더 큰 반응을 사용 된 경우 두 개로 분할할 별도 열에 실행 하거나 큰 직경 열에서 실행.
    1. 분수를 수집 하 고 A280, 수영장 가기 분수, 결정 단백질의 농도 결정 합니다. 지질의 존재는 측정에 영향을 미치지 않습니다.
  20. 사용할 준비까지 4 ° C에서 단백질 지질 연결의 최종 풀링된 분수를 저장 합니다.

2. liposome 준비

  1. 지질 개 무게: DSPE-PEG(2000) (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000, MW = 2805.5 g/mol; 콜레스테롤 (3b Hydroxy-5-cholestene, 5-Cholesten-3b-ol) MW = 386.7 g/mol; 그리고 DSPC (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), MW = 790.1 g/mol. 만들기 DSPC, 콜레스테롤, 4 mg/mL 해결책 및 클로 프롬에 DSPE-PEG(2000)의 2 mg/mL 해결책의 5 mg/mL 해결책.
  2. 지질은 리에서의 어 금 니 비율 인지 확인: 57 %DSPC, 38% 콜레스테롤, 및 5 %DSPE-PEG(2000), 표 1에 표시.
    참고: 그것은 일반적으로 0.01-0.1에서 범위 liposome에 항 원의 양을 제어 해야 %. 표 1, 염소 반대로 마우스 IgM 팹 조각 PEGylated 지질에 연결의 0.1%를 사용 합니다. (2000)-Maleimide 단계 PEGylated 지질의 총 금액 5%를 초과 하지 않습니다 1.15에서에서 단백질에 추가 된 DSPE 말뚝의 초과 10 모 랄의 고려해 야 할 중요 하다.
  3. 돌출에 대 한 지질을 만들 때 최종 지질 금액을 (µmol)를 고려 하십시오. 1.25 µ M 총 지질 농도에 리의 창조에 대 한 어 금 니 지질 농도 계산의 예를 들어 표 1 을 참조 하십시오.
  4. 각 지질을 함께 추가할 수의 정확한 금액을 계산 하는 일단 모두 12 mL 붕 규 산 유리 시험관에 결합.
  5. 신중 하 게는 클로 프롬을 날 려.
    1. 바늘, 준비 단계 1.17.1, 신중 하 게 질소 튜브에 클로 프롬을 버릴 관과 3 mL 주사기를 사용 합니다. 다른 손으로 튜브를 회전 하는 동안 솔루션에 질소의 흐름을 가볍게 불어. 튀는 하거나 다음 단계에서 솔루션으로이를 더 어려울 수 있습니다 튜브의 측면을 방식으로 실행 하려면 액체를 최소화 하기 위해 주의 해야 합니다.
  6. 각 관에 DMSO의 100 µ L을 추가 하 고이 솔루션을 하룻밤 사이 lyophilize. 고무 밴드와 함께 안전한 정적 실험실 삭제 기능으로 튜브의 상단을 커버 하 고 동결-80 ° c.

3. liposome 압출

  1. 지질을 포함 하는 12 mL 튜브에 지질 연결 단백질을 포함 하는 PBS의 1 mL를 추가 합니다. 약 30에 대 한 솔루션을 sonicate 쥡니다 물 욕조에 1 분 s. 각 라운드 사이 5 분 이상 휴식 하 고 3-4 회 반복.
  2. 제조업체 지시에 따라는 압출 기를 준비 합니다.
    1. 내부 막 지원 필터 지원 추가, 파라핀 영화에 PBS의 몇 방울 (10 µ L 각)의 장소. 핀셋을 사용 하 여, 필터 지원의 가장자리를 잡아와 10 µ L 드롭에서 그것을 찍어.
    2. O-링 안에 있는 필터를 놓습니다. 이렇게 양쪽 모두에 대 한. 핀셋을 사용 하 여 가장자리에 0.8 µ m 필터를 잡아와 10 µ L 드롭에서 찍어와 PBS와 링의 외부 코트. 장소 0.8 µ m 필터 부드럽게 o-링에 필터 내부 막 지원 중단 이상 하지 않습니다.
  3. 압출 기 난방 블록을 미리 압출이 열 하는 뜨거운 접시에 놓습니다. 낮은에 핫 플레이트를 전환 하 고 원하는 온도 도달 압출 기 난방 블록을 허용 합니다. 단백질 집계의 잠재적인 문제를 방지 하려면 블록 과거 37 ° c.가 열 하지 마십시오
  4. 압출 기에 압출 주사기 중 하나로 sonicated 샘플을 로드 합니다. 압출 기의 다른 쪽 끝으로 압출 기 주사기를 놓습니다. 빈 주사기 플런저는 0으로 설정 되어 있는지 확인 합니다. 빈 주사기는 지질 폴 리 카보 네이트 0.8 µ m 막 통해 압출로 채울 것입니다. 앞뒤로 막 통해 거품을 전달 하지 않도록 하십시오.
  5. 완벽 하 게 조립된 압출 기 난방 블록에 놓습니다. 부드럽게 빈 주사기에 지질으로 채워진된 주사기의 플런저를 밀어. 지질 농도 따라이를 밀어 어려울 것 이다. 20 x를 반복 합니다.
  6. 열 블록에서 완벽 하 게 조립된 압출 기를 제거 합니다. 천천히 압출 기에서 채워진된 주사기를 제거, 제거 밖으로 누출 수 있습니다 어떤 지질을 수집 해야 합니다. 깨끗 한 유리병에 리를 놓습니다. 반복 단계 3.4-3.6을 사용 하 여 폴 리카 보 네이트 0.2 µ m와 0.1 µ m 세포 막.
  7. 메가 Daltons (MDa) PBS에 equilibrated 0.7-10의 분리 범위 0.7 x 50 cm2 복사해올된 agarose 구슬 열을 만듭니다. 에 리를 추가 하 고 단계 1.6에서 실행. 분수 포함 하 리 250-400 nm 범위에 빛의 전송을 감소 것입니다.
  8. 4 ° C에서 리를 저장 하 고 꼼짝 하지 마십시오.

4. 칼슘 유출 항 원 리에 의해 B 세포 활성화를 모니터링 하

  1. 기관 표준 운영 절차에 따라 이산화탄소 (CO2) 또는 isoflurane 과다, 마우스를 안락사. 자 궁 경부 전위에 의해 쥐의 안락사를 확인 합니다.
  2. 수술 악기와 마우스 시체 70% 에탄올을 사용 하 여 소독. 사용 10 ㎝, 길이 0.8 m m 팁, 아이리스 포 셉 흉 흉 곽에서 다루는 피부를 분리 곡선. 10 cm 오랫동안, 바로 해 부가 위를 사용 하 여 양측 절 개를 가진 원심 절 개를 만들기 위해.
  3. 복 부 구멍에서 비장 추출 곡선된 아이리스 포 셉과 해가 위를 사용 합니다. 비장을 둘러싼 지방 조직을 제거 하 고 RPMI1640 중간 포함 1% 태아 종 아리 혈 청 (FCS), 그리고 페니실린-스 가득 15 mL 폴리스 티 렌 원뿔 튜브에 배치.
  4. 전송 비장 및 40 µ m 셀 스 트레이너를 통해 미디어 50 mL 원뿔 튜브에 장착. 3 mL 주사기 플런저의 고무 끝을 사용 하 여, 부드럽게 비장 호감. 미디어와 40 µ m 셀 여과기를 세척. 지방 조직만 40 µ m 셀 스 트레이너에서 남아 때까지이 과정을 반복 합니다. 씻어 증가 세포 복구 미디어의 3-5 mL와 체.
  5. 실시간에서 5 분에 대 한 300 x g 에서 셀 homogenate 원심 원심, 후는 상쾌한 삭제 하 고 펠 릿을 1 x RBC 세포의 용 해 버퍼의 10 mL를 추가 합니다. 위쪽 및 아래쪽 플라스틱, RT에 2-3 분 두고 실시간에 5 분에 대 한 300 x g 에서 원심
  6. 삭제는 상쾌한 고 미디어 10 mL에 고갈 적혈구 splenocytes를 resuspend. 총 세포 수는 hemocytometer 또는 다른 셀 계산 장치를 사용 하 여 결정 합니다. 위에서 설명한 대로 셀을 원심 분리 하 여 작은.
    참고: splenocytes의 이상적인 최종 농도 인도 1 로드에 필요한 10-20 mL/106 셀, x 이지만 셀의 낮은 농도 사용할 수 있습니다.
  7. 15 x 106 셀/mL 로드 버퍼 (RPMI1640 매체 1 %FCS, 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 산 (HEPES), 1 m m 염화 마그네슘 (MgCl2), 1 m m 에틸렌 글리콜-두번째 (를 포함 하는 칼슘 유출에에서 splenocytes resuspend Β-aminoethyl 에테르)-N, N, N', N'-tetraacetic 산 (EGTA), 그리고 5% 페니실린-스). 1.5 µ M에 추가 인도-1 1 mM DMSO 재고 솔루션에서 반전 튜브를 섞어 여러 번. 빛에서 보호 하 고 30 분 동안 37 ° C 물 탕에서 세포를 품 어.
  8. 30 분 부 화에 따라 칼슘 유출 버퍼 로드의 금액 x 5에 추가 합니다. 실시간에서 7 분 동안 300 x g 에서 원심 분리기
  9. B 세포에 게이팅에 대 한 셀 1: 200 안티 마우스 CD5-PE와 반대로 마우스 1: 200 B220-PE/Cy7 4 ° c에서 20 분, 빛 으로부터 보호에 대 한 버퍼를 로드의 0.5 mL에 얼룩.
  10. Splenocytes 칼슘 유출 로딩 버퍼 및 실시간 Resuspend 셀 (행 크의 균형 소금물 (HBSS) 1 %FCS, 1 mM MgCl2 와 1를 포함 하는 버퍼를 실행 하는 칼슘 유출에 106 셀/mL x 10-20에서 7 분 동안 300 x g 에서 원심 분리기에서 세척 칼슘 염화 (CaCl2)). 교류 cytometer에서 실행할 준비가 될 때까지 빛에서 보호, 얼음에 저장 합니다.
  11. 보상에 대 한 흠 없는 하나의 얼룩 컨트롤과 cytometry 설치.
    1. ( 그림 2A참조) 문을 적절 하 게 설정 하는 스테인드 셀을 실행 합니다. 인도-1 (바이올렛) 대 인도-1 (파란색) 음모를 설치의 45-60 ° 신호를 최대화 하기 위해 경사에 얼룩이 지는 세포를 인도-1 채널에서 전압 조정: 인도-1 바이올렛의 잡음 비율: 비율 B 세포 자극 다음에 블루 변경.
      참고: 전압이 너무 높은 인지 확인 되도록 셀의 상당한 비율 (> 5%)는 플롯의 상단에 반대는.
    2. 만들고 대각선 게이트는 플롯의 상단 왼쪽된 부분 (바이올렛+블루-)를 캡슐화 하는 자극 없이 < 셀의 10%가 이상적으로 증가 해야 게이트 > 자극에 따라 75%.
  12. 셀의 0.5 mL 하단 폴리스 티 렌 튜브 (형광 활성화 셀 정렬 (FACS) 튜브) 라운드 출장된 5 mL을 추가 하 고 따뜻한 물 욕조에 3-5 분 동안 37 ° C에 셀. 다시 순환 물 욕조에 연결 된 37 ° C water-jacketed 챔버에 FACS 튜브를 놓습니다.
    1. 튜브를 실행에 교류 cytometer에 water-jacket 및 약 5000-10000 이벤트/s에서 데이터를 저장 하지 않고 수집, 시작. 셀 (15-30 s) 안정, 일단 적어도 10에 대 한 데이터 수집 및 수집 데이터 시작 배경을 설정 하는 s.
    2. 10 s 마크에서 신속 하 게 교류 cytometer에서 튜브를 제거, 자극 (2-20 mL에 항 원 리 5-50 m m), 펄스 소용돌이, 더하고 교류 cytometer에 FACS 튜브를 반환. 데이터 수집 및 저장이이 시간을 통해 유지 하 고 3-5 분에 대 한 데이터를 수집.
  13. 활동 기능에서 적절 한 분석 소프트웨어에서 데이터를 분석 합니다.

5입니다. 땅콩 추출의 준비

  1. 1 M 염화 나트륨 (NaCl)를 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)의 1:5 (wt:vol) 비율에 땅콩 가루를 혼합 하 여 땅콩 단백질을 추출 합니다. PH 8.5에서 유지 하면서 2 h RT에 대 한 자기 저 어 접시에 솔루션을 믹스.
  2. 4 ° c.에 45 분 동안 3000 x g 에서 원심 분리기 솔루션 가만히 따르다 하 고 필터-소독 상쾌한 순차적으로 0.2 µ m 필터 다음 0.4 µ m 필터를 통해. Bicinchoninic 산 (BCA) 분석 결과 표준으로 소 혈 청 알 부 민 (BSA)를 사용 하 여 단백질 농도 결정 합니다.
  3. 감소 하 고 최대한 활동 원제와 10 분 동안 70 ° C에서 열 수 있는 8.4, pH에 리튬 라우릴 황산을 포함 하는 버퍼에 샘플 50 m m dithiothreitol (DTT)와 함께 땅콩 단백질의 변성.
  4. 분자량과 그라데이션 젤 미리 표준 스테인드 최적의 분리를 제공 하도록 설계 된 두번째-트리 스 4-12% precasted polyacrylamide 젤에 변성된 땅콩 단백질의 10 µ g를 실행 합니다.
  5. Disulfonated triphenylmethane와 젤을 얼룩이 고 ddH2O. 식별 주요 땅콩 알레르기 Ara h 1, 2, 3 추출 준비에 알려진 destain. Ara h 1 63 kDa에, Ara h 2 17 및 19 kDa에서 2 개의 isoforms로 나타납니다 나타나고 Ara h 3 37 kDa (산 성 소 단위)에서 나타납니다.

6입니다. 땅콩을 쥐의 민감성

  1. 1 mL 초순에 1mg 콜레라 독 소 resuspend 200 µ L 희석 땅콩 추출 포함 2 mg 땅콩 단백질 및 PBS에 10 µ g 콜레라 독 소를 준비 합니다.
  2. 콜레라 독 소 (2 mg 땅콩 단백질 및 10 µ g 콜레라 독 소)를 통해 구강 각 4-5 주 오래 된 BalB/cJ 여성 마우스를 포함 하는 땅콩 추출의 200 µ L를 관리 합니다. 3 주 (즉, 일 0, 7, 14)에 대 한에 일주일에 한 번 반복 합니다.
  3. 4 주 (즉, 주 21)에서 각 마우스를 300 µ L 희석 땅콩 추출 (5 mg 땅콩 단백질 및 10 µ g 콜레라 독 소 포함)을 통해 구강을 관리 합니다.

7. 도전 생쥐 땅콩 추출

  1. 28 일에 PBS에 1 mg/mL의 최종 농도에 땅콩 추출 준비. 직장 온도계 (약 37.5-38.5 ° C)를 사용 하 여 기준 체온을 측정 합니다. 땅콩 추출 통해 복 (i.p.) 주입의 200 µ L (200 µ g)를 관리 합니다.
  2. 측정 온도 직장 온도계로 1 시간에 15 분 마다 주입 후. 체온에 딥 땅콩에 알레르기를 나타냅니다.
    참고: 저체온증 쥐에서 알레르기의 특징 이다. 이 문제는 마우스는 땅콩에 알레르기가 시연할 예정 이다. 일반적으로, 민감성 프로토콜을 받아야 Balb/cJ 쥐의 90% 동안 적어도 2-3 ° C 온도 저하에 의해 특징 도전 알레르기 반응을 개발.

8. 알레르기 마우스 및 입양 전송에서 Splenocytes의 격리

  1. 순진한 땅콩 알레르기 생쥐에서 splenocytes를 격리 합니다.
    1. 30 일에 가스 실에서 CO2 의 3 L/min을 투여 하 여 순 진하고 확정된 땅콩 알레르기 생쥐를 안락사. 양자 thoracotomy 여 쥐의 안락사를 확인 합니다. 수술 악기와 마우스 시체 70% 에탄올을 사용 하 여 소독. 집게를 사용 하 여 흉 곽에서 흉을 취재 하는 피부를 분리. 바로 해가 위를 사용 하 여 왼쪽 및 오른쪽 갈비뼈를 깨는 양자 절 개를 만들기 위해.
    2. 복 부 구멍에서 비장 추출를 집게와 해가 위를 사용 합니다. 10 mL RPMI 1640 매체 가득 폴리스 티 렌 15 mL 원뿔 튜브에 배치 하기 전에 비장을 둘러싼 지방 조직의 제거.
    3. 살 균 층 류 두건에 35mm 폴리스 티 렌 페 트리 접시에 비장 및 미디어를 붓는 다. 순진한 및 알레르기 splenocytes 별도 접시에 미디어 셀 격리 하는 동안 계속. 소독된 집게와 해가 위를 사용 하 여를 세 조각으로 비장을 잘라 Petri 접시.
    4. 두 개의 유리 현미경 슬라이드의 거친, 두르고 가장자리를 사용 하 여 부드럽게 균질 (RPMI)에 비장 조각 흰색 조직 슬라이드 사이 남아 때까지. 그룹 사이 슬라이드를 변경 합니다.
    5. 50 mL 원뿔 튜브에 장착 되어 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 배양 접시에서 셀 homogenate를 전송. 나머지 비장 파편을 1 mL 주사기에서 플런저와 여과기에 통과. 체 세포 복구를 최대화 하기 위해 RPMI의 5 mL로 씻어. 폴리스 티 렌 15 mL 원뿔 튜브, 그리고 원심 분리기 (450 x g, 10 분, RT)에 여과 액을 전송.
    6. 상쾌한 발음을 2 mL 붉은 혈액 세포 세포의 용 해 버퍼 (0.83% 염화 암모늄 10 mM Tris 버퍼, pH 7.2)에서 resuspend 셀 펠 릿을 추가 합니다. 혼합 하 고 2-3 분 추가 10 ml PBS-2 %FBS 및 실시간에 7 분에 대 한 300 x g 에서 원심 분리기의 RT에서 품 어
    7. 세포를 씻어 다시 RPMI 1640 매체의 2 ml에서 PBS-2 %FBS 완전히 제거 어떤 잔여 염화 염화 물, 실시간 다시 중단 셀에서 7 분 동안 300 x g 에서 원심을 작은 공의 12 mL와 함께. Hemocytometer 또는 자동 혈액학 분석기를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.
  2. 15 x 106 알레르기 또는 추출 (200 µ L)에서 위에서 설명한 대로 순 splenocytes 정 맥 주사 27 G, 1 mL 인슐린 주사기에 5/8 인치 바늘을 사용 하 여 통해 꼬리 순 (unsensitized) 쥐에 정 맥.

9. Ara h 2 항 원 리와 쥐의 주입

  1. 포함 된 2.5 m m 지질에서 0.1% Ah2 Ah2 리를 준비 합니다. 단백질 농도 계산, Ah2 소멸 계수 15000 M-1이다. 리 메 마른 PBS에서 300 µ m을 희석.
  2. 알레르기의 입양 전송 (31 일) 후에 1 일 또는 순 splenocytes 정 맥 주사 Ah2 통해 단계에는 splenocytes를 받은 BALB/cJ 쥐의 꼬리 정 맥의 1.38 µ g의 총 포함 된 PBS 또는 Ah2 항 원 리 (300 μ M)의 200 µ L 8.2입니다.

10. 부스트와 Ara h 2와 쥐의 도전

  1. 45, 당일 Ah2 리와 주입 후 2 주 4mm 동물 첨 두를 사용 하 여 마우스의 submandibular 교차로에서 50-200 µ L의 혈액을 수집. 헤 파 린; 없이 혈 청 분리기 관에서 혈액을 수집 별도 centrifuging 6000 x g 15 분 대에 의해 혈 청 측정 항 원 특정 항 체 나중에 수집 된 혈 청을 사용 합니다.
  2. 하루 46, 2 주 후 쥐 리 (단계 9.2) 주입에 PBS의 200 µ L 또는 녹는 Ah2 (앞에서 설명한16정화)의 200 µ g의 i.p. 주입 하 여 쥐를 향상.
  3. 60 일에는 마우스의 submandibular 교차로에서 50-200 µ L의 혈액을 수집 하 고 앞에서 설명한 혈액을 처리 합니다.
  4. 61 일에 도전 300 µ g의 200 µ L의 i.p. 주사와 쥐의 각 그룹 수용 성 Ah2. 7에서 15 분 마다 직장 프로브 체온을 측정 합니다.

11. Ara h 2 전용의 정량화 IgE 및 IgG1 ELISA에 의해

  1. 96-잘 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA) 코트-100 µ L 호환 판 HSA-DNP (2, 4-dinitrophenyl hapten 활용된 인 혈 청 알 부 민, 20 µ g/mL) 표준 곡선 또는 Ah2 (5 µ g/mL)에 희석 하는 혈 청 샘플 수집 단계 10.1와 10.3, 대 한 4 ° C 하룻밤 또는 37 ° C에서 코팅 버퍼 (50 m m 탄산-중 탄산염 버퍼, pH 9.6) > 1 h.
  2. 200 µ L로 세 번 세척 PBS-T (0.05%와 PBS 트윈-20) 200 µ L PBS T 포함 된 웰 스를 차단 하 고 37 ° C에서 2 %BSA > 2 h.
  3. Ah2 특정 IgE ELISA, 추가 50 µ L IgE-안티-DNP 표준 (2-0.002 µ g/mL, 1:2 직렬 희석에서 준비) 또는 마우스 혈 청 샘플 (1시 20분 희석)와 4 ° c.에서 밤새 품 어 Ah2 특정 IgG1 ELISA, 100 µ L 정화 IgG1-안티-DNP 기준 추가 (2-0.002 µ g/mL, 1:2 직렬 희석에서 준비) 또는 혈 청 샘플 (1: 500 희석) 마우스와 4 ° C 또는 37 ° c.에서 1 h에서 밤새 품 어
  4. 200 µ L로 세 번 세척 PBS. Ah2 특정 IgE ELISA, 추가 100 µ L 양 반 마우스 IgE (0.5 µ g/mL)와 1 시간 동안 37 ° C에서 품 어. Ah2 특정 IgG1 ELISA, 추가 100 µ L HRP 염소 반대로 마우스 IgG1 (희석 PBS-T-2 %BSA 1:40,000). 1 시간 동안 37 ° C에서 품 어.
  5. 200 µ L로 세 번 세척 PBS. Ah2 특정 IgE ELISA, 추가 100 µ L biotinylated 당나귀 항 양 (0.5 µ g/mL) IgG 및 45 분 동안 37 ° C에서 품 어. Ah2 특정 IgG1 ELISA에 11.7 단계로 건너뜁니다.
  6. 200 µ L로 세 번 세척 PBS. Ah2 특정 IgE ELISA를 위해 100 µ L 중립으로 위탁 avidin-양 고추냉이 과산화 효소 (예를 들어, NeutrAvidin-HRP, 0.3 µ g/mL)을 추가 하 고 30 분 동안 37 ° C에서 품 어.
  7. 100 µ L 3, 3', 5, Tetramethylbenzidine (TMB)-5' 기판, 10-15 분을 품 어 더하거나까지 샘플 차례 진한 파란색, 다음 100 µ L TMB 정지 솔루션을 추가 합니다. 450에 접시를 읽고 nm.

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결과

DSPE-PEG(2000) 가진 관심사의 단백질의 활용을 줄이는 증가에서 보여주는 결합형된 단백질에 비해 분자량을 실행 하 여 설명할 수 있습니다. 그림 1A 반대로 마우스 IgM F(ab) 조각 활용의 대표적인 젤 못-DSPE, 변성된 단백질에 대 한 2-3 kDa bandshift를 보여주는 표시 됩니다. 단백질의 약 50%를 수정할 수는 1:1 산출할은 무 겁 고 가벼운 체인의 heterodimer Fab 조각에 달성 했다 그 예상은 나타나는 note. 그림 1B Ah2 활용의 대표적인 젤 못 DSPE 표시 됩니다. B 세포의 칼슘 플럭스를 평가 하기 위해 항 원 리에 의해 자극 두 가지 중요 한: (1) 악기 설정을 캘리포니아2 + 에서 인도-1 형광의 차이 (바이올렛) 바운드 및 언바운드 폼 (파란색)과 (2) 적절 한 참조를 조정 된다...

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토론

여기에 설명 된 메서드는 자주 나노 입자에 단백질의 디스플레이 가능 하 게 지질에 단백질의 활용에 대 한 일반적인 프로토콜. 매우 큰 다중 소 단위 단백질을 위해이 프로토콜 유틸리티를 제한 할 수 있습니다. 이상적인 방법은 biorthogonal 화학 연결 전략을 사용할 수 있도록 특정 태그의 소개 것입니다. Recombinantly 단백질을 표현 하는 경우 PEGylated 지질 상업적으로 사용할 수 있는 끝에 사용할 수 있는 사이트 전략17, 그리고 다양 한 기능 그룹을 사용 하 여 수 있습니다. 따라서,이 프로토콜은 자연적인 근원에서 고립 된 단백질의 연결에 맞도록 하 고 과학자 들은 반드시에 익숙하지 화학 및 생화학 변환의 넓은 범위에 액세스할 수 있습니다.

강조를 해야 칼슘 유출 실험 실행의 핵심 측면에서 세포는 cytometry에 그들을 실행 하기 전에 활성화 되어야 한다 이다. 메 마른 기술 엄격 하 게 사용 하지 않으면,이...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

이 연구는 국방부 (W81XWH-16-1-0302 및 W81XWH-16-1-0303)에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
모델 2110 분획 분취BioRad7318122
콜레스트롤시그마C8667시그마 등급 99%
SPDPThermo Fisher Scientific21857
DSPCAvanti850365
DSPE-PEG 18:0Avanti880120
DSPE-PEG MaleimideAvanti880126
압출기Avanti6100001 mL 주사기, 홀더/가열 블록 포함
필터 0.1 &마이크로; mAvanti610005
필터 0.8 & 마이크로; mAvanti610009
10mm 필터 지원Avanti6100014
유리 둥근 바닥 플라스크시그마Z100633
턴오버 스토퍼Thermo Fisher ScientificP-301398
튜빙Thermo Fisher ScientificP-198194
Leur LockThermo Fisher Scientifick4201634503
Sephadex G50 비즈GE Life Sciences17004201
Sephadex G100 비즈GE Life Sciences17006001
열 비활성화 태아 송아지 혈청Thermo Fisher Scientific10082147
HEPES (1 M)Thermo Fisher Scientific15630080
EGTASigmaE3889
페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
1x RBC 용해 완충액Thermo Fisher Scientific00-4333-57
Indo-1InvitrogenI1203
CD5-PEBioLegend100608
B220-PE-Cy7BioLegend103222
HBSSThermo Fisher Scientific칼슘 및 마그네슘 없는
MgCl2SigmaM8266
CaCl2SigmaC4901
Fab 안티-마우스 IgMJackson ImmunoResearch115-007-020
F(ab')2 안티-마우스 IgMJackson ImmunoResearch115-006-020
땅콩 가루Golden Peanut Co.52127112% 지방, 가벼운 로스트, 50% 단백질
동물 먹이 바늘Cadence Science792022g x 1.5", 1.25mm - 스트레이트
마이크로프로브 온도계PhysitempBAT-12
생쥐용 직장 프로브PhysitempRet-3
콜레라 독소, from Vibrio choleraList Biological Laboratories, Inc.100B아지드가 없는
BCA 단백질 분석 키트Pierce23225
탄산염-중탄산염 완충액SigmaC3041
TMB 정지 용액KPL50-85-06
SureBlue TMB Microwell Peroxidase SubstrateKPL5120-0077
96웰 Immulon 4HBX 플레이트Thermo Scientific3855
용해성 Ara h 2N /A N / A같이 정제 : Sen, et al., 2002, Journal of Immunology
HSA-DNPSigmaA-6661
Mouse IgE anti-DNPAccurate ChemicalBYA60251
Sheep anti-Mouse IgEThe Binding SitePC284
Biotinylated Donkey anti-Sheep IgGAccurate ChemicalJNS065003
NeutrAvidin 단백질, HRPThermoFisher Scientific31001
마우스 IgG1 안티 DNP정확한 화학 물질MADNP105
HRP 염소 안티 마우스 IgG1Southern Biotech1070-05
1 mL 인슐린 주사기BD329412U-100 인슐린, 0.40 mm (27 G) x 16.0 mm (5/8")
Superfrost 현미경 슬라이드Fisher Scientific12-550-1425 mm x 75 mm x 1.0 mm
ACK 용해 버퍼gibco by Life TechnologiesA10492-01100 mL
RPMI 1640 MediumThermo Fisher Scientific11875093500
mL Cell StrainerCorning35235070 μ m 나일론, 화이트, 멸균, 개별 포장
NuPAGE 4-12% Bis-Tris 단백질 겔InvitrogenNP0322BOX10 gels
NuPAGE LDS buffer, 4xInvitrogenNP0008250
mL SeeBlue Plus2 Pre-stained standardInvitrogenLC5925500 µ L
NuPAGE MES/SDS 러닝 버퍼, 20xInvitrogenNP0002500 mL
GelCode BlueStain Thermo Scientific24590500 mL
기 , 14170112정제 된 다음과

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