자발적으로 계약 syncytia cardiomyocytes 인간 유도 만능에서 파생 된의 줄기 세포는 인간의 심장 생리학 및 약리학의 유용한 모델. 여기 우리는 구타 주파수, Ca-민감한 형광 염료와 온도 제어 영상 다 잘 플레이트 리더를 사용 하 여 외 인 화합물의 효과 계량 하는 높은 처리량 검열 시스템을 제시.
방법 논문
인간-iPSC 파생 Cardiomyocyte Syncytia의 수축 온도 제어 384-잘 접시에 Ca 민감한 형광 염료와 측정
이 논문에서
요약
초록
자발적으로 계약 syncytia cardiomyocytes 인간 유도 만능에서 파생 된의 줄기 세포 (hiPSC CM)는 인간의 심장 생리학 및 약리학의 유용한 모델입니다. 이 자연 스러운 활동을 기록 하 고 약물 효과 평가 하기 위해 다양 한 방법을 제안 하지만 이러한 방법의 많은 제한 처리량 그리고/또한 생리 적인 관련성에서 고통. 우리는 Ca-민감한 형광 염료와 온도 제어 영상 다 잘 플레이트 리더를 사용 하 여 hiPSC-CM의 박동 주파수에 외 인 화합물의 효과 계량 높은 처리량 검열 시스템을 개발. 우리 셀 접시와 복합 접시를 준비 하는 방법 및 높은 감도 재현성을 달성 하기 위해 자동화 된 분석 결과 실행 하는 방법을 설명 합니다. 우리는 또한 변환 하 고 자연 스러운 리듬에 대 한 약물 효과의 신뢰할 수 있는 측정을 제공 하기 위해 형광 데이터를 분석 하는 방법을 설명 합니다. 이 분석 결과 가이드에서 또는으로, 화학 최적화 화합물 인간의 심장 기능에 영향을 미치는 약물 발견 프로그램에 사용할 수 있습니다.
서론
현재 프로토콜 syncytia 순수 관련 리듬에 hiPSC cm의 자발적인 구타 주파수에 약물 효과 측정 하는 방법을 보여 줍니다. 인간 유도 만능 줄기 세포는 저절로 박동 syncytia 생체 외에서1,2,,34를 설정 하는 기능 cardiomyocytes로 차별화할 수 있습니다. 이러한 hiPSC CM 다 수 상업적인 공급자를 통해 또는 실험실에서 생산을 통해 얻어질 수 있다 그리고 그들은 인간의 심장 생리학 및 약리학의 모델을 생성 하는 세포의 유용한 소스. 특히, 그들은 예측 하거나 심장 효과 마약 인 간에5로 관리 될 때 발생할 수 있는 특성을 사용할 수 있습니다.
HiPSC CM syncytia의 구타 주파수는 microelectrode 배열 또는 임피던스1감지를 사용 하 여 생리 적 조건 하에서 측정 될 수 있다: 이러한 비 침 투 적인 기법 약물 효과에 매우 자세한 정보를 제공 하지만 그들은 오히려 낮은 처리량 그리고 그들은 현실적인 시간 및 예산 제약 내에서 큰 화합물 라이브러리를 테스트 사용 하지는 않습니다. 384 잘 형광 이미징 플레이트 리더를 사용 하 여 더 효과적인 시스템을 정교 수 Ca 민감한 염색6, 하지만 클래식 플레이트 독자 차선 온도 제어 및 수집 주파수 방해. 이러한 제한은 통상 박동 속도 (~ 15 bpm, 제어 환경135-55 bpm에 비해)에 의해 설명 되 고 가난한 Ca 신호 해상도 (8 Hz의 수집 주파수 기록 속도 120 bpm을 도달할 수 있는 한에는 조건 하에서 자극, 그리고 그것은 경사 또는 기간 등의 정보를 추출할 수 없습니다). 여기 설명 하는 방법을 이러한 문제를 배제에 충분 한 해상도 생리 적 리듬에 패턴을 가면서 녹음을 결합 합니다.
긍정적인 측면에서이 메서드는 간단 하 고 신뢰할 수 있는, 높은 처리량, 저렴 한 비용의 큰 숫자의 빠른 테스트를 수 있는. 부정적인 측면에서이 방법을 사용 하려면 비싼 투자는 효과적인 온도 제어와 빠른 플레이트 리더 고 추가 더 자세한 테스트를 할 거 수 있습니다 관찰된 약물 효과에 약간 기계 정보를 제공 합니다. 방법입니다.
Approximatively 6 x6 hiPSC-10CM 1 384-잘 셀 접시에 한 측정을 위해 필요 합니다. hiPSC CM ~ 106 셀 1 mL에 x 4의 언된 aliquots로 일반적으로 상업적으로 제공 됩니다. 따라서, 3 냉동된 aliquots와 두 셀 접시를 준비 하기 편리 하다. 대부분의 경우,이 분석 결과의 낮은 다양성 때문에 그것은 테스트 화합물의 중복 측정을 수행 하 고, 각 셀 접시에서 quadruplicate 긍정적인 컨트롤 (산림, N6-cyclopentyl-아데노신, 및 E-4031)의 측정 하기에 충분 하 고 20 plicate 부정적인 컨트롤 (혼자 DMSO)의 측량. 따라서, 최대 352 화합물/농도 쌍 두 384-잘 세포 격판덮개로 평가할 수 있습니다. 352 테스트 화합물, 두 셀 접시와 12 백만 셀 3 언된 aliquots;으로 같은 실험을 고려 하는 다음 프로토콜 추가 데이터가 필요한 경우 쉽게 수직 수 있습니다.
프로토콜
1입니다. 셀 접시의 준비
참고: 셀 접시 3-약물 효과의 측정 하기 전에 4 주를 준비 합니다.
- 실험의 하루 0
참고: 계획에 대 한 테스트 복합 응용 프로그램은 일 22-는 실험의 28 날에 수행할 수 있습니다.- 37 ° C에 물 목욕 켜고 (제조업체에서 제공)로 도금 매체의 40 mL 따뜻한.
참고: 셀을 사용 하 여 미디어와 함께 그들의 공급 업체에서 제공한 일치 문화 및 유지 보수. - 2 분 동안 물 목욕에 고정 된 셀을 포함 하는 cryotubes를 배치 하 여 hiPSC CM를 녹여.
- 50 mL 원뿔 튜브에 1ml 세포 현 탁 액을 신중 하 게 전송 합니다.
- 각 cryotube 남은 셀을 검색 하 여 단계 1.1.3 포함 된 셀에서 세척 미디어 같은 원뿔 튜브를 추가 따뜻한 도금 매체의 1 mL로 씻는 다.
- 세포 현 탁 액에 따뜻한 도금 매체의 신중 하 게 또 다른 8 mL를 혼합.
- Trypan 블루 제외 메서드와 hematocytometer8를 사용 하 여 라이브 셀을 계산 합니다.
참고: 6 x 106 의 요구 한 384-잘 셀 접시는 우리의 경험에서 최대 냉동된 셀 간에 최대 20% 죽은 세포의 가능성 고려에 대 한 세포. - 5 x 105 라이브 셀/ml 따뜻한 도금 매체와 세포 현 탁 액을 조정 합니다.
- 각 잘 (당 잘 약 12500 세포)에 25 µ L을 추가 하 여 두 384-잘 셀 접시에 세포 현 탁 액을 배포 합니다.
참고: 셀 접시 필요가 없습니다 어떤 매트릭스와 도장 수 ( 내용참조). - 포함 된 5% CO2습도 분위기에서 37 ° C에서 셀 번호판을 유지 합니다.
- 37 ° C에 물 목욕 켜고 (제조업체에서 제공)로 도금 매체의 40 mL 따뜻한.
- 실험의 주 1
- 37 ° C와 1 %v / v 페니실린 스 솔루션과 보완 유지 보수 매체의 따뜻한 50 mL에 물 목욕을 켭니다.
- 에 셀 플레이트의 각 잘 따뜻한 유지 보수 매체의 50 µ L에 도금 매체를 바꿉니다.
- 일 2-는 실험의 (27 일)까지 21
참고: hiPSC CMs 필요 하지 않습니다 어떤 뿌리고이 기간 동안은 비 분할 셀.- 3 일 유지 보수 매체의 모든 2-을 갱신 하 고 전적으로 7, 14, 21 일에 갱신.
참고: 22와 실험의 28 일 사이 형광 측정을 수행할 수 있습니다. 긴 기간이 시도 하지 않은 하지만 아직 괜찮을 수 있습니다.
- 3 일 유지 보수 매체의 모든 2-을 갱신 하 고 전적으로 7, 14, 21 일에 갱신.
2. 악기, 복합 판, 및 분석 결과 접시의 준비
참고: 악기, 복합 판, 준비 하 고 시험 접시의 22와 실험의 28 일 사이 약물 효과의 측정의 날에. 온도 제어와 적절 한 형광 필터 키트와 여기 빛 형광 플레이트 리더를 사용 하 여 소스. 예를 들어 Fluo-3/Fluo-4/Fluo-8 형광 필터 키트 사용 (여기: 472 nm; 방출: 520-560 nm) 및 150 W 여기 광원 장치.
- 적어도 2 시간 전에 첫 번째 셀 접시 플레이트 리더 측정을 위해, 안으로 배치 하는 독자를 설정 하 고 37 ° c.에 난방 시스템을 설정
참고:이 또한 전에 저녁 행 해질 수 있다. - 준비 긍정적인 컨트롤, 산림, N6-cyclopentyl-아데노신, 및 E-4031에서 DMSO, DMSO, 10 mM 및 H2O, 3.33 m m 0.33 m m 재고 솔루션으로 각각.
참고: 재고 솔루션 333-fold 희석 될 것 이다 때 그들은 셀에 추가 되 고 최종 테스트 1 µ M 산림, 30 µ M N6-cyclopentyl-아데노신, 및 10 µ M의 농도 달성 하는 목표는 안정적이 고 재현 효과 E-4031. - 333-fold는 계획 된 테스트 농도 (예를 들어, 30 µ M에서 테스트에 대 한 10 m m)에서 DMSO 재고 솔루션으로 352 시험 화합물을 준비 합니다.
참고: 목표는 복합 응용 프로그램 후 0.3% (v/v) DMSO 셀 접시에서의 최종 농도 달성 하기 위해 이것은 가장 높은 DMSO 농도 cardiomyocytes의 리듬 활동에 영향을 주지 않습니다. 재고 솔루션 하루 전에 준비 또한 수 있습니다. 재고 솔루션의 5 µ L의 최소가 각 중복 측정을 위해 필요 합니다. - 복합 플레이트를 준비 합니다.
- 따뜻한 실내 온도에 1 %v / v 페니실린 스 솔루션으로 보완 유지 보수 매체의 40 mL.
- 잘 당 재고 솔루션의 1.5 µ L을 추가 하 여 두 384-잘 복합 판으로 배포: i) 테스트 화합물 (각 2 개의 우물), ii) 긍정적인 컨트롤 (산림, N6-cyclopentyl-아데노신, 및 E-4031, 복합 플레이트 당 각 4 우물), 및 iii) 부정 컨트롤 (DMSO, 복합 플레이트 당 20 우물).
- 1 분에 100 x g 에서 복합 플레이트 원심
- 각 잘 (그 단계에서 38.5 µ L에 3.9 %DMSO)를 실 온에서 유지 보수 매체의 37 µ L를 추가 합니다.
- 1 분에 100 x g 에서 복합 플레이트 원심
- 플레이트 리더를 복합 플레이트를 로드 합니다.
참고: 다음 단계 복합 플레이트에서 증발을 최소화 하기 위해 가능 한 한 빨리 실행 되어야 한다.
- 형광 염료를 준비 합니다.
- 37 ° C와 1 %v / v 페니실린 스 솔루션과 보완 유지 보수 매체의 따뜻한 100 mL에 물 목욕을 켭니다.
- Ca-민감한 형광 염료와 항생제로 따뜻한 유지 보수 매체의 10 mL와 함께 끄는 다시 구성.
참고: Ca-민감한 형광 염료, 보통 Fluo-4, 그리고 끄는,이 주식 형광 매체 포함 하 고 어떤 남은 4 ° C에 적어도 5 일 동안 저장할 수 있습니다.
3. 데이터 수집
참고: 데이터 수집을 수행 하는 약물 효과의 측정의 날에. 같이 하십시오 3.1-.10 완전히 첫 번째 셀 접시에 대 한 다음 두 번째 셀 접시에 대 한 그들을 반복.
- (필요한 경우) 플레이트 리더 소프트웨어를 시작 하 고 로드 피펫으로 팁.
- 각 잘 기준선 박동 속도 정의 하려면 적어도 10 헤르츠의 수집 주파수 칼슘 파도 2 분 세그먼트를 기록 하는 소프트웨어 설정을 조정 합니다.
- 한 셀 접시, 형광 매체를 만들기 위해 항생제와 따뜻한 유지 보수 매체의 12 mL로 재고 형광 매체의 3 mL를 희석.
- 20 µ L을 셀 플레이트의 각 우물에서 매체의 형광 매체의 30 µ L 바꿉니다.
- 혼합 1 x 위아래 플라스틱.
- 플레이트 리더에 온도에 순응 하는 hiPSC CM 수 있도록 가능한 한 빨리 셀 접시를 놓습니다.
- 데이터 수집을 시작 하기 전에 60 분을 기다립니다.
- 기록 속도 각 잘 치고 기준선을 정의 하려면 적어도 10 Hz의 주파수 수집 캘리포니아 파도 2 분 세그먼트를 플레이트 리더 소프트웨어에서 데이터 수집을 시작 합니다.
참고: 각 기록 순서에 대 한 세포 격판덮개 전송 되지 않습니다 자동으로 장치에서 데이터 수집 후 있는지 확인. 이 실내 온도에 냉각에서 셀 접시를 방지할 수 있습니다. 플레이트 리더 소프트웨어의 일부 버전, 그것 각이 완전히 종료 되기 전에 기록을 중지 하려면 필요할 수 있습니다. - 셀 접시에 복합 플레이트에서 잘-투-잘 5 µ L를 pipetting으로 플레이트 리더 로봇 테스트 및 참조 화합물을 추가 (추가, 후 DMSO 농도 0.3% [v]).
- 캘리포니아 파도 복합 추가 후 5, 15, 30, 45, 및 60 분에 대 한 시작의 기록 2 분 세그먼트를 플레이트 리더 소프트웨어에서 데이터 수집을 시작 (있는지 확인 셀 플레이트 유지 때마다 장치에).
4. 데이터 분석
참고: 데이터 분석 측정 후 언제 든 지 수행할 수 있습니다.
- ASCII 텍스트 파일으로 플레이트 리더 소프트웨어에서 각 녹음 기간에 대 한 원시 데이터를 내보냅니다.
- 데이터 분석 소프트웨어에 원시 데이터를 가져옵니다.
- 각 잘 및 모든 시간 포인트, 기본 박동 주파수를 추출 합니다.
참고: 재료의 테이블에에서 나열 된 데이터 분석 소프트웨어와 함께 구타 주파수 산출 될 수 있다 최소 제곱법 스펙트럼 분석7의 롬-Scargle 방법에 따라 LombPeriodogram 함수를 사용 하 여 사용자 정의 분석 루틴 . periodogram 0.01 5 Hz 사이의 주파수 범위에 대 한 계산 해야 합니다. 기본 주파수는 PeakAutoFind 루틴을 사용 하 여 periodogram에서 추출할 수 있습니다. 이 분석 방법은 플레이트 리더 소프트웨어와 함께 옵션으로 제공 하는 방법 보다 주파수 구타의 더 정확한 측정을 제공 합니다. 그러나, 후자는 여전히 사용할 수 있습니다 소프트웨어 사용자 지정 옵션이 없는 경우. - 클립보드 복사 또는 ASCII 텍스트 파일로 데이터 분석 소프트웨어에서 각 녹음 기간에 대 한 기본 박동 주파수를 내보냅니다.
- 클립보드 붙여넣기 또는 텍스트 파일 가져오기 스프레드시트 소프트웨어에 기본 박동 주파수를 가져옵니다.
참고: 어떤 현대 스프레드시트 소프트웨어에서 4.9 4.5-단계를 수행할 수 있습니다. - 각 잘 표준화 기준 각 시간 지점에서 구타 주파수 약물 응용 프로그램 후 (5, 15, 30, 45, 및 60 분) 그 당시 주 박동 주파수를 나누어 주 구타 주파수 기준에 의해 포인트.
- 약물 응용 프로그램 후 각 시간 지점에서 평균 DMSO 효과 계산 (5, 15, 30, 45, 및 60 분) DMSO 적용 된 20 웰 스에 대 한 정규화 된 값을 평균 하 여.
- 각 잘 때마다 포인트 후 약물 응용 프로그램에 대 한 (5, 15, 30, 45, 및 60 분), 평균 DMSO 효과 (시간 일치 하는) 동일한 접시를 뺍니다.
- 중복 측정 평균.
참고: 화합물 주파수 변경 또는 소프트웨어 복합 추가 후 기본 주파수를 찾을 수 없습니다, 경우 박동 패턴의 시각적인 검사 화합물 생산 부정맥 여부를 평가할 수 있습니다.
결과
그림 1 1 384-잘 접시에 걸쳐 기준선에서 Ca 파도의 대표적인 녹음을 보여준다. 대부분의 경우에서 모든 우물 공개 일반 박동 속도 약간 가변성 접시에 걸쳐 (± SD 의미 = 40.1 ± 3.5 bpm; range = 34-54 bpm). 아주 가끔 (미만 1/10 실험), 몇 가지 우물 (5 미만)는 부정맥 또는 리듬의 부재. 3 384-잘 접시, 우리는 또한 시도 다른 업체 로부터 cardiomyocytes ( 재료의 표참조) 자발적인 박동에 대 한 매우 비슷한 초기 계획 값을 얻었다.
심장 이온 채널 차단제 재현할 수 방식으로5cardiomyocytes의 리듬을 영향을 줍니다. 암 로디 핀, 느린 Ca 채널9, 차단기는 1 µ M (그림 2A)까지 농도 의존 방식으로 100% 이상 리듬을 가속 한다. 효과 첫 번째 5 분 이내 개발 잘 하지만 그것은 여전히 증가 approximatively 다음 30 분 이내 50% 안정화 되기 전에. 1 µ M, 위 암 로디 핀 체포 구타 (파선)으로 사실에서 예상 될 수 있다 Ca는 자발적 수축에 중요 한. 다른 선택적 dihydropyridine Ca 채널 차단제 매우 비슷한 효과 생성합니다.
E-4031, 급속 한 지연된 정류기 K 채널10의 차단 10 µ M (그림 2B) 최대 농도 의존 방식에서 리듬 약 65-70% 감속. 첫 번째 5 분 이내 효과 개발 하 고 60 분 이내 다양 하지 않습니다. 다른 선택적 IKr 차단제 속도 최대 감소 (예:35-40 %cisapride, E-4031, 70%, 90%-95 %dofetilide 대 한) 다를 수 있지만 비슷한 효과 생성 합니다. 이 차이 대 한 기준으로 알려져 있지 않습니다.
테트로도톡신, 빠른 나 채널11, 차단기는 리듬 약 15%를 감속 하는 1-30 µ M (그림 2C) 최대 농도 의존 방식. 효과 잘 첫 번째 5 분 이내 개발과 많은 다음 60 분 이내 다. 그러나, 30 µ M 이상의 테트로도톡신 체포 첫 5 분 안에 뛰는 반면 30 분 후 그것은 1 µ M 이상의 체포. Lidocaine 또는 mexiletine와 같은 다른 나 채널 차단제과 단성 있는 비슷한 효과 생성합니다.
Bepridil, 심장 Na, Ca, K 채널9, 혼합된 차단기는 또한과 단성 있는 효과 (그림 2D)를 생성합니다. 이것이 준비 나 채널의 블록은 bepridil의 기본 동작을 제안 합니다. Ca 채널 블록으로 인해 가속 나타나지 않습니다 나타나고 IKr 블록으로 인해 둔화 더 많은 진보 나 채널 효과 의해 마스크.
그림 1: 384-잘 접시에 걸쳐 대표적인 초기 캘리포니아 파도. (A) 접시에 걸쳐 모든 우물 작은 가변성 일반 박동 속도 보여 줍니다. 이 이미지는 플레이트 리더 소프트웨어에서 직접 캡처됩니다. 각 추적은 10 기간에 s. 형광 강도 임의의 (상대 빛 단위 비디오 카메라 스케일에서 파생)입니다. (B)이이 폭발 한 10의 s 추적 저 잡음 신호를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 심장 이온의 대표적인 효과 채널 차단제. 이러한 패널 표시 농도 응답 곡선 (A)는 선택적 Ca 채널 차단제 암 로디 핀, (B) 선택적 IKr 차단기 E-4031, (C)와 선택적 나 채널 차단제 TTX, 및 (D) 비 선택적 채널 차단기 bepridil입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
토론
두 가지 측면은 구타 주파수의 성공적인 기록에 대 한 가장 중요 합니다. 첫 번째 셀 도금와 문화 주의 운동 하는. 특히, 그것은 시도 하 고 매체를 교환할 때 우물의 바닥에 셀 계층을 긁힘 방지 하는 것이 중요. 펫와 우물의 바닥을 터치 하 셔도 됩니다 하지만 할 때마다, 그로 인하여 생산 셀 계층에 분석 결과 성능 영향을 미치지만 작은 스크래치 같은 각도 사용 해야 합니다. 재현 가능한 균질 리듬의 두 번째 중요 한 측면 측정 기간에 대 한 셀 접시에서 37 ° C에서 좋은 온도 제어를 제공 하는. 우리가 여기, 사용 플레이트 리더 이외의 장치를 사용 하 여이 동질성을 가져올 수 없습니다 하지만 온도 조절에 특별 한 수정이 가능할 수 있습니다: 플레이트의 단일 브랜드를 넘어 더 넓게 사용할 수 여기에 제시 된 프로토콜 만들 것 이라고 독자입니다. 여기에 사용 되는 장치를 가진 실험의 기간에 대 한 온도 안정성을 달성, 그것은 각 종료; 하기 전에 기록을 중지 하는 데 필요한 그렇지 않으면, 로봇 측정된 셀 접시를 꺼낼 것 이다. 이 기술 문제는 플레이트 리더 소프트웨어의 다음 릴리스 사라질 수 있습니다 하지만 지금 중요 한 남아 있다. 셀 플레이트 플레이트 리더 밖에 서 실수로 전송 하는 경우 그것은 해야 합니다 로드 안에 다시 가능한 한 빨리. 온도 변화에 매우 빠르게 박동 속도 영향을 때문에 그럼에도 불구 하 고, 실험의 품질 저하 됩니다.
몇 가지 다른 측면, 테스트 되지 않은 철저 하 게, 덜 중요 한 있을 수 있습니다. 예를 들어 hiPSC CM 제조 업체 셀을 뿌리기 전에 코팅 세포 배양 접시를 권장 하지만이 특정 분석 결과 코팅 사용 하지 않은, 셀 다양 한 표면에, 아주 쉽게 준수 때문에 그것은 매우 어려운 제대로 코트 384-잘 접시입니다. 그러나, 셀 플레이트 코팅 수 있습니다 여전히 허용, 또는 그것은 심지어 분석 결과 품질을 향상 시킬 수 있습니다. 우리 테스트도 하지 여부 이외에 DMSO 용 제 허용, 될 하지만 다른 기록 기술로 경험에서 EtOH 또는 MeOH의 유사한 농도 또한 쾌활 될 것 이라고 예상 된다. 우리가 일반적으로 hiPSC-CMs 동일한 제조 업체에서 사용 하 고는 비슷한 방식으로 작동 하도록 등장 셀 하나만 추가 공급 업체에서 테스트 되었습니다. 마찬가지로, 초기 배치를 비슷하게 행동 확인을 그들을 prechecking 선정 됐다 hiPSC CMs의 다른 배치의 적은 수만 사용 했습니다. 하나 또는 두 개의 일괄 처리 여기 그들의 syncytia 가난한 안정성 또는 문화 조건에서 재현성 때문에 부적 절 한 사용 하는 것으로 간주 했다. 그렇지 않으면,는 약리학 등장 매우 유사한 배치에서 "전형적인" 화합물 (산림, N6-cyclopentyl-아데노신, 그리고 E-4031, 뿐만 아니라 endothelin, isoproterenol, 암 로디 핀, 및 ponesimod)의 제한 된 패널을 테스트 하는 경우. 우리만 건강 한 기증자 로부터 파생 된 hiPSC CM을 사용 합니다. 그것을 서로 다른 결과 제공 하는 hiPSC CM 심장 질환 환자에서 파생 된 것 건강 한 기증자와 환자 사이의 차이가 tyrosine kinase 억제제의 cardiotoxicity 평가할 때 관찰 되었다 비록 가치가 있을 수 있습니다. 12. 마지막으로, 우리는 일반적으로 약물 효과 측정 하기 전에 문화에서 22 ~ 28 일 대기: 동일한 셀의 임피던스 녹음 우리의 경험에 대 한 정상 느린 임피던스 (셀 레이어 안정성의 지표) 및 빠른 임피던스 (지표의 박동 주파수)는 후에 도달 12-문화에서 15 일. 그러나이 때 심장 채널 및 성숙 마커 식 프로필13안정화는 시간 때문에, 우리 대기 22-28 일 결정 했다. 그것은 하지 여부를 이전 또는 이후 셀 사용 비교 결과 얻을 수 것 이라고 시험 되었다.
프로토콜 설명 여기 인간의 심장 전기 생리학에 잠재적인 약물 효과 평가 하 hiPSC CM의 자발적인 박동 속도의 매우 간단한 측정을 사용 하 여. 그것의 주요 장점이 다른 방법론은 i) 그것은 높은 처리량 검열 환경에 순종, ii) 기록는 cardiomyocytes의 활동과 생리 적인 온도에서 약물의 효과 및 iii) 그것은 필요 하지 않습니다. electrophysiological 전문성 실행 또는 결과의 평가 대 한.
유효성 검사 연구에서 인간 사용을 위해 승인 하는 많은 약물과 수행, 우리는 분석 결과 기존 임상 데이터5예측 인간의 의학에서 사용 되는 약물에 반응 다는 것을 보였다. 이 방법은 심장 리듬에 미치는 모든 잠재적 영향을 고려, 때문에 종합적인 생체 외에서 Proarrhythmic 분석 결과 (CiPA) 이니셔티브14 특히 프로 arrhythmic 잠재력을 평가 하는 보완 합니다.
미래에,이 방법은 자발적인 박동 속도 영향을 표시 하는 약의 행동의 모드의 추가 이해 제공할 수 있습니다. 추가 기계 정보는 Ca 과도 (예를 들어, 그들의 진폭 또는 모양에서)의 형광 녹음에 높습니다. 형광 녹음을 수행 높은 수집 속도 (예를 들어, 30 Hz), 이러한 매개 변수 쉽게 박동 속도, 뿐만 아니라 추출 되 고 그것의 알려진된 효과 변경 이러한 매개 변수를 연관 흥미로운 일이 될 수 있습니다. 임상 약물 사용.
공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
저자 아무 승인 있다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| FDSS7000 형광등 플레이트 리더 | Hamamatsu Photonics (Massy, France) | 카탈로그 항목이 | |
| FDSS7000 Fluo-3 / Fluo-4 / Fluo-8 형광 필터 키트 | Hamamatsu Photonics (Massy, France) | 초기에 설치 | |
| 온도 제어 | Hamamatsu Photonics (Massy, France) | A10118-09 | |
| FDSS7000 150-W 여기 광원 장치 | Hamamatsu Photonics (프랑스, 매시) | C11653-11 | |
| 384웰 플레이트용 FDSS7000 피펫 팁 | Hamamatsu Photonics (프랑스, 매시) | A8687-62 | |
| 심근세포용 파형 분석 소프트웨어 | Hamamatsu Photonics (프랑스, 매시) | U8524-12 | Igor Pro 소프트웨어의 |
| 대안 옵션Igor Pro 데이터 분석 소프트웨어 | Wavemetrics (미국 오리건주 포틀랜드) | 최신 버전 | |
| iCell-Cardiomyocytes Kit | Cellular Dynamics International (위스콘신주 매디슨) | R1106 | 포함 세포, 도금 및 유지 관리 매체 |
| Cor.4U Cardiomyocyte Kit | Ncardia Germany (독일 쾰른) | Ax-B-HC02-4M | 세포, 도금 및 유지 관리 매체 포함 iCell-Cardiomyocytes |
| 384웰 세포 배양 플레이트 | Greiner-Bio-One(Frickenhausen, 독일) | 781091 | |
| 384웰 복합 플레이트 | Greiner-Bio-One(Frickenhausen, 독일) | 781280 | |
| FLIPR Calcium 4 Assay Kit | Molecular Devices (Sunnyvale, California) | R8142 | |
| Forskolin | Sigma-Aldrich (스위스, Buchs) | F6886 | |
| N6-cyclopentyl-adenosine | Sigma-Aldrich (스위스, Buchs) | C8031 | |
| E-4031 | Enzo Life Sciences (스위스, Lausen) | BML-KC158 | |
| 페니실린-스트렙토마이신 용액 | Gibco/ThermoFisher (스위스, Reinach) | 15140-122 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco/ThermoFisher (Reinach, 스위스) | 15250061 |
참고문헌
- Guo, L. Estimating the risk of drug-induced proarrhythmia using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Toxicological Sciences. 123, 281-289 (2011).
- Jonsson, M. K., Wang, Q. D., Becker, B. Impedance-based detection of beating rhythm and proarrhythmic effects of compounds on stem cell-derived cardiomyocytes. Assay and Drug Development Technologies. 9, 589-599 (2011).
- Kattman, S. J., Koonce, C. H., Swanson, B. J., Anson, B. D. Stem cells and their derivatives: a renaissance in cardiovascular translational research. Journal of Cardiovascular Translational Research. 4 (1), 66-72 (2011).
- Ma, J. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), H2006-H2017 (2011).
- Sube, R., Ertel, E. A. Cardiomyocytes Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells: An In-Vitro Model to Predict Cardiac Effects of Drugs. Journal of Biomedical Science and Engineering. 10 (11), 23(2017).
- Sirenko, O. Multiparameter in vitro assessment of compound effects on cardiomyocyte physiology using iPSC cells. Journal of Biomolecular Screening. 18, 39-53 (2013).
- VanderPlas, J. T. Understanding the Lomb-Scargle Periodogram. Cornell Univeristy Library. , arXiv:1703.09824 (2017).
- Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. 111, A3 B 1-3 (2015).
- Ertel, E. A., Godfraind, T. Calcium channel blockers and calcium channels. Calcium Channel Blockers. Godfraind, T. , Springer. Basel, Switzerland. 11-80 (2004).
- Sanguinetti, M. C. Modulation of potassium channels by antiarrhythmic and antihypertensive drugs. Hypertension. 19, 228-236 (1992).
- Duran-Riveroll, L. M., Cembella, A. D. Guanidinium Toxins and Their Interactions with Voltage-Gated Sodium Ion Channels. Marine Drugs. 15 (10), (2017).
- Sharma, A. High-throughput screening of tyrosine kinase inhibitor cardiotoxicity with human induced pluripotent stem cells. Science Translational Medicine. 9 (377), (2017).
- Puppala, D. Comparative gene expression profiling in human-induced pluripotent stem cell--derived cardiocytes and human and cynomolgus heart tissue. Toxicological Sciences. 131 (1), 292-301 (2013).
- CIPA. , Available from: http://cipaproject.org (2016).
재인쇄 및 허가
