여기, 우리는 성인 zebrafish의 자연 병원 체 진 균 marinum를 사용 하 여에 프로토콜 모델 인간의 결핵을 제시. 추출 된 DNA와 RNA 감염 된 zebrafish의 내부 장기에서 총 mycobacterial를 물고기와 정량으로 호스트의 면역 반응에 로드 공개를 사용할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
결핵균 은 현재 매년 1.7 백만 사망자와 10.4 백만 감염을 일으키는 최악의 인간 병원 체입니다. 이 박테리아에 노출 인간 멸 균된 감염에서 적극적으로 진행 하는 치명적인 질환에 이르기까지 다양 한 질병 스펙트럼을 발생 합니다. 가장 일반적인 형식은 잠재성 결핵, 무 증상, 하지만 가능성이 fulminant 질병으로 다시 활성화 합니다. 성인 제 브라와 그것의 자연 병원 체 진 균 marinum 최근 결핵의 질병 넓은 스펙트럼을 공부 하는 해당 모델을 입증 했다. 중요 한 것은, mycobacterial 감염의 맥락에서 적응 면역 반응 뿐만 아니라 자발적인 대기 시간 및 재가이 모델에서 공부 될 수 있다. 이 문서에서는, 우리는 성인 zebrafish, mycobacterial 로드 및 양이 많은 PCR에 의해 호스트 면역 응답의 측정에 대 한 핵 산 추출에 대 한 내부 장기의 컬렉션의 실험적인 감염에 대 한 방법을 설명합니다. -집을-개발한, M. marinum-특정 정량 분석 결과 또한 비 분할 휴면 또는 최근에 죽은 mycobacteria에서 DNA 탐지 전통적인 도금 방법 보다 더 민감한. 로 동일한 개인에서 DNA와 RNA 추출, 질병 상태, 그리고 호스트와 병원 체 유전자 발현의 관계를 연구 가능 하다. 결핵에 대 한 성인 zebrafish 모델은 따라서 호스트 병원 체 상호 작용 연구에 매우 적용, 비 포유류에서 vivo에서 시스템으로 자체을 선물 한다.
서론
Zebrafish (Danio rerio) 생물 의학 연구에 널리 사용 되는 동물 모델 이며 일반적인 척 추가 있는 생물학에 대 한 허용된 모델입니다. Zebrafish는 인간의 질병을 모델링 연구의 많은 분야에 맞게 조정 되었습니다 및 감염 및 면역학 연구의 여러 세균 3 및 바이러스 감염4 1 암 심장 질환2 에서 장애 , 5. 또한, zebrafish 태아의 전 utero 개발 했다는 제 브라 인기 모델 개발 생물학6 및 독물학7,8.
감염 생물학을 포함 하 여, 연구의 많은 분야에서 광학 투명 zebrafish 애벌레는 일반적으로 사용 됩니다. 원시 세포는 검색 된9때 첫 번째 면역 세포 24 h 게시물 수정 (hpf)에 표시 됩니다. 호 중구는 약 33 hpf
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프로토콜
모든 zebrafish 실험 동물 실험 보드 핀란드 (ESAVI/8245/04.10.07/2015)에 의해 승인 되었습니다가지고. 메서드는 법 (497/2013)와 핀란드에서 과학 또는 교육 목적을 위해 사용 하는 동물의 보호에 정부 법령 (564/2013)에 따라 수행 됩니다.
1. 배양 진 균 marinum 의
참고: 진 균 marinum 능력이 인 간에 있는 표면 감염을 일으키는 병원 체 이기 때문에, 개인 안전 및이 박테리아와 함께 작업을 시작 하기 전에 생물 학적 폐기물 처리에 대 한 지역 가이드라인을 찾을.
- 문화 M. marinum 7 H 10에 적어도 5 일 동안 OADC (올레산, 알 부 민, 포도 당, 카 탈 라 제) 농축 및 0.5 %v / v 29 ° C에 글리세롤의 10% 보충 판. 매 2 주 냉장고에서 신선한 박테리아를 복용 하 고 매주 마다 새로운 접시에 전송 하 여 M. marinum 문화를 유지 합니다.
참고: M. marinum 자연 물고기 병원 체 감염 수생 종 이며 하지 zebrafish 주식 박테리아와 오염에 주의 하는 것이 중요 하다. 세균으로 오염 하는 항목과 감염 된....
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결과
진 균 marinum 자연 물고기 병원 체는 제 브라의 내부 장기를 감염 하 고 조직학 보이는 육아19조직의 감염을 생성 합니다. 성인 zebrafish M. marinum 복 주사에 의해 감염 됩니다. DNA와 RNA를 추출 하 고 mycobacterial 부하 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량) DNA를 템플릿으로 사용 하 여 측정 된다. 방법의 개요는 그림 1에 표시 됩니다.
물고기를 감염 사용 mycobacteria의 초기 수 감염의 결과 대 한 중요 한 결정 이다. M. marinum (~ 2000 CFU)의 높은 감염 복용량 mycobacterial 로드 계속 평균 세균 부하는 궁극적으로 물고기를 죽이 약 .......
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토론
여기는 실험적으로 감염 된 성인 zebrafish 조직에서 추출한 DNA에서 mycobacterial 로드를 측정 하는 정량 기반 응용 프로그램에 설명 합니다. 이 응용 프로그램은 뇌관 16S 23S rRNA 내부 베낀된 공백 시퀀스40설계를 기반으로 합니다. 생선 샘플에서 총 mycobacterial 부하 DNA 교양된 mycobacteria의 알려진된 수에서 추출 하 고 어떤 주어진된 순간에 그 한 박테리아는 그것의 게놈의 복사본이 하나 가정에서 준비 하는 표준 곡선을 사용 하 여 추정 된다. M. marinum-정량의 검출 한계는 약 100 단위18를 형성 하는 식민지. 전통적인 도금에 비해 방법의 명확한 이점은 활성 및 비 분할 휴면 박테리아 검출 될 수 있다 이다. 또한, zebrafish 조직에서 문화 접시에 오염 성장의 일반적인 문제는이 접근 방식에 의해 피할입니다. 그러나, DNA는 템플릿으로 사용 되는 경우, 측.......
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
이 작품으로는 핀란드 문화 재단 (H.L.), 템 퍼 결핵 재단 (H.L., L. M.V. M.M.H., M.P.), 핀란드 결핵 협회 (Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö) (H.L., 재단 지원 되었습니다. M.M.H., M.P.), Sigrid Jusélius 재단 (M.P.), 에밀 Aaltonen 재단 (M.M.H.), 제인 및 Aatos Erkko 재단 (M.P.)와 핀란드의 아카데미 (M.P.). Leena Mäkinen, 한 나-Leena Piippo 및 제 나 Ilomäki에 그들의 기술 지원을 인정 됩니다. 저자는 그들의 서비스에 대 한 템 퍼 Zebrafish 실험실을 인정합니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Mycobacterium marinum | American Type Culture Collection | ATCC 927 | |
| Middlebrock 7H10 한천 | BD, Thermo Fisher Scientific | 11799042 | |
| Middlebrock OADC 농축 | BD, Thermo Fisher Scientific | 11718173 | |
| Middlebrock 7H9 medium | BD, Thermo Fisher Scientific | 11753473 | |
| Middlebrock ADC 농축 | BD, Thermo Fisher Scientific | 11718173 | |
| 트윈 80 | 시그마-알드리치 | P1754 | |
| 글리세롤 | 시그마-알드리치 | G5516-500ML | |
| GENESYS20 분광광도계 | Thermo Fisher Scientific | ||
| 인산염 완충 식염수 정제(PBS) | 시그마-알드리치 | P4417-50TAB | |
| 페놀 레드 | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| 27G 바늘 | Henke Sass Wolf | 4710004020 | |
| 1mL 주사기 | Henke Sass Wolf | 4010.200V0 | |
| Omnican 100 30G 인슐린 바늘 | Braun | 9151133 | |
| 3-aminobenzoic acid ethyl ester (pH 7.0) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| 1.5mL 균질화 튜브 | Qiagen | 13119-1000 | |
| 2.8mm 세라믹 비드 | Qiagen | 13114-325 | |
| 에탄올, ETAX AA | Altia | ||
| 2-프로판올 | Sigma-Aldrich | 278475 | |
| 클로로포름 | VWR | 22711.290 | |
| 구아니딘 티오시아네이 | 트 Sigma-Aldrich | G9277 | FW 118.2g/mol |
| 구연산 | 나트륨Sigma-Aldrich | 1613859 | FW 294.1 g/mol |
| Tris (free base) | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | FW 121.14 g/mol |
| TRI 시약 | 분자 연구 센터 | TR118 | Guanidine thiocyanate-phenol solution |
| PowerLyzer24 homogenizator | Qiagen | ||
| Sonicator m08 | Finnsonic | ||
| Nanodrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | ||
| SENSIFAST No-ROX SYBR, Green Master Mix | Bioline | BIO-98005 | |
| qPCR 96웰 플레이트 | BioRad | HSP9601 | |
| 광학 투명 필름 | BioRad | MSB1001 | |
| C1000 Thermal cycler with CFX96 real-time system | BioRad | ||
| RNase AWAY | Thermo Fisher Scientific | RNase를 제거하는 10666421 오염 제거 시약 | |
| DNase I | Thermo Fisher Scientific | EN0525 | |
| 역전사 마스터 믹스 | Fluidigm | 100-6298 | |
| SsoFast Eva Green 마스터 믹스 | BioRad | 172-5211 |
참고문헌
- Zhao, S., Huang, J., Ye, J. A fresh look at zebrafish from the perspective of cancer research. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 34, 80(2015).
- Bournele, D., Beis, D. Zebrafish models of cardiovascular disease. Heart failure reviews. 21 (6), 803-813 (2016).
- Torraca, V., Mostowy, S.
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재인쇄 및 허가
