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방법 논문

진 균 marinum 감염 성인 Zebrafish에 모델링 결핵

10.5K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/58299

⸱

2018년 10월 8일

 ,  ,  , 
1Faculty of Medicine and Life Sciences, University of Tampere, 2Oral and Maxillofacial Unit, Tampere University Hospital

이 논문에서

요약

여기, 우리는 성인 zebrafish의 자연 병원 체 진 균 marinum를 사용 하 여에 프로토콜 모델 인간의 결핵을 제시. 추출 된 DNA와 RNA 감염 된 zebrafish의 내부 장기에서 총 mycobacterial를 물고기와 정량으로 호스트의 면역 반응에 로드 공개를 사용할 수 있습니다.

초록

결핵균 은 현재 매년 1.7 백만 사망자와 10.4 백만 감염을 일으키는 최악의 인간 병원 체입니다. 이 박테리아에 노출 인간 멸 균된 감염에서 적극적으로 진행 하는 치명적인 질환에 이르기까지 다양 한 질병 스펙트럼을 발생 합니다. 가장 일반적인 형식은 잠재성 결핵, 무 증상, 하지만 가능성이 fulminant 질병으로 다시 활성화 합니다. 성인 제 브라와 그것의 자연 병원 체 진 균 marinum 최근 결핵의 질병 넓은 스펙트럼을 공부 하는 해당 모델을 입증 했다. 중요 한 것은, mycobacterial 감염의 맥락에서 적응 면역 반응 뿐만 아니라 자발적인 대기 시간 및 재가이 모델에서 공부 될 수 있다. 이 문서에서는, 우리는 성인 zebrafish, mycobacterial 로드 및 양이 많은 PCR에 의해 호스트 면역 응답의 측정에 대 한 핵 산 추출에 대 한 내부 장기의 컬렉션의 실험적인 감염에 대 한 방법을 설명합니다. -집을-개발한, M. marinum-특정 정량 분석 결과 또한 비 분할 휴면 또는 최근에 죽은 mycobacteria에서 DNA 탐지 전통적인 도금 방법 보다 더 민감한. 로 동일한 개인에서 DNA와 RNA 추출, 질병 상태, 그리고 호스트와 병원 체 유전자 발현의 관계를 연구 가능 하다. 결핵에 대 한 성인 zebrafish 모델은 따라서 호스트 병원 체 상호 작용 연구에 매우 적용, 비 포유류에서 vivo에서 시스템으로 자체을 선물 한다.

서론

Zebrafish (Danio rerio) 생물 의학 연구에 널리 사용 되는 동물 모델 이며 일반적인 척 추가 있는 생물학에 대 한 허용된 모델입니다. Zebrafish는 인간의 질병을 모델링 연구의 많은 분야에 맞게 조정 되었습니다 및 감염 및 면역학 연구의 여러 세균 3 및 바이러스 감염4 1 암 심장 질환2 에서 장애 , 5. 또한, zebrafish 태아의 전 utero 개발 했다는 제 브라 인기 모델 개발 생물학6 및 독물학7,8.

감염 생물학을 포함 하 여, 연구의 많은 분야에서 광학 투명 zebrafish 애벌레는 일반적으로 사용 됩니다. 원시 세포는 검색 된9때 첫 번째 면역 세포 24 h 게시물 수정 (hpf)에 표시 됩니다. 호 중구는 약 33 hpf10표시 다음 면역 세포 이다. Zebrafish 애벌레는 이렇게 감염의 초기 단계 적응 면역 세포11의 부재에서 타고 난 면제의 역할을 연구 하 고 실현. 그러나, 그것의 완전 한 기능 적응 면역 시스템과 성인 zebrafish 감염 실험에 대 한 복잡성의 추가 계층을 제공합니다. T 세포 감지할 수 있습니다 주위 3 일 게시물 수정12및 B 세포는 기능 항 체를 생산할 수 4 주 게시물 수정13. 성인 zebrafish 포유류 타고 난 및 적응형 면역 시스템의 모든 주요 대응 하고있다. 물고기의 immune systems와 인간 사이의 주요 차이점은 림프 조직의 해부학에서 뿐만 아니라 항 체 isotypes에서 발견 된다. Zebrafish는 반해 인간이 515세 항 체 클래스14, 있다. 골 수와 림프절의 부재, 물고기에서 기본 림프 장기는 신장과 thymus16 와 비장, 신장과 창 자 2 차 림프 기관17역할. 타고 난 및 적응형 셀의 전체 면역 무기고와 이러한 차이도 불구 하 고 성인 zebrafish 호스트 병원 체 상호 작용 연구에 대 한 높은 적용, 사용 하기 쉬운, 비 포유류 모델입니다.

Zebrafish는 요즘 결핵18,,1920,,2122공부 가능한 모델로 설립 되었습니다. 결핵은 결핵균에 의해 발생 하는 공 수 질병 이다. 세계 보건 기구에 따르면 결핵 2016 년에1.7 백만 죽음을 야기 하 고 하나의 병원 체 전세계23에 의해 죽음의 주요 원인이 다. 마우스24,25, 토끼26 및 비 인간 영장류27 가장 유명한 동물 모델 각 얼굴 하지만 결핵 연구에 그들의 한계는. M. 결핵 감염의 비 인간 영장류 모델 유사 인간의 질병 가장 밀접 하 게, 하지만이 모델을 사용 하 여 하는 것은 심각한 윤리적 고려 사항으로 인해 제한 합니다. 다른 동물 모델 M. 결핵 질병 병 리에 영향을 주는 호스트 특이성에 의해 방해 된다. 아마 결핵 모델링에서 가장 큰 문제는 인간의 질병에 감염 및 질병 결과의 광범위 한 스펙트럼: 결핵은 매우 이질적인 질병 면역 잠재성, 활성 및 다시 활성화 감염28 살 균에서 배열 을 재현 하 고 실험적으로 모델 하기 어려울 수 있습니다.

진 균 marinum 85% 아미노산 신원을29와 ~ 3000 orthologous 단백질 M. 결핵 의 가까운 친척 이다. M. marinum 는 자연스럽 게 zebrafish 생산 육아, 그것의 내부 장기19,30에서 결핵의 감염. 결핵 연구에 사용 되는 다른 동물 모델, 달리 zebrafish 생산 많은 자손, 그것은 제한 된 공간을 요구 한다 그리고 중요 한 것은, 그것은 neurophysiologically 최소한 개발된 척추 결핵 모델 사용할 수 있습니다. 또한, M. marinum 감염 원인 잠재성 감염, 활성 질병 이나 심지어 살 균 mycobacterial 감염의 성인 zebrafish 밀접 하 게 인간의 결핵19, 의 결과의 스펙트럼을 흉내 낸 31 , 32. 여기, M. marinum 복 부 캐비티에 주입 하 고 양이 많은 PCR를 사용 하 여 mycobacterial 부하와 제 브라에서 면역 반응을 측정 하 여 실험 결핵 모델 성인 zebrafish의 방법 설명 조직 샘플입니다.

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프로토콜

모든 zebrafish 실험 동물 실험 보드 핀란드 (ESAVI/8245/04.10.07/2015)에 의해 승인 되었습니다가지고. 메서드는 법 (497/2013)와 핀란드에서 과학 또는 교육 목적을 위해 사용 하는 동물의 보호에 정부 법령 (564/2013)에 따라 수행 됩니다.

1. 배양 진 균 marinum 의

참고: 진 균 marinum 능력이 인 간에 있는 표면 감염을 일으키는 병원 체 이기 때문에, 개인 안전 및이 박테리아와 함께 작업을 시작 하기 전에 생물 학적 폐기물 처리에 대 한 지역 가이드라인을 찾을.

  1. 문화 M. marinum 7 H 10에 적어도 5 일 동안 OADC (올레산, 알 부 민, 포도 당, 카 탈 라 제) 농축 및 0.5 %v / v 29 ° C에 글리세롤의 10% 보충 판. 매 2 주 냉장고에서 신선한 박테리아를 복용 하 고 매주 마다 새로운 접시에 전송 하 여 M. marinum 문화를 유지 합니다.
    참고: M. marinum 자연 물고기 병원 체 감염 수생 종 이며 하지 zebrafish 주식 박테리아와 오염에 주의 하는 것이 중요 하다. 세균으로 오염 하는 항목과 감염 된 zebrafish 사육 시설에 별도로 보관 해야 합니다.
  2. 살 균 1 µ L 접종 루프를 사용 하 여 aseptically 7 H 9의 10 mL를 포함 하는 셀 문화 플라스 크에 M. marinum 세균성 질량의 loopful 전송 보통 0.2 %v / v 폴 80 및 0.2 %v / v의 10% (알 부 민, 포도 당, 카 탈 라 제) ADC 농축으로 글리세롤입니다. 3-4 일 약 한 세600 (광학 밀도) 0.7 동요 없이 어둠 속에서 29 ° C에서의 문화. 모자, 떠나거나 필터 캡을 사용 하 여 가스의 충분 한 교류에 대 한 허용.
    참고: 폴 80 박테리아의 집계를 방지 하기 위해 중간에 추가 됩니다. 또한, 빛에 노출 (예를 들어, 노란색 흰색에서 컬러 변경) 세균성 식민지에서 phenotypic 변화 이끌어 낸다. 이 방지 하려면 어둠 속에서 문화를 유지.
  3. 분 광 광도 계와 OD600값을 측정 합니다. 0.07-0.09의 OD600 액체 문화를 희석 하 고 동요 없이 어둠 속에서 29 ° C에서 2 일 동안 배양을 계속 합니다. 느슨한 모자를 남겨 주세요.
    참고: 두 일 동안 세균 현 탁 액 약 0.5에 해당 하는 초기 로그 단계의 OD600를 도달 한다.

2. 성인 Zebrafish 감염에 대 한 세균 솔루션의 준비

  1. 큰 살 균 베트 또는 15 mL 튜브에 세균 현 탁 액을 전송 및 정착에 큰 풀 수 있도록 15 분 동안 실내 온도에 어둠 속에서 그것을 배치.
  2. 깨끗 한 튜브 또는 베트에 현 탁 액의 최고 5 ~ 7 mL를 전송 하 고 OD600을 측정 한다. 정지이 최상위 단계를 사용 하 여 감염에 대 한.
  3. 신선한 튜브와 10000 x g에서 3 분 동안 원심 분리기로 M. marinum 문화의 1 mL를 수집 합니다. 상쾌한을 제거 하 고 살 균 1 x PBS의 1 mL에 펠 릿을 resuspend.
  4. 희석 균 1을 사용 하 여 원하는 세균 농도 도달 하는 추적 프로그램으로 0.3 mg/mL 페 놀 레드 PBS x. 3 개의 aliquots로 희석된 정지를 나눕니다.
    참고: 사용 하 여 미리 결정 된 OD600 CFU (콜로 니 형성 단위) 대 / µ L 곡선 추정 희석 하 5 µ L 주입 볼륨34에 박테리아의 원하는 숫자를 얻을 하는 데 필요한. OD600 와 세균 현 탁 액의 농도 사이의 상관 관계 실제 감염 실험을 시작 하기 전에 유효성을 검사 해야 합니다. 이 유효성 검사 데이터를 수집 하기 위해 2 주를 보유 합니다.
  5. 1 mL 주사기를 사용 하 여, 천천히 풀 서 스 펜 션 27 G 통해 바늘 3 배. 각 약 수에 대 한 그냥 사용 하기 전에이 단계를 수행 합니다.
    참고: 이상의 2 시간에 대 한 동일한 세균 솔루션을 사용 하지 마십시오.

3. 실험 복 주사로 M. marinum 감염

  1. 플라스틱 parafilm 영화의 조각에 희석된 세균 솔루션의 5 µ L 방울 고 30 G 인슐린 바늘에는 방울을 당겨.
  2. 5-8 달 사용-오래 된 야생 형 물고기와 실험에 대 한 rag1−/−hu1999 돌연변이 물고기. 0.02 %3-aminobenzoic 산 에틸 에스테 르 (pH 7.0) 탱크 물에 성인 제 브라 anesthetize 습 한 발포에 슬릿으로 물고기의 복 부 측을을 놓습니다.
    참고: 걸 레-/- 돌연변이 물고기는 기능 T와 B 세포를 생산 하 고 체세포 재조합을 받을 수 없습니다.
  3. 주사 바늘에 골반 지 느 러 미 사이 약 45 ° 각도. 전체 오프닝 복 부 캐비티 내부 관찰을 위쪽으로 바늘 개방 유지. 세균 현 탁 액을 천천히 주입 하 고 조심 스럽게 바늘을 제거 합니다.
    참고: 경우 주입 시 물고기에서 누수 되는 빨간 추적 프로그램, 실험에서 생선을 제외 합니다.
  4. 주입 후 즉시 신선한 탱크 물으로 복구 탱크에 물고기를 전송 합니다.
  5. 받아 샘플 7 H 10에 세균 현 탁 액의 플레이트 사용에서 aliquot 박테리아에서 매 15 분 및 5 일 29 ° C에서 박테리아를 품 어 고 접시에 식민지를 계산 하 여 감염 복용량을 확인 합니다.
  6. 물고기의 복지를 정기적으로 확인 하 고 0.02% 이상 감염의 증상이 있는 모든 물고기를 안락사 3 aminobenzoic 산 에틸 에스테 르 (pH 7.0)의 농도.
    참고: 약, 성인 zebrafish의 7%에 감염 된 34 ± 15 CFU 709 CFU 2029 ±로 감염 된 zebrafish의 30% 및 8 주19증상을 했다 됩니다. 증상은 비정상적인 수영, 터치, 헐 떡이 고, 부 종 또는 낭비 하는 관찰의 부족을 포함할 수 있습니다.
  7. 일반적인 표준35에 따르면 zebrafish를 유지 합니다.

4입니다. 내부 장기의 수집

  1. 3-aminobenzoic 산 에틸 에스테 르 (이상 0.02% 농도, pH 7.0) 탱크 물에서의 과다와 zebrafish 안락사
  2. 하나의 핀 branchiostegal 광선 및 꼬리 압정 플랫폼에 물고기를 통해 다른 후부를 삽입 합니다.
  3. 메스와 함께 전체 복 부 구멍을 열고 작은 숟가락과 날카로운 종단 핀셋을 사용 하 여 내부 장기를 수집 합니다. 마음에서 시작 하 고 분리 한 블록에 모든 내부 장기를 꼬리 쪽으로 척추를 따라 작동.
    참고: 모든 신장 조직 숟가락으로 척추를 따라 된다고 하 여 수집 해야 합니다.
  4. 마지막으로, 족집게를 사용 하 여 분리 하는 cloaca 옆 창 고 6 2.8 m m 세라믹 구슬 1.5 mL 균질 튜브로 기관 전송. 즉시 샘플을 동결 드라이 아이스에 놓습니다. -80 ° C까지 무 균에서 샘플을 저장할 수 있습니다.
  5. 개인 간의 70% 에탄올으로 악기를 씻어.

5. 균질 및 RNA 추출 기관 블록에서.

참고: 메서드는 스탠포드 대학 프로토콜36에서 수정 됩니다.

  1. 1500 µ L. 총 볼륨 샘플 상단 guanidine 안산-페 놀 솔루션 핵 산 추출 (자료 테이블)에 대 한 사용을 추가 샘플 총 볼륨의 10%의 최대를 커버 하는 확인 하십시오.
    주의: 수확 조직의 예상된 볼륨은 100 µ L. Guanidine 안산-페 놀 솔루션에 포함 된 독성과 자극 화합물 하며 보호 의류, 니트 릴 장갑, 증기 두건에서 일. 이 독성 가스의 형성 원인이 됩니다 표 백제와 결합 하지 마십시오. 사용 하기 전에 물질 안전 데이터 시트 (MSDS)를 읽으십시오.
  2. 40 3 번 구슬을 얻어 균질 화기를 사용 하 여 샘플을 균질 3200 rpm에서 s. 30 대 한 얼음에 멋진 사이클 사이 s. 9 분 물 욕조에 무 균된 샘플 sonicate
  3. 4 ° C에서 10 분 동안 12000 x g 에서 샘플 원심 고 신선한 microcentrifuge 관으로 지운된 homogenate의 1000 µ L를 이동 합니다.
  4. 클로 프롬의 200 µ L을 추가, 15에 대 한 vortexing에 의해 즉시 혼합 s와 실 온에서 2 분 동안 품 어.
    주의: 클로 프롬은 유독 고 복합 자극, 흡입 하는 경우 삼 또는 피부 또는 눈 접촉. 개인 보호를 위해 필요한 안전 장비를 사용 하 고 증기 두건에서 작동. 사용 하기 전에 물질 안전 데이터 시트 (MSDS)를 읽으십시오.
  5. 수성 및 유기 단계를 구분을 4 ° C에서 15 분 동안 12000 x g 에서 원심.
  6. 신중 하 게, RNA 오염 방지 하려면 신선한 튜브에 500 µ L의 최고 단계를 전송 합니다. 제거 하 고 수성 단계 (~ 100 µ L)의 나머지를 버리고 interphase 및 DNA 추출에 대 한 유기 단계 4 ° C에서 저장.
    참고: 상위 단계는 RNA를 포함합니다.
  7. 2-프로 판 올의 500 µ L을 추가 하 고 즉시 RNA 침전을 실 온에서 10 분 동안 15 미 품에 대 한 vortexing에 의해 혼합.
  8. 작은 RNA에 4 ° C에서 10 분 동안 12000 x g 에서 원심. Pipetting 여는 상쾌한을 제거 합니다.
  9. 75% 에탄올과 10에 대 한 소용돌이의 1 mL을 추가 s.
    참고: 프로토콜 일시 중지할 수 있습니다 여기에, 그리고 샘플 4 ° c.에 하룻밤 보관
  10. 4 ° c.에서 5 분 동안 7500 x g 에서 원심 분리기 Pipetting 여는 상쾌한을 제거 합니다.
  11. 5.9-5.10 세척 단계를 반복 합니다. Pipetting으로 상쾌한을 신중 하 게 제거 하 고 증기 두건에 게 펠 릿 건조.
  12. Nuclease 무료 물 500 µ L에서 RNA 펠 릿을 녹이 고 얼음에 샘플을 계속. Microvolume 분 광 광도 계 또는 해당 장비와 함께 농도 측정 합니다. -80 ° c.에 RNA를 저장

6. 공동 추출된 제 브라와 Mycobacterial DNA의 정화

  1. Guanidine 안산 (최종 농도 4 M)의 118.2 g 나트륨 시트르산의 3.68 g을 용 해 하 여 다시 추출 버퍼 (애기) 준비 (최종 농도 50 m m)과 nuclease 무료 물 (이 5 월의 120 mL에서 트리 스 무료 자료 (최종 농도가 1 M)의 30.29 g 필요 하룻밤 교 반). Nuclease 무료 물 250 mL 및 소독 솔루션 필터의 최종 전체 볼륨을 추가 합니다.
    참고:이 버퍼 저장할 수 있습니다 실 온에서 6 개월까지. 그들은 염화 수소 및 수소 시아 나 이드 독성 가스를 생산 하기 위해 반응으로 표 백제와 애기를 결합 하지 마십시오.
  2. Mycobacterial DNA를 추출 하 고 interphase 샘플의 유기 단계를 사용 합니다. 각 튜브를 애기의 500 μ를 추가 합니다. 실 온에서 반전 하 여 10 분 동안 광범위 하 게 믹스.
  3. 실 온에서 30 분 동안 12000 x g 에서 튜브 원심 하 고 신중 하 게 새로운 튜브에 DNA를 포함 하는 위 수성 단계의 500 µ L를 전송.
  4. 2-프로 판 올의 400 μ를 추가 합니다. 반전 하 여 혼합 하 고 실 온에서 10 분 동안 품 어.
  5. 4 ° c.에 15 분 동안 12000 x g 에서 샘플을 원심 DNA를 포함 하는 펠 릿은이 시점에서 표시 되어야 합니다. 조심 스럽게 pipetting으로 상쾌한 제거.
  6. 70% 에탄올의 800 μ를 추가 합니다. 반전 하 여 펠 릿을 세척. 할 하지 소용돌이 샘플이 시점에서, 게놈 DNA 쉽게 나눈다.
  7. 4 ° C에서 15 분 동안 12000 x g 에서 샘플 원심 고 pipetting으로 상쾌한을 제거 합니다. 에탄올 세척 (단계 6.6 6.7)를 반복 합니다.
  8. 신중 하 게 pipetting으로 에탄올을 제거 합니다. 샘플 5-10 분 해산 nuclease 무료 물 200 μ에 펠 릿에 대 한 건조 보자.
  9. Microvolume 분 광 광도 계 또는 해당 장비와 함께 DNA 농도 측정 합니다. DNA 또는 장기 저장을 위한-20 ° C에서 4 ° C에서 저장 될 수 있습니다.

7. 정량 PCR Mycobacterial 부하를 측정 하기 위한

  1. 아니-를 이용한 (카-X-rhodamine)는 M. marinum 내부 베낀된 스페이서 (ITS) MMITS1 뇌관 (표 1)와 함께 제조업체의 지침에 따라 16-23S ITS 사이 대 한과 정량 Pcr 반응 혼합을 준비 합니다. 반응 혼합 플라스틱 고 희석 96 잘 접시 정량에 적합에 중복으로. 각 실행에 알려진된 양의 박테리아의 DNA 표준 희석 시리즈를 포함 합니다.
    참고: 예상 물고기 당 M. marinum 부하 4 wpi에서 1000000 CFU 0 CFU에서 배열할 수 있다. 정량 분석 결과 또한 다른 정량 키트와 함께 수행할 수 있습니다 하지만 뇌관의 어 닐 링 온도 다시 최적화 될 수 있다.
  2. 광학 투명 필름으로 접시를 봉인 하 고 2000 x g 4 ° c.에 2 분 동안에 격판덮개 원심
  3. 표 2에 표시 된 정량 프로그램을 실행 합니다.
  4. 표준 곡선을 사용 하 여, 전체 물고기 샘플에서 박테리아의 수를 계산 합니다.

8. DNase RNA 샘플의 치료

  1. RNA에서 게놈 DNA의 모든 가능한 남아 있는 흔적을 제거 하려면 수행 DNase I 치료. 얼음에 RNA 샘플 녹여
    참고: RNase 무료 장비 및 솔루션을 사용 하 여 작업 면 펫 RNases (자료 테이블) 작업을 시작 하기 전에 제거 오염 제거 시 약으로 닦아 해야 합니다. 긴 팔 랩 코트와 당신의 견본을 보호 하기 위해 장갑을 착용 하십시오.
  2. 10 μ 준비 DNase I 반응 믹스 제조업체의 지침에 따라 얼음에. 믹스 1 μ DNase 나 DNase 버퍼 x 10의 1 μ, 8 μ RNA의 RNA의 1 μ g의 최대를 포함 한 샘플의.
  3. 부드럽게 반응 (vortexing)을 혼합 하 고 37 ° c.에 30 분 동안 품 어
  4. 열 비활성화 이전 각 10 µ L 샘플 50 mM EDTA의 1 µ L를 추가 합니다. EDTA는 추가 되지 않습니다, 만약 RNA 화학 저하 때가 열을 받게 된다.
  5. 열-비활성화 DNase I. 계속 cDNA 합성에 직접 또는 저장 DNase 취급 RNA-80 ° c.에 65 ° C에서 10 분 동안 품 어

9입니다. cDNA 합성

  1. 모든 시 약 및 얼음에 샘플을 유지 하 고 제조업체의 지침에 따라 반응 믹스를 준비. 5 μ 반응 혼합에 대 한 반전 전사 마스터 믹스의 1 μ, nuclease 무료 물 3 μ DNase의 1 μ 처리 RNA.
  2. 반전 녹음 방송 반응을 부드럽게 혼합 하 고 필요한 경우 짧게는 튜브를 회전.
  3. PCR 기계에 샘플을 배치 하 고 표 3에 표시 된 프로그램을 사용 하 여.
  4. 필요한 경우 nuclease 무료 물 2.5 ng/μ의 최대 농도를 정량에 cDNA를 희석. cDNA는-20 ° c.에 저장 될 수 있다

10. 양이 많은 PCR에 의해 Zebrafish 유전자 발현 측정

  1. 제조업체의 지침에 따라 얼음에 정량 마스터 믹스를 준비 하 고 빛 으로부터 보호. 표 1에 도입 된 프라이 머를 사용 합니다.
    참고: 각 유전자에 대 한 유도의 배를 계산 하려면 식 6 건강 한 제 브라에서 추출한 풀링된 초기 샘플에서 측정 합니다.
  2. 각 샘플의 복제를 준비 하 고 정량 플레이트에 반응 혼합 플라스틱. 광학 투명 필름으로 접시를 봉인 하 고 실행을 시작 하기 전에 2000 x g 4 ° C에서 2 분 동안에 격판덮개 원심.
  3. 실행은 정량 뇌관 쌍을에 따라 어 닐 링 온도와 표 4 에 표시 된 프로그램 사용 (표 1).
  4. 집 지키는 유전자 (loopern437)에 비해 유전자 식 비율 방정식을 사용 하 여 ΔCt 메서드 분석:
    figure-protocol-1

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결과

진 균 marinum 자연 물고기 병원 체는 제 브라의 내부 장기를 감염 하 고 조직학 보이는 육아19조직의 감염을 생성 합니다. 성인 zebrafish M. marinum 복 주사에 의해 감염 됩니다. DNA와 RNA를 추출 하 고 mycobacterial 부하 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량) DNA를 템플릿으로 사용 하 여 측정 된다. 방법의 개요는 그림 1에 표시 됩니다.

물고기를 감염 사용 mycobacteria의 초기 수 감염의 결과 대 한 중요 한 결정 이다. M. marinum (~ 2000 CFU)의 높은 감염 복용량 mycobacterial 로드 계속 평균 세균 부하는 궁극적으로 물고기를 죽이 약 ...

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토론

여기는 실험적으로 감염 된 성인 zebrafish 조직에서 추출한 DNA에서 mycobacterial 로드를 측정 하는 정량 기반 응용 프로그램에 설명 합니다. 이 응용 프로그램은 뇌관 16S 23S rRNA 내부 베낀된 공백 시퀀스40설계를 기반으로 합니다. 생선 샘플에서 총 mycobacterial 부하 DNA 교양된 mycobacteria의 알려진된 수에서 추출 하 고 어떤 주어진된 순간에 그 한 박테리아는 그것의 게놈의 복사본이 하나 가정에서 준비 하는 표준 곡선을 사용 하 여 추정 된다. M. marinum-정량의 검출 한계는 약 100 단위18를 형성 하는 식민지. 전통적인 도금에 비해 방법의 명확한 이점은 활성 및 비 분할 휴면 박테리아 검출 될 수 있다 이다. 또한, zebrafish 조직에서 문화 접시에 오염 성장의 일반적인 문제는이 접근 방식에 의해 피할입니다. 그러나, DNA는 템플릿으로 사용 되는 경우, 측...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

이 작품으로는 핀란드 문화 재단 (H.L.), 템 퍼 결핵 재단 (H.L., L. M.V. M.M.H., M.P.), 핀란드 결핵 협회 (Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö) (H.L., 재단 지원 되었습니다. M.M.H., M.P.), Sigrid Jusélius 재단 (M.P.), 에밀 Aaltonen 재단 (M.M.H.), 제인 및 Aatos Erkko 재단 (M.P.)와 핀란드의 아카데미 (M.P.). Leena Mäkinen, 한 나-Leena Piippo 및 제 나 Ilomäki에 그들의 기술 지원을 인정 됩니다. 저자는 그들의 서비스에 대 한 템 퍼 Zebrafish 실험실을 인정합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Mycobacterium marinumAmerican Type Culture CollectionATCC 927
Middlebrock 7H10 한천BD, Thermo Fisher Scientific11799042
Middlebrock OADC 농축BD, Thermo Fisher Scientific11718173
Middlebrock 7H9 mediumBD, Thermo Fisher Scientific11753473
Middlebrock ADC 농축BD, Thermo Fisher Scientific11718173
트윈 80시그마-알드리치P1754
글리세롤시그마-알드리치G5516-500ML
GENESYS20 분광광도계Thermo Fisher Scientific
인산염 완충 식염수 정제(PBS)시그마-알드리치P4417-50TAB
페놀 레드Sigma-AldrichP3532
27G 바늘Henke Sass Wolf4710004020
1mL 주사기Henke Sass Wolf4010.200V0
Omnican 100 30G 인슐린 바늘Braun9151133
3-aminobenzoic acid ethyl ester (pH 7.0)Sigma-AldrichA5040
1.5mL 균질화 튜브Qiagen13119-1000
2.8mm 세라믹 비드Qiagen13114-325
에탄올, ETAX AAAltia
2-프로판올Sigma-Aldrich278475
클로로포름VWR22711.290
구아니딘 티오시아네이트 Sigma-AldrichG9277FW 118.2g/mol
구연산나트륨Sigma-Aldrich1613859FW 294.1 g/mol
Tris (free base)Sigma-AldrichTRIS-ROFW 121.14 g/mol
TRI 시약분자 연구 센터TR118Guanidine thiocyanate-phenol solution
PowerLyzer24 homogenizatorQiagen
Sonicator m08Finnsonic
Nanodrop 2000Thermo Fisher Scientific
SENSIFAST No-ROX SYBR, Green Master MixBiolineBIO-98005
qPCR 96웰 플레이트BioRadHSP9601
광학 투명 필름BioRadMSB1001
C1000 Thermal cycler with CFX96 real-time systemBioRad
RNase AWAYThermo Fisher ScientificRNase를 제거하는 10666421 오염 제거 시약
DNase IThermo Fisher ScientificEN0525
역전사 마스터 믹스Fluidigm100-6298
SsoFast Eva Green 마스터 믹스BioRad172-5211

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