여기 우리는 신장 피 질 세포 외 매트릭스 파생 히드로 네이티브 신장 세포 외 기질 (ECM) 구조 및 생 화 확 적인 구성 유지를 조작 하는 프로토콜을 제시. 제조 프로세스와 응용 프로그램을 설명 합니다. 마지막으로, 신장 관련 세포 및 조직 재생 및 생명 공학 지원 하기 위해이 하이드로 겔을 사용 하 여에 대 한 관점을 설명 합니다.
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이 논문에서
요약
초록
세포 외 기질 (ECM) 조직의 항상성 유지에 중요 한 생물 및 생 화 확 적인 신호를 제공 합니다. 현재 합성 hydrogels 체 외에서 세포 배양 하지만 부족 필요한 단백질과 리간드 컴포지션 셀에서 생리 적 행동을 이끌어내는 강력한 기계적인 지원을 제공 합니다. 이 원고는 적절 한 기계적 견고성 및 지원 생 화 확 적인 구성으로 신장 피 질 ECM 파생 된 하이드로 겔의 제조 방법을 설명합니다. 히드로 기계적 조직 및 decellularized 인간 신장 피 질 ECM solubilizing 조작 이다. 매트릭스도 생리 적인 기계 stiffnesses 겔 화 하면서 네이티브 신장 피 질 ECM 단백질 비율을 유지 합니다. 히드로 신장에 따라 피 질에서 파생 된 세포 생리 적인 조건 하에서 유지 될 수 있다 기질 역할을 합니다. 또한, 하이드로 겔 조성 장병의 미래 연구를 가능 하 게 병 환경을 모델링을 조작할 수 있습니다.
서론
세포 외 기질 (ECM) 조직의 항상성 유지에 중요 한 생물 및 생 화 확 적인 신호를 제공 합니다. 복잡 한 분자 구성 조직의 구조 및 기능 속성을 조정합니다. 구조 단백질 셀 공간 인식 수 있으며 접착 및 마이그레이션1있습니다. 바운드 ligands 제어 셀 동작2세포 표면 수용 체 상호 작용. 신장 ECM 분자의 조성과 구조에 따라 해부학 적 위치, 발달 단계, 및 질병 상태3,4의 과다를 한 포함 되어 있습니다. ECM의 복잡성을 업과 신장 파생 셀 체 외공부에서 핵심 요소 이다.
ECM microenvironments 복제에 이전 시도 recellularization의 건설 기계를 만드는 decellularizing 전체 조직에 집중 했다. Decellularization 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) 등 화학 세제 또는 비 이온 세제, 수행 하 고 중 전체 장기 관류 또는 침수와 교 반 방법5,6,
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프로토콜
인간의 신장 LifeCenter 북 서 윤리 지침을 장기 조달 단체의 협회에 의해 설정에 의해 고립 되었다. 이 프로토콜은 워싱턴 대학에 의해 제시 된 동물 관심과 셀 문화 지침을 따릅니다.
1입니다. 인간 신장 조직 준비
- Decellularization 솔루션의 준비
- 소독 5000 mL 비 커와 70 x 10 m m 저 어 바.
- 1:1000 (무게: 볼륨) 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) 비 커에 압력가 이온된 수에 혼합. 약 200 rpm 24 h 또는 SDS 완전히 녹아 때까지 저 어 접시에 솔루션을 둡니다.
참고: 일반적으로 1 %SDS 솔루션의 2500 mL은 단일 인간의 신장 decellularize 충분 합니다. - 500 mL의 멸 균 진공 필터 솔루션을 전송 하 고 멸 균된 밀폐 가능한 용기에 필터링 합니다.
- 신장 조직의 처리
- 세척 및 고압 집게, 두 개의 hemostat의 쌍 클램프, 일반 서비스 등급이 위, 두 메스 블레이드 핸들, 알루미늄 호 일, 그리고 36 x 9 mm 볶음 바 덮여 1000 mL 비 커.
- Underpad 조직 문화 후드 라인. 비 커, 메 마른 조직 문....
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결과
KECM 히드로 네이티브 신장 microenvironment로 유사한 화학 성분과 신장 세포 배양에 대 한 매트릭스를 제공합니다. 조작 된 하이드로 겔, 하 신장 피 질 조직 전체 신장 기관 및 절단된 (그림 1)에서 기계적으로 격리 됩니다. 화학 세제 (그림 2A.1 A.3) 세제 입자 (그림 2A.4 A.6)를 제거 하는 물으로 린스 하 여 다음 decellularization 절연된 신장 피 질 ECM을 생성 합니다. 전형적인 기저 층 류 단백질 콜라겐 등 콜라겐 IV와 laminin의 구조 단백질 등을 확인 하는 조직학 평가-내가 유지 됩니다 유일한으로 vitronectin 주의 예외 (그림 2B
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토론
행렬 셀 동작을 제어 하는 중요 한 기계 및 화학 신호를 제공 합니다. 합성 hydrogels 복잡 한 3 차원 패턴을 지원 하지만 생리 매트릭스 microenvironments에서 다양 한 세포 외 신호를 제공 하지 못하는 수 있습니다. Hydrogels 네이티브 ECM에서 파생 된는 vivo에서 그리고 생체 외에서 연구를 위한 이상적인 물자 이다. 이전 연구를 사용 하 고 decellularized ECM hydrogels 호스트 면역학 응답33,34, 줄기 세포35,,3637 을 차별화 하는 방지 하기 위해 합성 바이오 코트 , 38, 2D와 소프트 리소 그래피.......
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
저자 린 마이크가 비 이미징 연구실 줄기 세포 및 재생 의학 및 LifeCenter 북 서 연구소에서 인정 하 고 싶습니다. 그들은 또한 건강의 국가 학회 교부 금, UH2/UH3 TR000504 (재 혁)에 (Y.Z.)에 DP2DK102258, NIH T32 훈련 부여 DK0007467 (R.J.N.), 북 서 신장 센터를에서 제한 없는 선물의 금융 지원을 인정 하 고 싶습니다는 신장 연구소입니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Preparation of Kidney Tissue | |||
| 5000 mL Beaker | Sigma-Aldrich | Z740589 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 436143 | |
| Sterile H2O | Autoclaved DI H2O | ||
| Stir Bar (70 x 10 mm) | Fisher Science | 14-512-128 | |
| 500 mL 진공 필터 | VWR | 97066-202 | |
| 교반 플레이트 | Sigma-Aldrich | CLS6795420D | |
| 1000 mL 비커 | Sigma-Aldrich | CLS10031L | |
| 집게 | Sigma-Aldrich | F4642 | 유사한 집게를 사용할 수 있습니다 |
| 가위 핸들 지혈구 클램프 | Sigma-Aldrich | Z168866 | |
| 해부 가위 | Sigma-Aldrich | Z265977 | |
| 메스 핸들, No. 4 | VWR | 25859-000 | 유사한 메스 핸들을 사용할 수 있습니다 |
| Scalpel Blade, No. 20 | VWR | 25860-020 | 유사한 메스 블레이드를 사용할 수 있습니다 |
| Stir Bar (38.1 x 9.5 mm) | Fisher Science | 14-513-52 | |
| 흡수성 언더패드 | VWR | 82020-845 | |
| 페트리 접시 (150 x 25 mm) | Corning | 430597 | |
| 오토클레이브 가능한 생물학적 위험 백 | VWR | 14220-026 | |
| 멸균 세포 여과기 (40 um) | Fisher Science | 22-363-547 | |
| 세포 배양 등급 물 | HyClone | SH30529.03 | |
| 30 mL 독립형 튜브 | VWR | 89012-778 | |
| ECM Gel | |||
| Tissue Homogenizer Machine | Polytron | PCU-20110 | |
| 동결 건조기 | Labconco | 7670520 | |
| 20 mL 유리 섬광 바이알 및 캡 | Sigma-Aldrich | V7130 | |
| Stir Bar (15.9 x 8 mm) | Fisher Science | 14-513-62 | |
| 돼지 위 점막에서 추출한 펩신 | Sigma-Aldrich | P7012 | |
| 0.01 N HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | 세포 배양 물로 0.01 N HCl로 희석 |
| Kidney ECM Gelation | |||
| 1 N NaOH (sterile) | Sigma-Aldrich | 415413 | 세포 배양 등급 물에서 1 N으로 희석 |
| 매체 199 | Sigma-Aldrich | M4530 | |
| 15 mL 원뿔형 튜브 | ThermoFisher | 339651 | |
| 세포 배양 배지 | ThermoFisher | 11330.032 | Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10082147 | |
| Antibiotic-Antimycotic 100X | Life Technologies | 15240-062 | |
| 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄, 피루브산 나트륨 용액( ITS-A) 100X | Life Technologies | 51300-044 | |
| 1mL 주사기 | 시그마-알드리치 | Z192325 | |
| 마이크로스파튤라 | 시그마-알드리치 | Z193208 |
참고문헌
- Lelongt, B., Ronco, P. Role of extracellular matrix in kidney development and repair. Pediatric Nephrology. 18 (8), 731-742 (2003).
- Yue, B. Biology of the Extracellular Matrix: An Overview. Journal of Glaucoma. 23, S20-S23 (2014).
- Miner, J. H.
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