방법 논문

날조는 신장 피 질 세포 외 매트릭스 파생 하이드로 겔

DOI:

10.3791/58314

⸱

2018년 10월 13일

 ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, University of Washington, 2Department of Bioengineering, Center for Cardiovascular Biology, Institute for Stem Cell and Regenerative Medicine, University of Washington, 3Department of Medicine, Kidney Research Institute, University of Washington

이 논문에서

요약

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여기 우리는 신장 피 질 세포 외 매트릭스 파생 히드로 네이티브 신장 세포 외 기질 (ECM) 구조 및 생 화 확 적인 구성 유지를 조작 하는 프로토콜을 제시. 제조 프로세스와 응용 프로그램을 설명 합니다. 마지막으로, 신장 관련 세포 및 조직 재생 및 생명 공학 지원 하기 위해이 하이드로 겔을 사용 하 여에 대 한 관점을 설명 합니다.

초록

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세포 외 기질 (ECM) 조직의 항상성 유지에 중요 한 생물 및 생 화 확 적인 신호를 제공 합니다. 현재 합성 hydrogels 체 외에서 세포 배양 하지만 부족 필요한 단백질과 리간드 컴포지션 셀에서 생리 적 행동을 이끌어내는 강력한 기계적인 지원을 제공 합니다. 이 원고는 적절 한 기계적 견고성 및 지원 생 화 확 적인 구성으로 신장 피 질 ECM 파생 된 하이드로 겔의 제조 방법을 설명합니다. 히드로 기계적 조직 및 decellularized 인간 신장 피 질 ECM solubilizing 조작 이다. 매트릭스도 생리 적인 기계 stiffnesses 겔 화 하면서 네이티브 신장 피 질 ECM 단백질 비율을 유지 합니다. 히드로 신장에 따라 피 질에서 파생 된 세포 생리 적인 조건 하에서 유지 될 수 있다 기질 역할을 합니다. 또한, 하이드로 겔 조성 장병의 미래 연구를 가능 하 게 병 환경을 모델링을 조작할 수 있습니다.

서론

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세포 외 기질 (ECM) 조직의 항상성 유지에 중요 한 생물 및 생 화 확 적인 신호를 제공 합니다. 복잡 한 분자 구성 조직의 구조 및 기능 속성을 조정합니다. 구조 단백질 셀 공간 인식 수 있으며 접착 및 마이그레이션1있습니다. 바운드 ligands 제어 셀 동작2세포 표면 수용 체 상호 작용. 신장 ECM 분자의 조성과 구조에 따라 해부학 적 위치, 발달 단계, 및 질병 상태3,4의 과다를 한 포함 되어 있습니다. ECM의 복잡성을 업과 신장 파생 셀 체 외공부에서 핵심 요소 이다.

ECM microenvironments 복제에 이전 시도 recellularization의 건설 기계를 만드는 decellularizing 전체 조직에 집중 했다. Decellularization 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) 등 화학 세제 또는 비 이온 세제, 수행 하 고 중 전체 장기 관류 또는 침수와 교 반 방법5,6,

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프로토콜

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인간의 신장 LifeCenter 북 서 윤리 지침을 장기 조달 단체의 협회에 의해 설정에 의해 고립 되었다. 이 프로토콜은 워싱턴 대학에 의해 제시 된 동물 관심과 셀 문화 지침을 따릅니다.

1입니다. 인간 신장 조직 준비

  1. Decellularization 솔루션의 준비
    1. 소독 5000 mL 비 커와 70 x 10 m m 저 어 바.
    2. 1:1000 (무게: 볼륨) 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) 비 커에 압력가 이온된 수에 혼합. 약 200 rpm 24 h 또는 SDS 완전히 녹아 때까지 저 어 접시에 솔루션을 둡니다.
      참고: 일반적으로 1 %SDS 솔루션의 2500 mL은 단일 인간의 신장 decellularize 충분 합니다.
    3. 500 mL의 멸 균 진공 필터 솔루션을 전송 하 고 멸 균된 밀폐 가능한 용기에 필터링 합니다.
  2. 신장 조직의 처리
    1. 세척 및 고압 집게, 두 개의 hemostat의 쌍 클램프, 일반 서비스 등급이 위, 두 메스 블레이드 핸들, 알루미늄 호 일, 그리고 36 x 9 mm 볶음 바 덮여 1000 mL 비 커.
    2. Underpad 조직 문화 후드 라인. 비 커, 메 마른 조직 문....

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결과

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KECM 히드로 네이티브 신장 microenvironment로 유사한 화학 성분과 신장 세포 배양에 대 한 매트릭스를 제공합니다. 조작 된 하이드로 겔, 하 신장 피 질 조직 전체 신장 기관 및 절단된 (그림 1)에서 기계적으로 격리 됩니다. 화학 세제 (그림 2A.1 A.3) 세제 입자 (그림 2A.4 A.6)를 제거 하는 물으로 린스 하 여 다음 decellularization 절연된 신장 피 질 ECM을 생성 합니다. 전형적인 기저 층 류 단백질 콜라겐 등 콜라겐 IV와 laminin의 구조 단백질 등을 확인 하는 조직학 평가-내가 유지 됩니다 유일한으로 vitronectin 주의 예외 (그림 2B

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토론

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행렬 셀 동작을 제어 하는 중요 한 기계 및 화학 신호를 제공 합니다. 합성 hydrogels 복잡 한 3 차원 패턴을 지원 하지만 생리 매트릭스 microenvironments에서 다양 한 세포 외 신호를 제공 하지 못하는 수 있습니다. Hydrogels 네이티브 ECM에서 파생 된는 vivo에서 그리고 생체 외에서 연구를 위한 이상적인 물자 이다. 이전 연구를 사용 하 고 decellularized ECM hydrogels 호스트 면역학 응답33,34, 줄기 세포35,,3637 을 차별화 하는 방지 하기 위해 합성 바이오 코트 , 38, 2D와 소프트 리소 그래피.......

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공개 사항

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저자는 공개 없다.

감사의 글

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저자 린 마이크가 비 이미징 연구실 줄기 세포 및 재생 의학 및 LifeCenter 북 서 연구소에서 인정 하 고 싶습니다. 그들은 또한 건강의 국가 학회 교부 금, UH2/UH3 TR000504 (재 혁)에 (Y.Z.)에 DP2DK102258, NIH T32 훈련 부여 DK0007467 (R.J.N.), 북 서 신장 센터를에서 제한 없는 선물의 금융 지원을 인정 하 고 싶습니다는 신장 연구소입니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Preparation of Kidney Tissue
5000 mL BeakerSigma-AldrichZ740589
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)Sigma-Aldrich436143
Sterile H2OAutoclaved DI H2O
Stir Bar (70 x 10 mm)Fisher Science14-512-128
500 mL 진공 필터VWR97066-202
교반 플레이트Sigma-AldrichCLS6795420D
1000 mL 비커Sigma-AldrichCLS10031L
집게Sigma-AldrichF4642유사한 집게를 사용할 수 있습니다
가위 핸들 지혈구 클램프Sigma-AldrichZ168866
해부 가위Sigma-AldrichZ265977
메스 핸들, No. 4VWR25859-000유사한 메스 핸들을 사용할 수 있습니다
Scalpel Blade, No. 20VWR25860-020유사한 메스 블레이드를 사용할 수 있습니다
Stir Bar (38.1 x 9.5 mm)Fisher Science14-513-52
흡수성 언더패드VWR82020-845
페트리 접시 (150 x 25 mm)Corning430597
오토클레이브 가능한 생물학적 위험 백VWR14220-026
멸균 세포 여과기 (40 um)Fisher Science22-363-547
세포 배양 등급 물HyCloneSH30529.03
30 mL 독립형 튜브VWR89012-778
ECM Gel
Tissue Homogenizer MachinePolytronPCU-20110
동결 건조기Labconco7670520
20 mL 유리 섬광 바이알 및 캡Sigma-AldrichV7130
Stir Bar (15.9 x 8 mm)Fisher Science14-513-62
돼지 위 점막에서 추출한 펩신Sigma-AldrichP7012
0.01 N HClSigma-Aldrich320331세포 배양 물로 0.01 N HCl로 희석
Kidney ECM Gelation
1 N NaOH (sterile)Sigma-Aldrich415413세포 배양 등급 물에서 1 N으로 희석
매체 199Sigma-AldrichM4530
15 mL 원뿔형 튜브ThermoFisher339651
세포 배양 배지ThermoFisher11330.032Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco10082147
Antibiotic-Antimycotic 100XLife Technologies15240-062
인슐린, 트랜스페린, 셀레늄, 피루브산 나트륨 용액( ITS-A) 100XLife Technologies51300-044
1mL 주사기시그마-알드리치Z192325
마이크로스파튤라시그마-알드리치Z193208

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lelongt, B., Ronco, P. Role of extracellular matrix in kidney development and repair. Pediatric Nephrology. 18 (8), 731-742 (2003).
  2. Yue, B. Biology of the Extracellular Matrix: An Overview. Journal of Glaucoma. 23, S20-S23 (2014).
  3. Miner, J. H.

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Kidney Cortex ECMExtracellular Matrix HydrogelDecellularized TissueTissue HomogenizationLyophilization ProcessPepsin DigestionGelation ProtocolCollagen IV DetectionHuman Kidney CellsMicrophysiological Systems

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