Method Article

실시 한 형광 현미경으로 여러 영상 모드

DOI:

10.3791/58320

⸱

October 28th, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Chicago, 2The Institute for Biophysical Dynamics, University of Chicago, 3Faculty of Chemistry, Wrocław University of Science and Technology, 4Nikon Instruments Inc.

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에 우리가 현재 기존의 피 형광 이미징, 단일 분자 검출 기반 슈퍼 해상도 이미징, 및 다중 색상 단일 분자 검출 병합, 통합된 현미경 시스템 구축의 실용적인 가이드 포함 단일 분자 형광 공명 에너지 비용 효율적인 방법으로 하나의 설정으로 이미지를 전송 합니다.

Abstract

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형광 현미경 검사 법 생물학 분자에 제자리에서 감지 하 고 그들의 역학과 실시간으로 상호 작용을 모니터링 하는 강력한 도구입니다. 기존의 피-형광 현미경 검사 법, 뿐만 아니라 다양 한 이미징 기술은 특정 실험 목표를 달성 하기 위해 개발 되었습니다. 널리 사용 되는 기술의 일부 구조적 변화와 angstrom 해상도와 단일 분자 검출 기반 분자 상호 작용을 보고할 수 있는 단일 분자 형광 공명 에너지 전달 (smFRET) 포함 슈퍼 해상도 (SR) 이미징, twentyfold 회절 제한 된 현미경 검사 법에 비해 공간 해상도를 약 10를 강화 수 있습니다. 여기에 우리가 고객 설계 통합된 시스템을 병합 한 현미경, 기존의 피 형광 이미징, 단일 분자 검출 기반 SR 이미징, 및 다중 색상 단일 분자 검출을 포함 한 여러 이미징 방법 제시 smFRET 이미지를 포함 하 여. 다른 이미징 방법은 쉽고 reproducibly 광학 요소를 전환 하 여 얻을 수 있습니다. 이 설정 루틴 및 감소 된 비용 및 개별 목적에 대 한 별도 현미경 건물 상대적인 공간에 다양 한 이미징 실험에 대 한 필요와 함께 생물 과학에 어떤 연구소에 의해 채택 하는 것이 더 쉽습니다.

Introduction

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형광 현미경 현대 생물 과학 연구를 위한 중요 한 도구 이며 형광 이미징 정기적으로 많은 생물학 실험실에서 수행 됩니다. Fluorophores에 대 한 관심의 생체에 태그를 지정, 우리가 직접 현미경 그들을 시각화 하 고 지역화, 구조, 상호 작용, 및 조립 상태 vivo 또는 생체 외에서시간에 따른 변화를 기록 수 있습니다. 기존의 형광 현미경 있다 회절 한정 된 공간 해상도 측면 방향으로 200 ~ 300 nm와 ~ 500-700 nm 축 방향1,2에 이다, 따라서, 이미징의 100s에 제한 나노미터-미크론 규모입니다. 회절 한계를 깰 수 있는 다양 한 SR microscopies 분자 어셈블리 또는 조직에 미세한 세부 정보를 공개 하기 위해 개발 되었습니다. SR를 달성 하는 데 사용 하는 전략 등이 자극된 방출 소모 (호텔 위치) 현미경3,4 구조화 조명 현미경 (SIM)5,6, 등의 비선형 광학 효과

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Protocol

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1. 현미경 설계 및 조립

  1. 여기 경로
    참고: 여기 경로 레이저, 미분 간섭 콘트라스트 (DIC) 구성 요소, 현미경 신체와 그것의 조명 팔을 포함 됩니다.
    1. 진동 절연 광학 테이블을 준비 합니다. 예를 들어 48 x 96 x 12'의 구조적 댐핑 테이블 모든 구성 요소에 대 한 충분 한 공간을 제공합니다.
      참고: (예를 들어, 21.4 ± 0.55 ° C) 온도 제어와 방에 설정을 빌드하십시오. 온도 안정성은 광학 줄 맞춤을 유지 하기 위해 중요 합니다.
    2. 광학 섬유 연결에 대 한 조명 팔으로는 현미경 몸 설치 100 기름 침수 TIRF 목표 렌즈, 그리고 DIC 구성 요소 X는.
    3. 4 레이저 헤드 배치 (647 nm, 561 nm, 488 nm, 그리고 405 nm, 그림 1B에서 둘러싸고) 광학 테이블에 그들의 열 싱크 그리고 있는지 확인 내보낸된 레이저 광선 같은 높이 위치 (예: 좋은 안정성을 보장 하기 위해 가능한 한 짧게 3').
      참고: 경우 레이저 머리 다른 레이저 보다 짧은 높이에, 아래 적절 한 두께와 알루미늄 플레이트를 넣어. 항상 열 싱크 및 최고의 방열 (

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Results

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이 현미경에는 유연 하 고 다른 이미징 방법 전환 재현할 수 있습니다. 여기 우리가 각 영상 모듈와 수집 된 샘플 이미지를 보여줍니다.

그림 5D 는 SR 중 깜박이에 분자의 PSF를 보여 줍니다. 같은 이미지의 수천은 최종 명함 이미지 (그림 5E)를 생성 하 재건. 그림 5E 그림 7A에피 형광 이미지와 같이 같은 세균성 규제 RNAs를 보여줍니다. 그림 7 U2OS 포유류 세포에서 대장균 세포에 작은 규제 RNA는 mRNA의 대표적인 피 형광 이미지를 보여준다. 두 RNAs

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Discussion

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이 하이브리드 현미경 시스템 여러 현미경을 구입할 필요가 없습니다. 광학 테이블, 테이블 설치 노동, 소프트웨어 및 워크스테이션을 포함 한 모든 부분에 대 한 비용 총 약 230000 달러 이다. 사용자 정의 가공 부품, 매기 렌즈 등 3 차원 렌즈 비용 약 $700 (비용은 다른 기관에서 실제 비용에 따라 달라 집니다). 전형적인 상용 통합 시스템 위한 단일 분자 검출 기반 SR 현미경 비용 이상의 $300000 ~ 400000 및 하지 쉽게 smFRET 측정에 사용할 수 있는 또는 보기의 적절 한 필드에 대 한 피 이미징 하얀 빛 없이 소스입니다. 따라서, 여기에 제시 된 접근 이미징 기능 여러 현미경 훨씬 저렴 한 비용에 해당를 얻을 수 있습니다.

이 변조 된 현미경 시스템 서로 다른 제조 업체에서 현미경 시체를 기반으로 수 있습니다. 3 차원 렌즈 방출 스플리터, 신체 내에서 현미경, 또는 필터 휠 및 객관적인 nosepiece 사이의 사용 가능한 공간에 안으로 포함 하는.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 없다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

J.F. 인정 Searle 학자 프로그램 및 NIH 감독의 새로운 혁신 상을에서 지원 합니다. 저자 폴 Selvin 연구소 (일리노이 대학, 어바나-샴페인) 3 차원 렌즈 위치에서 유용한 제안을 인정 합니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Nikon Ti-E 현미경 스탠드NikonTi-E
대물 렌즈Nikon100X NA 1.49 CFI HP TIRF
현미경 이미징 소프트웨어NikonNIS-Elements Advanced Research/HCHC에는 SR 이미징에 사용되는 프로그래밍된 수집 모듈인 "JOBS" 모듈이 포함되어 있습니다.
조명 암NikonTi-TIRF-EM 전동 조명기 Unit M이 암에는 확대 렌즈용 슬롯이 있습니다.
블록NikonTi-A이것은 필터 터렛에 설치됩니다.
Z-드리프트 보정 시스템NikonPFS이 시스템은 대물 노즈피스의 스텝 모터, IR LED 및 검출기로 구성됩니다.
광학 테이블 탑TMC783-655-02R
광학 테이블 베이스TMC14-426-35
647 nm 레이저Cobolt90346 (0647-06-01-0120-100)변조 레이저 다이오드 647nm 120mW 포함 레이저 헤드, CDRH 컨트롤 박스, USB 케이블 및 PSU(전원 공급 장치)
561 nm 레이저코히런트1280721OBIS 561nm LS 150mW 레이저 시스템
488 nm 레이저코 볼트90308 (0488-06-01-0060-100)변조 레이저 다이오드 488nm 60mW 포함 레이저 헤드, CDRH 컨트롤 박스, USB 케이블 및 PSU (전원 공급 장치)
405 nm 레이저CrystalaserDL405-025-O405 (+/- 5) nm, 25mW, 원형 , M2 < 1.3, 저잡음, CW, TTL 최대 20MHz. TTL 및 용 BNC 커넥터 2 개 아날로그 조정
방열판Cobolt11658 (HS-03)두 장치, 팬이없는 방열판 HS-03, 647nm 및 488nm 레이저 용 방열판
Coherent1193289Obis 방열판 팬, 165 x 50 x 50 mm 561nm 레이저
CAB-USB-miniUSBCobolt109082 개, 647 nm 및 488 nm 레이저 용 통신 케이블
높이 조정 용 알루미늄McMaster-Carr9146T35다목적 6061 알루미늄, 직사각형 바, 4MM X 40MM, 높이 조정을 위한 561nm 레이저 알루미늄 올리기 위한 1' 길이
McMaster-Carr8975K248다목적 6061 알루미늄, 1-1/4" 두께 X 3" 너비 X 1' 405 nm 레이저
BNC 케이블L-comCC58C-6RG58C 동축 케이블, BNC 남성 / 남성, 6.0 ft
BNC 어댑터L-comBA1087동축 어댑터, BNC 벌크헤드, 접지
SMA-BNC 어댑터HODSMA-870Cobolt MLD 레이저에는 SMA 인터페이스가 있으므로 이 어댑터는 BNC 연결에 사용됩니다.
SMB-BNC 어댑터Fairview MicrowaveFMC1638316-12SMB 플러그-BNC 암 벌크헤드 케이블 RG316 Coherent Obis 레이저용 12인치
동축 데이터 수집 카드National InstrumentsPCI-672313비트, 32채널, 800kS/s 아날로그 출력 레이저, DIC LED 등을 제어하기 위한 디바이스
배리어 필터 휠 컨트롤러셔터 계측기Lambda 10-B광학 필터 체인저
방출 스플리터CairnOptoSplit III
이색성 빔스플리터ChromaT640LPXR-UF2OptoSplit III에서 적색 방출과 녹색 방출을 분리하는 이색
빔스플리터ChromaT565LPXR-UF2에서 녹색 및 적색 방출과 청색 방출을 분리하는 이색성 빔스플리터
2개, OptoSplit III의 적색 방출(예: Alexa Fluor 647) 및 배리어 필터 휠
방출 필터ChromaET595/50M2개, OptoSplit III의 황색/녹색 방출(예: Cy3B)용 방출 필터 및 배리어 필터
방출 필터ChromaET525/50M2개의 장치, OptoSplit III의 청색 방출(예: Alexa Fluor 488/GFP)용 방출 필터와 배리어 필터 휠
방출 필터SemrockFF02-447/60-25배리어 필터 휠에 설치된 보라색 방출용 방출 필터(예: DAPI/Alexa Fluor 405), 배리어 필터 휠
Dichroic beamsplitterChromazt405/488/561/647/752rpc-UF3에 설치현미경 본체 내부의 647, 561, 488 및 405nm 레이저 여기를 위한 다대역 이색성 빔 스플리터
DAPI 현미경본체에 설치된Chroma49000
Nikon 레이저/TIRF filtercubeChroma91032
590 장역 통과 필터647nm 레이저와 561nm 레이저
이미결합된 647nm 및 561nm 레이저를 488nm 레이저
470 장역 통과 필터이미 결합된 647nm, 561nm 및 488nm 레이저를 405nm 레이저와 결합ChromaT470LPXR-UF1
레이저 클린업 필터 (647)647nm 레이저의 다른 파장을 청소하기 위한Chromazet640/20x
레이저 클린업 필터 (488)SemrockLL01-488-25488nm 레이저에서 다른 파장을 청소하기 위해
LED 광원ExcelitasX-Cite120LEDDAPI 이미징에만 사용
미러 마운트뉴 포트SU100-F3K
광학 포스트뉴 포토PS-2
클램핑 포크뉴 포트PS-F
파워 미터뉴 포트PMKIT레이저 파워 측정용
Dichroic beamcombiner 마운트Edmund Optics58-872C-Mount Kinematic Mount, 레이저 여기 어셈블리에 dichroic beamcombiner를 고정하기 위한
리테이닝 링ThorlabsCMRRdichroic beamcombiner 마운트에 사용됨
파이버 어댑터 플레이트ThorlabsSM1FCFC/PC 파이버 어댑터 플레이트(외부 SM1 포함) (1.035"-40) 나사산
Z축 변환 마운트ThorlabsSM1ZZ-축 번역 마운트, 30 mm 케이지 호환
무채색 더블렛 렌즈ThorlabsAC050-008-A-MLØ 5 mm, 장착된 무채색 이중선, AR 코팅: 400 - 700 nm
케이지 플레이트ThorlabsCP1TM0930 mm 케이지 플레이트, M9 x 0.5 내부 나사, 8-32 탭
케이지 어셈블리 로드ThorlabsER4케이지 어셈블리 로드, 4" 길이, Ø 6 mm
케이지 장착 브래킷ThorlabsCP02B30 mm 케이지 장착 브래킷
단일 모드 광섬유ThorlabsP5-405BPM-FC-2패치 케이블, PM, FC/PC to FC/APC, 405 nm, Panda, 2 m
다중 모드 광섬유ThorlabsM42L01Ø 50 &마이크로; m, 0.22 NA, FC/PC-FC/PC 파이버 패치 케이블, 1 m
무채색 이중색 렌즈 (매그 렌즈)ThorlabsACN127-025-AACN127-025-A - f=-25.0 mm, Ø 1/2" 무채색 이중색, ARC: 400-700 nm, "매그 렌즈"의 오목한 렌즈
무채색 이중색 렌즈 (매그 렌즈)ThorlabsAC127-050-Af=50.0 mm, Ø 1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, "mag lens"의 볼록한 렌즈
ThorlabsSM05PRRSM05 플라스틱 보유 링 Ø 1/2" 렌즈 튜브 및 마운트, "매그 렌즈"용
나일론 팁 나사ThorlabsSS3MN6M3 x 0.5 나일론 팁 세트 나사, 6mm 길이, "3D 렌즈" 고정용
3D 렌즈CVI 레이저 광학RCX-25.4-50.8-5000.0-C-415-700f=10m, 직사각형 원통형 렌즈
EMCCD 카메라AndoriXon Ultra 888
100nm 다채널 비드ThermoT7279, TetraSpeck 미세구
적색 염료ThermoAlexa Fluor 647
황록색 염료GE HealthcareCy3
녹색 염료GE HealthcareCy3B
청색 염료ThermoAlexa Fluor 488
분석 올리기를 위한 길이 된 성 OptoSplit III 방출 필터 Chroma ET700/75M 휠 필터 세트 525 장역 통과 필터 Chroma 결합을 위한 Chroma T590LPXR-UF1와 결합하는 T525LPXR-UF1 하는

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lipson, S. G., Lipson, H., Tannhauser, D. S. Optical physics. , Cambridge University Press. Cambridge, UK; New York, NY. (1995).
  2. Török, P., Wilson, T. Rigorous theory for axial resolution in confocal microscopes. Optics Communications. 137 (1-3), 127-135 (1997).
  3. Klar, T. A., Hell, S. W.

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