이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

실시 한 형광 현미경으로 여러 영상 모드

9.5K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/58320

⸱

2018년 10월 28일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Chicago, 2The Institute for Biophysical Dynamics, University of Chicago, 3Faculty of Chemistry, Wrocław University of Science and Technology, 4Nikon Instruments Inc.

이 논문에서

요약

여기에 우리가 현재 기존의 피 형광 이미징, 단일 분자 검출 기반 슈퍼 해상도 이미징, 및 다중 색상 단일 분자 검출 병합, 통합된 현미경 시스템 구축의 실용적인 가이드 포함 단일 분자 형광 공명 에너지 비용 효율적인 방법으로 하나의 설정으로 이미지를 전송 합니다.

초록

형광 현미경 검사 법 생물학 분자에 제자리에서 감지 하 고 그들의 역학과 실시간으로 상호 작용을 모니터링 하는 강력한 도구입니다. 기존의 피-형광 현미경 검사 법, 뿐만 아니라 다양 한 이미징 기술은 특정 실험 목표를 달성 하기 위해 개발 되었습니다. 널리 사용 되는 기술의 일부 구조적 변화와 angstrom 해상도와 단일 분자 검출 기반 분자 상호 작용을 보고할 수 있는 단일 분자 형광 공명 에너지 전달 (smFRET) 포함 슈퍼 해상도 (SR) 이미징, twentyfold 회절 제한 된 현미경 검사 법에 비해 공간 해상도를 약 10를 강화 수 있습니다. 여기에 우리가 고객 설계 통합된 시스템을 병합 한 현미경, 기존의 피 형광 이미징, 단일 분자 검출 기반 SR 이미징, 및 다중 색상 단일 분자 검출을 포함 한 여러 이미징 방법 제시 smFRET 이미지를 포함 하 여. 다른 이미징 방법은 쉽고 reproducibly 광학 요소를 전환 하 여 얻을 수 있습니다. 이 설정 루틴 및 감소 된 비용 및 개별 목적에 대 한 별도 현미경 건물 상대적인 공간에 다양 한 이미징 실험에 대 한 필요와 함께 생물 과학에 어떤 연구소에 의해 채택 하는 것이 더 쉽습니다.

서론

형광 현미경 현대 생물 과학 연구를 위한 중요 한 도구 이며 형광 이미징 정기적으로 많은 생물학 실험실에서 수행 됩니다. Fluorophores에 대 한 관심의 생체에 태그를 지정, 우리가 직접 현미경 그들을 시각화 하 고 지역화, 구조, 상호 작용, 및 조립 상태 vivo 또는 생체 외에서시간에 따른 변화를 기록 수 있습니다. 기존의 형광 현미경 있다 회절 한정 된 공간 해상도 측면 방향으로 200 ~ 300 nm와 ~ 500-700 nm 축 방향1,2에 이다, 따라서, 이미징의 100s에 제한 나노미터-미크론 규모입니다. 회절 한계를 깰 수 있는 다양 한 SR microscopies 분자 어셈블리 또는 조직에 미세한 세부 정보를 공개 하기 위해 개발 되었습니다. SR를 달성 하는 데 사용 하는 전략 등이 자극된 방출 소모 (호텔 위치) 현미경3,4 구조화 조명 현미경 (SIM)5,6, 등의 비선형 광학 효과 7, 확률적 광학 재건 현미경 (폭풍)8 , photoactivated 지역화 현미경 (팜)9, MINFLUX10등 둘의 조합 등 단일 분자의 확률론 탐지. 이러한 SR microscopies 중 단일 분자 검출 기반 SR 현미경 단일 분자 현미경 설정에서 상대적으로 쉽게 수정할 수 있습니다. 반복적인 활성화 및 photoactivatable 형광 성 단백질 (FPs) 또는 관심의 생체에 태그 사진 전환 염료의 이미징, 공간 해상도 10-20 nm11를 도달할 수 있다. 분자 상호 작용 및 구조적 정보를 실시간, angstrom 나노미터 분해능의 역학이 필요 합니다. smFRET12,13 는이 해상도 달성 하기 위해 하나의 방법입니다. 일반적으로, 관심사의 생물학 질문에 따라 다른 공간 해상도 이미징 방법 필요 합니다.

일반적으로, 이미지의 각 유형에 대 한 특정 여기 / 방출 광 구성 필요 합니다. 예를 들어, 단일 분자 검출에 대 한 가장 일반적으로 사용 되는 조명 방법 중 하나는 특정 자극 각도 프리즘을 통해 또는 대물 렌즈를 통해 달성 될 필요가 총 내부 반사 (사격)을 통해서이다. SmFRET 검출에 대 한 기증자와 수락자 염료에서 방출 필요가 공간적으로 분리 하 고는 전자-멀티, 전 하 결합 소자 (EMCCD), 거울 및 dichroic 빔 스플리터 집합으로 달성 될 수 있는의 다른 부분에 지시 배출 경로에 배치. 3 차원 (3 차원) SR 이미징, 원통형 렌즈14등 광학 부품 방출 경로에 난시 효과 일으킬 필요 합니다. 따라서, homebuilt 또는 상업적으로 사용할 수 있는 통합된 현미경 이미징 방법의 각 유형에 대 한 일반적으로, 기능적으로 전문화, 고 유연에 같은 설정 다른 이미징 방법 사이 전환 하는. 여기에 우리가 현재 세 가지 다른 이미징 방법 사이 조정 하 고 재현할 수 스위치를 제공 하는 비용 효율적인, 하이브리드 시스템: 회절 제한 된 해상도, 단일 분자 검출 기반 SR 기존의 피 형광 이미징 이미징, 그리고 smFRET (그림 1A) 이미지를 포함 하 여 다 색 단일 분자 검출. 특히, 여기에 제시 된 설정 멀티 컬러 여기 입력된 레이저 섬유 커플링을 포함 하 고 있습니다 여기 경로에 상업 조명 팔 피 모드 및 사격 모드 사이 전환 하려면 여기 각도의 제어 프로그램. 배출 경로에 이동식 homebuilt 원통형 렌즈 카세트 3 차원 SR 이미징 위한 현미경 신체 내 되 고 상업 빔 스플리터는 여러 배출 채널 검색을 선택적으로 사용할 수 있는 EMCCD 카메라 앞 동시에.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

1. 현미경 설계 및 조립

  1. 여기 경로
    참고: 여기 경로 레이저, 미분 간섭 콘트라스트 (DIC) 구성 요소, 현미경 신체와 그것의 조명 팔을 포함 됩니다.
    1. 진동 절연 광학 테이블을 준비 합니다. 예를 들어 48 x 96 x 12'의 구조적 댐핑 테이블 모든 구성 요소에 대 한 충분 한 공간을 제공합니다.
      참고: (예를 들어, 21.4 ± 0.55 ° C) 온도 제어와 방에 설정을 빌드하십시오. 온도 안정성은 광학 줄 맞춤을 유지 하기 위해 중요 합니다.
    2. 광학 섬유 연결에 대 한 조명 팔으로는 현미경 몸 설치 100 기름 침수 TIRF 목표 렌즈, 그리고 DIC 구성 요소 X는.
    3. 4 레이저 헤드 배치 (647 nm, 561 nm, 488 nm, 그리고 405 nm, 그림 1B에서 둘러싸고) 광학 테이블에 그들의 열 싱크 그리고 있는지 확인 내보낸된 레이저 광선 같은 높이 위치 (예: 좋은 안정성을 보장 하기 위해 가능한 한 짧게 3').
      참고: 경우 레이저 머리 다른 레이저 보다 짧은 높이에, 아래 적절 한 두께와 알루미늄 플레이트를 넣어. 항상 열 싱크 및 최고의 방열 (그림 1B)에 대 한 광학 테이블 사이의 최대 접촉이 되도록 합니다. 레이저는 SR 이미징 충분히 강력 할 필요가 있다. 자료의 표를 참조 하십시오. 레이저 다이오드 레이저 앞 필터를 청소 하는 것이 좋습니다.
    4. 데이터 수집 카드 주변 기기 구성 요소 상호 연결 (PCI) 인터페이스를 통해 워크스테이션에 설치 하 고이 카드와 함께 레이저를 연결 합니다. 트랜지스터-트랜지스터 논리 (TTL) 출력으로 레이저의 ON/OFF 동작 및이 카드 (그림 1C)의 아날로그 출력 그들의 전원 조정 제어 합니다. 현미경 몸 뿐만 아니라 적절 한 현미경 이미징 (상업 또는 homebuilt) 데이터 수집 카드를 제어 하는 소프트웨어를 설치 합니다.
    5. 그들의 각각 마운트를 거울과 dichroic 빔 스플리터 (590, 525, 및 긴 필터를 통과 하는 470)를 탑재 합니다. 매우 안정적인 미러 마운트를 사용 하 여 거울에 대 한. 않도록 모든 dichroic 빔 스플리터 (그림 1D)의 반지를 유지와 함께 원형 스플리터를 사용 합니다.
    6. 레이저 광선 (그림 1B)를 결합 하 여 광학 테이블에 거울과 dichroic 빔 스플리터를 놓습니다. 가장 안정 된 맞춤을 달성 하기 위해 전체 배치를, 소형 만들고 1'-두께 광 게시물을 사용 하 여. 이후 파장이 짧은 빛 발산 공중에 더 짧은 파장 레이저는 광섬유 커플링 (그림 1B)에 가까이 있도록 레이저를 정렬 합니다.
    7. 단일 모드 광섬유에 레이저 광선을 결합 합니다. 이렇게 하려면 다음 단계를 통해 케이지 시스템에서 섬유 커플러를 구축:
      1. (그림 1E, 왼쪽 패널) z 축 번역 마운트에서 섬유 어댑터 플레이트를 탑재 합니다.
      2. 무색 남자 용 상의 렌즈 마운트 (초점 거리 = 7.5 m m)는 감 금 소 접시 (그림 1E, 왼쪽에서 두 번째 패널).
      3. 확장 막대 감 금 소를 형성 하 여 위의 두 부분을 연결 합니다. 부류 1'-두꺼운 광 게시물 (그림 1E, 중간 패널)에 장착 된 광학 테이블에 케이지를 탑재 합니다.
      4. 먼저 단일 모드 광섬유 (커플러 FC/APC 끝) 647-nm 레이저를 맞춥니다.
        참고: 단일 모드 광섬유를 사용 하기 전에 멀티 모드 광섬유를 사용 하 여 거친 정렬 정렬 과정을 도울 수 있다. 무색 남자 용 상의 렌즈 (그림 1E, z 축 번역 마운트를 조정 하 여) 섬유 어댑터 플레이트 사이의 거리 뿐만 아니라 dichroic 빔 스플리터 (그림 1D, 조정 손잡이 의해), 그리고 거울의 각도 조정 얻을 섬유를 통해 최대 레이저 전원 출력입니다.
      5. 첫 번째 레이저의 맞춤 완료 되 면, 일시적으로의 쌍을 설치 하 고 하나 하나 레이저의 나머지 부분 (그림 1 층)을 정렬. 파워 미터와 맞춤 효율성을 확인 하십시오.
      6. 레이저의 반사를 줄이기 위해 어댑터 플레이트 앞 한 아이리스를 남겨 주세요.
        참고: 강력한 다시 반사 레이저 소스의 수명 줄일 수 있습니다. 선택적으로, 반사를 완전히 제거 하려면 각 레이저 머리 앞 광 아이 솔 레이 터를 설치할 수 있습니다.
    8. (그림 1 H) 현미경의 조명 팔을 광섬유의 다른 쪽 끝을 연결 합니다.
    9. 디자인 하 고 "확대 렌즈 (마그네틱 렌즈)" 다음 단계를 통해 설치:
      참고: 레이저는 샘플의 피 형광 이미징에 사용할 수 있지만 각 레이저의 좁은 빔 크기 제한 지역 여러 번 해당 카메라 센서의 실제 크기 보다 작은 샘플의 조명된 영역 특히 최신 (함께 대각선 길이 기존의 11.6 m m 길이에 비해 18.8 m m) 카메라. 따라서, 그것은 샘플의 크고 아첨 조명 달성 하 빔 확장 하는 것이 좋습니다.
      1. 조명 팔 (그림 1 H)에 들어갈 수 있는 탄 창 렌즈 디자인.
        참고: 매기 렌즈의 디자인 설치 됩니다 어디에 따라 달라 집니다. 레이저 광선은 조명을된 ( 토론참조) 후 어떤 자리에 설치 될 수 있습니다 하지만 그림 1 H 조명 팔에서 설치의 예를 보여줍니다. 컴퓨터 지원 설계 및 제도 소프트웨어와 함께 그것을 디자인.
      2. 장소 두 achromatic 렌즈, 한 오목 (초점 거리 f1=), 볼록 하나 (초점 거리 f2=) f1 그들의 촛점의 합계에 동등한 거리와 집에서 만든 매기 렌즈 홀더 (그림 2A 및 2 C) + f2 = (-25) + 50 = 25 m m (그림 2B).
        참고: 초점 길이의이 선택, 매기 렌즈 확장 빔을 f2/ | f1| = 2 폴드입니다. 매기 렌즈 다양성을 제공합니다. 그것은 일반 조명 광선 (그림 2D)를 확대 하지 않고 다시 시작을 제거 하거나 강한 자극 강도 달성 하기 위해 레이저 광선을 초점을 반대 방향으로 삽입 될 수 있습니다.

2. 배출 경로

참고: 배출 경로 이동식 원통형 렌즈, 배리어 필터 휠, 방출 스플리터, 그리고 EMCCD 카메라 (그림 1G)의 구성 됩니다. 최고의 포인트를 달성 하기 위해 단일 분자의 기능 (PSF) 확산, DIC 프리즘은 대물 렌즈에서.

  1. 사용자 정의 디자인 수동 DIC 분석기에 들어갈 수 있는 원통형 렌즈 (3 차원 렌즈) 카세트 현미경 몸 (그림 3C)에 슬롯을 삽입 합니다.
    참고:이 디자인 분석기 블록 필터 포 탑에 삽입할 수 있습니다 이후 DIC 분석기를 타협은 하지.
  2. 카세트에 초점 거리의 10 m의 3 차원 렌즈를 놓고 모든 단일 분자14의 z 좌표를 추출 하는 데 필요한 난시 효과 만드는 방출 빔 경로에 삽입 합니다.
    참고: 필요에 따라 3 차원 렌즈 카세트 놓일 수 있다 또는 방출 경로 (그림 3C).
  3. 현미경 신체 내부 필터 포 탑에서 멀티 밴드 dichroic 빔 스플리터를 설치 합니다.
  4. 배기 필터를 설치 합니다.
    참고: 방출 필터 기본 fluorophores에 따라 선택 됩니다. 이미징 모듈에 따라 다른 위치에 배치 하는 방출 필터는 아래 설명 된 대로 사용 됩니다.
    1. 순차적 멀티 컬러 피-형광 이미징 또는 SR 이미징, 채널 스위치 (그림 1G) 동안 현미경 신체에 진동을 최소화 하기 위해 현미경 시체 옆 연결 배리어 필터 휠에 방출 필터를 사용 합니다.
    2. 동시 멀티 검색 (예를 들어, smFRET 실험), 방출 스플리터 (확인 단계 4 자세한)에 설정 하는 다른 필터를 배치 합니다.
      참고: 일반적으로, 상업적인 방출 스플리터는 두 전환 모드 (즉, "약혼" 또는 "무시" 모드). 2 색 성 빔 스플리터 및 3 개의 방출 필터 필터 큐브 chromatically 동시 멀티 컬러 이미징 ("약혼된" 모드)에 대 한 방출 빛을 분리 하는 ("트리플 큐브," 그림 4C 와 4d). 배리어 필터 휠에 빈 슬롯 트리플 큐브와 함께에서 사용 됩니다. 다른 한편으로, 순차적 멀티 컬러 이미징, 트리플 큐브 ("우회 큐브," 그림 4A 와 4 D) 내부 거울은 큐브도 바뀝니다.
  5. 배출 경로의 마지막 부분으로 EMCCD 카메라를 설치 합니다. 빠른 프레임 속도 달성 하기 위해 USB PCI 연결을 활용 합니다.
    참고: EMCCD 카메라는 가장 중요 한 단일 분자 검출을 위한 좋지만 고급 sCMOS 카메라 대안이 될 수 있습니다.

3. 회절 제한 피 여기 이미징

  1. 피-모드 조명 팔에서을 여기 레이저 부수적 각도 조정 합니다.
  2. (그림 3C, 오른쪽 패널) 종사 하는 경우 3 차원 렌즈를 분리 합니다.
  3. 우회 큐브 방출 스플리터 (그림 4A 및 4E, 하단 패널)에 삽입 합니다.
  4. (선택 사항) 확대 조명 영역 (그림 2D, 왼쪽된 패널)에 대 한 매기 렌즈를 삽입 합니다.
    참고: 매기 렌즈와 기름 침수 렌즈 X 100의 사용, 약 91 x 91 µ m2 수 수 조명 균등 하 게, 백색 광원을 사용 하 여 여러 필터 큐브 필요가 없습니다.
  5. 시간 경과 이미지 및/또는 Z-스택, 현미경 이미징 소프트웨어 멀티 채널을 사용 합니다.
    참고: 여러 프로그램이 있다 현미경 이미징, 현미경 제조 업체에서 뿐만 아니라 제 3 자 회사 또는 오픈 소스 개발자에서 사용할 수 있습니다.

4. 멀티 채널 단일 분자 이미징 등 smFRET

참고: 어떤 파장을 가진 모든 방출 방출 스플리터에 필터/dichroic 빔 스플리터의 두 번째 집합에 도달할 수 있도록 배리어 필터 바퀴에서 "빈" 위치로 이동 합니다.

  1. 다 색을 설정 하려면 표면 움직일 분자15 TIRF 여기, smFRET 측정을 포함 하 여를 사용 하 여 단일 분자 검출 여기 레이저 부수적 각도 TIRF 각도를 조정 합니다. 매기 렌즈와 3 차원 렌즈를 분리 합니다.
  2. 다음 단계를 통해 방출 스플리터 (그림 1G)에 참여 3 채널 모드:
    1. "교정 큐브"와 바이패스 큐브 교체 빛 (그림 4B 와 4E) 모든 채널을 통해 갈 수 있는.
    2. DIC (즉, 배리어 필터 휠에 방출 필터)에서 카메라를 켭니다 하 고 3 개의 완전히 분리 된 채널 화면에 나타날 때까지 방출 스플리터의 조리개를 조정 합니다.
      참고: 모든 채널을 시각화 하는 점등 방 빛와이 단계를 수행 합니다.
    3. 수직/수평 조정 제어 손잡이 방출 분배기 설정와 약 3 채널 (그림 4E 및 4F)를 맞춥니다.
    4. 카메라를 끄고 트리플 큐브 (그림 4C , 4E) 교정 큐브를 바꿉니다.
    5. 샘플에 X 렌즈와 초점 100 위에 100 nm 멀티 채널 구슬과 샘플을 놓습니다.
    6. 카메라 및 488 nm 레이저, 밝은 구슬 중에 확대 하 고 정밀 하 게 조정 제어 손잡이 다시 (그림 4E 및 4 G)를 설정 하 여 3 개의 채널을 정렬.
      참고: 100 nm 멀티 채널 구슬 3 채널 정렬 있도록 488 nm 여기에 빛의 다른 파장을 방출 한다.
  3. 카메라와 레이저, 포커스를 설정 하 고 합리적인 현장 밀도와 좋은 위치를 찾을. 허용 신호-잡음 및 photobleaching 수준을 달성 하기 위해 레이저 전원 및 노출 시간을 조정 합니다. 현미경 이미징 소프트웨어를 사용 하 여 시간 경과 이미지를 데리고.

5. SR 이미징

참고:이 단일 분자 검출 기반 SR 현미경 검사 법입니다.

  1. 명함 이미지를 설정 하려면, 3 차원 렌즈를 삽입 하 고 매기 렌즈를 제거 합니다. 적절 한 레이저 채널 (예를 들어, 5-60 ms)에서 카메라의 노출 시간을 설정 합니다. 확인 하 고 수동으로 TIRF 각도 되도록 최적의 여기 레이저 부수적 각도 설정 합니다.
  2. SR 버퍼16이미징에 샘플을 놓습니다. 버퍼 이미징 하기 전에 적어도 10 분 동안 equilibrate를 허용 한다.
    참고: SR 이미징 버퍼 약 1 시간 후에 만료 됩니다, 그리고 그래서 새로운 SR 따라 버퍼 이미징.
  3. SR 영상 전에 DIC 이미지를 가져가 라. SR, 난시 효과 최적화를 위한 적절 한 객관적인 높이 찾기 위해 DIC 이미징 셀의 중간 비행기를 찾을 수를 사용 합니다. 높이는 셀 "어두운" 이미지를 "빛"에서 전환 하 고 투명 하 게 표시 하 여 비행기를 식별 (그림 5A, 5B, 5c). 원하는 초점 비행기 결정 되 면 z 드리프트 보정 시스템 (그림 1A)를 갖습니다.
  4. 명함 이미지를 수행 합니다. ' 깜박이-에 ' 관광 명소의 적당 한 밀도 유지 하기 위해 405 nm 레이저 전원을 변경 합니다.
    참고: 405 nm 레이저를 수동으로 변경할 수 있지만, 그것은 더 편리 "점멸-에" 관광 명소의 밀도 유지 하기 위해 프로그램된 데이터 수집 코드 실행. 여기에 어떻게 그것 자동으로 실시의 예가입니다. 소스 코드는 요청 (그림 6).
    1. 0 W/c m2 바이올렛 레이저 파워와 이미지 수집을 시작 합니다.
    2. 특정 기간에 깜박임에 관광 명소의 수를 계산.
    3. 깜박임에 반점의 수는 사용자 정의 "카운트 임계값" 보기의 필드 위에 유지 되도록 바이올렛 레이저 파워를 조절. 깜박임에 반점의 수 카운트 임계값 미만으로 떨어지면 바이올렛 레이저 파워를 증가.
    4. 깜박임에 반점의 수 최대 바이올렛 레이저 파워를 사용 하 여 카운트 임계값 미만으로 떨어지면 인수를 종료 합니다.
      참고: 샘플 밝기에 따라 다르게 설정 하지만 130 W/c m2보다 작은 최대가 될 수 있습니다. SR 이미징의 실제 목표에 따라이 자동 수집 코드 수동으로 원하는 언제 든 지 종료 될 수 있습니다.
  5. 인수를 시작 후 곧 점멸 동작과 PSFs의 관광 명소를 확인 합니다.
    참고: 깜박이 동작 하지 않으면 이상적인, 여기 레이저 부수적 각도 변경 하거나 대체 이미징 버퍼. "수직", "수평"와 "다이아몬드" 모양의 PSF, 대표 fluorophores 아래에서 위에, 초점 비행기 내에서 각각 (그림 5D)의 샘플링을 기대 합니다. 대부분 관광 명소는 수직 또는 수평 PSFs를 보여주면 다음 초점면 꺼져 세포의 센터에서 그래서 실험을 종료 하 고 초점 비행기를 다시 조정. 석유를 대체 하거나 샘플의 다른 이미지 영역을 변경 하는 일을 해야 할 수도 있습니다 그래서 침수 기름 또는 다른 로컬 요소에서 공기 방울이 존재 PSFs의 품질, 달라질 수 있습니다.
  6. 데이터 분석에 대 한 각 영상 프레임에 각 명소의 중심을 감지 하 여 x 및 y 너비14에서 각 명소의 z 값을 추출 (NIH ImageJ 플러그인)에서 오픈 소스 또는 상업적으로 사용할 수 있는 코드를 사용 합니다.
    참고:이 보고서에서 원래 초기 단일 분자 검출 기반 SR8 중에서 개발한 소스 코드 3 차원 탐지16 에 대 한 수정 그리고 사용 되었다.
  7. 2 색 이미지의 경우 더 이상 여기 파장, 단파장 여기 한 다음 fluorophore 이미지. 마찬가지로 단계 5.4, 하지만 다른 이미징 레이저를 설명 하는 것 자동된 수집 코드를 실행 합니다.
    참고: 다른 fluorophores (예를 들어, 붉은 염료와 노란색-녹색 염료)와 이미지 사이 색수차 수정 한다. 여기 스텝이 있다.
    1. 클러스터 형성을 피하고 유리 coverslip에 여러 100 nm 멀티 채널 구슬 무력화
    2. 다른 여기 채널에 그들의 이미지를 가져가 라.
    3. 소프트웨어 (5.6 단계)에 의해 그들의 (X, Y, Z) 좌표 추출 물.
    4. Δ X나 플롯 X =1i -2i 와 δ Yi X = Y1i -Y2i (내가 다른 구슬, 이며 1와 2는 다른 색상 채널) 별도로 적절 한 기능을 가진 그들을 맞는. 함수를 저장 합니다.
      참고: 선형 함수는 대부분의 경우에서 충분 합니다. 이 함수를 확인 하는이 측정은 화상의 각 시간 반복 될 필요가 없습니다.
    5. 관심의 샘플의 실제 2-컬러 명함 이미징, (X, Y) 올바른 색수차 기능 적용 됩니다. Z-방향 색수차에 대 한 ΔZ를 취득 하 여 실시 = Z1 -Z2 에 멀티 채널 구슬 또는 알려진된 기준 멀티 채널 샘플의 샘플 함께 시드.
      참고: (X, Y)와 달리 색수차, z-방향 색수차 채널 전환 시 불완전 한 z-방향 초점 유지 보수로 인해 주로 각 실험에서 잘 재현 되지 않습니다. 따라서, 각 시간 보정을 수행 하는 것이 좋습니다. ΔZ = Z1 -Z2 는 주로 독립의 (X, Y), 그래서 그냥 몇 가지 구슬 또는 참조 샘플 각 샘플 지역 당 충분 한 것. 3 차원 시각화 소프트웨어에 생성 된 최종 2 컬러 명함 이미지를 플롯 하 고 ΔZ를 수동으로 확인 합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

이 현미경에는 유연 하 고 다른 이미징 방법 전환 재현할 수 있습니다. 여기 우리가 각 영상 모듈와 수집 된 샘플 이미지를 보여줍니다.

그림 5D 는 SR 중 깜박이에 분자의 PSF를 보여 줍니다. 같은 이미지의 수천은 최종 명함 이미지 (그림 5E)를 생성 하 재건. 그림 5E 그림 7A에피 형광 이미지와 같이 같은 세균성 규제 RNAs를 보여줍니다. 그림 7 U2OS 포유류 세포에서 대장균 세포에 작은 규제 RNA는 mRNA의 대표적인 피 형광 이미지를 보여준다. 두 RNAs

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

이 하이브리드 현미경 시스템 여러 현미경을 구입할 필요가 없습니다. 광학 테이블, 테이블 설치 노동, 소프트웨어 및 워크스테이션을 포함 한 모든 부분에 대 한 비용 총 약 230000 달러 이다. 사용자 정의 가공 부품, 매기 렌즈 등 3 차원 렌즈 비용 약 $700 (비용은 다른 기관에서 실제 비용에 따라 달라 집니다). 전형적인 상용 통합 시스템 위한 단일 분자 검출 기반 SR 현미경 비용 이상의 $300000 ~ 400000 및 하지 쉽게 smFRET 측정에 사용할 수 있는 또는 보기의 적절 한 필드에 대 한 피 이미징 하얀 빛 없이 소스입니다. 따라서, 여기에 제시 된 접근 이미징 기능 여러 현미경 훨씬 저렴 한 비용에 해당를 얻을 수 있습니다.

이 변조 된 현미경 시스템 서로 다른 제조 업체에서 현미경 시체를 기반으로 수 있습니다. 3 차원 렌즈 방출 스플리터, 신체 내에서 현미경, 또는 필터 휠 및 객관적인 nosepiece 사이의 사용 가능한 공간에 안으로 포함 하는...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

J.F. 인정 Searle 학자 프로그램 및 NIH 감독의 새로운 혁신 상을에서 지원 합니다. 저자 폴 Selvin 연구소 (일리노이 대학, 어바나-샴페인) 3 차원 렌즈 위치에서 유용한 제안을 인정 합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Nikon Ti-E 현미경 스탠드NikonTi-E
대물 렌즈Nikon100X NA 1.49 CFI HP TIRF
현미경 이미징 소프트웨어NikonNIS-Elements Advanced Research/HCHC에는 SR 이미징에 사용되는 프로그래밍된 수집 모듈인 "JOBS" 모듈이 포함되어 있습니다.
조명 암NikonTi-TIRF-EM 전동 조명기 Unit M이 암에는 확대 렌즈용 슬롯이 있습니다.
블록NikonTi-A이것은 필터 터렛에 설치됩니다.
Z-드리프트 보정 시스템NikonPFS이 시스템은 대물 노즈피스의 스텝 모터, IR LED 및 검출기로 구성됩니다.
광학 테이블 탑TMC783-655-02R
광학 테이블 베이스TMC14-426-35
647 nm 레이저Cobolt90346 (0647-06-01-0120-100)변조 레이저 다이오드 647nm 120mW 포함 레이저 헤드, CDRH 컨트롤 박스, USB 케이블 및 PSU(전원 공급 장치)
561 nm 레이저코히런트1280721OBIS 561nm LS 150mW 레이저 시스템
488 nm 레이저코 볼트90308 (0488-06-01-0060-100)변조 레이저 다이오드 488nm 60mW 포함 레이저 헤드, CDRH 컨트롤 박스, USB 케이블 및 PSU (전원 공급 장치)
405 nm 레이저CrystalaserDL405-025-O405 (+/- 5) nm, 25mW, 원형 , M2 < 1.3, 저잡음, CW, TTL 최대 20MHz. TTL 및 용 BNC 커넥터 2 개 아날로그 조정
방열판Cobolt11658 (HS-03)두 장치, 팬이없는 방열판 HS-03, 647nm 및 488nm 레이저 용 방열판
Coherent1193289Obis 방열판 팬, 165 x 50 x 50 mm 561nm 레이저
CAB-USB-miniUSBCobolt109082 개, 647 nm 및 488 nm 레이저 용 통신 케이블
높이 조정 용 알루미늄McMaster-Carr9146T35다목적 6061 알루미늄, 직사각형 바, 4MM X 40MM, 높이 조정을 위한 561nm 레이저 알루미늄 올리기 위한 1' 길이
McMaster-Carr8975K248다목적 6061 알루미늄, 1-1/4" 두께 X 3" 너비 X 1' 405 nm 레이저
BNC 케이블L-comCC58C-6RG58C 동축 케이블, BNC 남성 / 남성, 6.0 ft
BNC 어댑터L-comBA1087동축 어댑터, BNC 벌크헤드, 접지
SMA-BNC 어댑터HODSMA-870Cobolt MLD 레이저에는 SMA 인터페이스가 있으므로 이 어댑터는 BNC 연결에 사용됩니다.
SMB-BNC 어댑터Fairview MicrowaveFMC1638316-12SMB 플러그-BNC 암 벌크헤드 케이블 RG316 Coherent Obis 레이저용 12인치
동축 데이터 수집 카드National InstrumentsPCI-672313비트, 32채널, 800kS/s 아날로그 출력 레이저, DIC LED 등을 제어하기 위한 디바이스
배리어 필터 휠 컨트롤러셔터 계측기Lambda 10-B광학 필터 체인저
방출 스플리터CairnOptoSplit III
이색성 빔스플리터ChromaT640LPXR-UF2OptoSplit III에서 적색 방출과 녹색 방출을 분리하는 이색
빔스플리터ChromaT565LPXR-UF2에서 녹색 및 적색 방출과 청색 방출을 분리하는 이색성 빔스플리터
2개, OptoSplit III의 적색 방출(예: Alexa Fluor 647) 및 배리어 필터 휠
방출 필터ChromaET595/50M2개, OptoSplit III의 황색/녹색 방출(예: Cy3B)용 방출 필터 및 배리어 필터
방출 필터ChromaET525/50M2개의 장치, OptoSplit III의 청색 방출(예: Alexa Fluor 488/GFP)용 방출 필터와 배리어 필터 휠
방출 필터SemrockFF02-447/60-25배리어 필터 휠에 설치된 보라색 방출용 방출 필터(예: DAPI/Alexa Fluor 405), 배리어 필터 휠
Dichroic beamsplitterChromazt405/488/561/647/752rpc-UF3에 설치현미경 본체 내부의 647, 561, 488 및 405nm 레이저 여기를 위한 다대역 이색성 빔 스플리터
DAPI 현미경본체에 설치된Chroma49000
Nikon 레이저/TIRF filtercubeChroma91032
590 장역 통과 필터647nm 레이저와 561nm 레이저
이미결합된 647nm 및 561nm 레이저를 488nm 레이저
470 장역 통과 필터이미 결합된 647nm, 561nm 및 488nm 레이저를 405nm 레이저와 결합ChromaT470LPXR-UF1
레이저 클린업 필터 (647)647nm 레이저의 다른 파장을 청소하기 위한Chromazet640/20x
레이저 클린업 필터 (488)SemrockLL01-488-25488nm 레이저에서 다른 파장을 청소하기 위해
LED 광원ExcelitasX-Cite120LEDDAPI 이미징에만 사용
미러 마운트뉴 포트SU100-F3K
광학 포스트뉴 포토PS-2
클램핑 포크뉴 포트PS-F
파워 미터뉴 포트PMKIT레이저 파워 측정용
Dichroic beamcombiner 마운트Edmund Optics58-872C-Mount Kinematic Mount, 레이저 여기 어셈블리에 dichroic beamcombiner를 고정하기 위한
리테이닝 링ThorlabsCMRRdichroic beamcombiner 마운트에 사용됨
파이버 어댑터 플레이트ThorlabsSM1FCFC/PC 파이버 어댑터 플레이트(외부 SM1 포함) (1.035"-40) 나사산
Z축 변환 마운트ThorlabsSM1ZZ-축 번역 마운트, 30 mm 케이지 호환
무채색 더블렛 렌즈ThorlabsAC050-008-A-MLØ 5 mm, 장착된 무채색 이중선, AR 코팅: 400 - 700 nm
케이지 플레이트ThorlabsCP1TM0930 mm 케이지 플레이트, M9 x 0.5 내부 나사, 8-32 탭
케이지 어셈블리 로드ThorlabsER4케이지 어셈블리 로드, 4" 길이, Ø 6 mm
케이지 장착 브래킷ThorlabsCP02B30 mm 케이지 장착 브래킷
단일 모드 광섬유ThorlabsP5-405BPM-FC-2패치 케이블, PM, FC/PC to FC/APC, 405 nm, Panda, 2 m
다중 모드 광섬유ThorlabsM42L01Ø 50 &마이크로; m, 0.22 NA, FC/PC-FC/PC 파이버 패치 케이블, 1 m
무채색 이중색 렌즈 (매그 렌즈)ThorlabsACN127-025-AACN127-025-A - f=-25.0 mm, Ø 1/2" 무채색 이중색, ARC: 400-700 nm, "매그 렌즈"의 오목한 렌즈
무채색 이중색 렌즈 (매그 렌즈)ThorlabsAC127-050-Af=50.0 mm, Ø 1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, "mag lens"의 볼록한 렌즈
ThorlabsSM05PRRSM05 플라스틱 보유 링 Ø 1/2" 렌즈 튜브 및 마운트, "매그 렌즈"용
나일론 팁 나사ThorlabsSS3MN6M3 x 0.5 나일론 팁 세트 나사, 6mm 길이, "3D 렌즈" 고정용
3D 렌즈CVI 레이저 광학RCX-25.4-50.8-5000.0-C-415-700f=10m, 직사각형 원통형 렌즈
EMCCD 카메라AndoriXon Ultra 888
100nm 다채널 비드ThermoT7279, TetraSpeck 미세구
적색 염료ThermoAlexa Fluor 647
황록색 염료GE HealthcareCy3
녹색 염료GE HealthcareCy3B
청색 염료ThermoAlexa Fluor 488
분석 올리기를 위한 길이 된 성 OptoSplit III 방출 필터 Chroma ET700/75M 휠 필터 세트 525 장역 통과 필터 Chroma 결합을 위한 Chroma T590LPXR-UF1와 결합하는 T525LPXR-UF1 하는

참고문헌

  1. Lipson, S. G., Lipson, H., Tannhauser, D. S. Optical physics. , Cambridge University Press. Cambridge, UK; New York, NY. (1995).
  2. Török, P., Wilson, T. Rigorous theory for axial resolution in confocal microscopes. Optics Communications. 137 (1-3), 127-135 (1997).
  3. Klar, T. A., Hell, S. W. Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy. Optics Letters. 24 (14), 954-956 (1999).
  4. Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780-782 (1994).
  5. Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
  6. Gustafsson, M. G. L., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).
  7. Schermelleh, L., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
  8. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  9. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  10. Balzarotti, F., et al. Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes. Science. 355 (6325), 606-612 (2017).
  11. Vaughan, J. C., Jia, S., Zhuang, X. Ultrabright photoactivatable fluorophores created by reductive caging. Nature Methods. 9 (12), 1181-1184 (2012).
  12. Ha, T., et al. Probing the interaction between two single molecules: fluorescence resonance energy transfer between a single donor and a single acceptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6264-6268 (1996).
  13. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
  14. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
  15. Hua, B., et al. An improved surface passivation method for single-molecule studies. Nature Methods. 11 (12), 1233-1236 (2014).
  16. Fei, J., et al. RNA biochemistry. Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA. Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).
  17. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
  18. Stracy, M., Kapanidis, A. N. Single-molecule and super-resolution imaging of transcription in living bacteria. Methods. 120, 103-114 (2017).
  19. Wang, S., Moffitt, J. R., Dempsey, G. T., Xie, X. S., Zhuang, X. Characterization and development of photoactivatable fluorescent proteins for single-molecule-based superresolution imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (23), 8452-8457 (2014).
  20. Sekar, R. B., Periasamy, A. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations. The Journal of Cell Biology. 160 (5), 629-633 (2003).
  21. Shi, X., et al. Super-resolution microscopy reveals that disruption of ciliary transition-zone architecture causes Joubert syndrome. Nature Cell Biology. 19 (10), 1178-1188 (2017).
  22. Youn, Y., Ishitsuka, Y., Jin, C., Selvin, P. R. Thermal nanoimprint lithography for drift correction in super-resolution fluorescence microscopy. Optics Express. 26 (2), 1670-1680 (2018).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

태그

형광 현미경법초고해상도 이미징단분자 FRET다색 검출에피형광 이미징광학 정렬레이저 제어방출 필터 휠3D 렌즈 삽입데이터 수집 카드
실시 한 형광 현미경으로 여러 영상 모드
문의하기
도서관에 추천하기

개인정보 처리방침

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.