이 프로토콜은 쥐의 척수에 유리 창을 이식하여 분사 내 현미경 검사법에 의한 시각화를 용이하게 합니다.
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이 논문에서
요약
초록
이 프로토콜은 마우스 척수의 생체 내 이미징을 위한 척수 하구 절제술 및 유리 창 이식방법을 기술한다. 통합 된 디지털 기화기는 이소플루란의 낮은 유량에서 마취의 안정적인 평면을 달성하기 위해 활용된다. 단일 척추척추가 제거되고 시판되는 커버 글래스가 얇은 아가로즈 침대에 겹쳐져 있습니다. 3D 인쇄 플라스틱 백플레이트는 조직 접착제 및 치과 시멘트를 사용하여 인접한 척추 척추에 부착됩니다. 안정화 플랫폼은 호흡과 심장 박동에서 모션 아티팩트를 줄이기 위해 사용됩니다. 이 신속하고 클램프가없는 방법은 급성 다중 광자 형광 현미경 검사법에 적합합니다. 대표적인 데이터는 eGFP:Claudin-5 -단단한 접합 단백질을 발현하는 형질전환 마우스에서 척수 혈관의 2광자 현미경 검사법에 이 기술의 적용을 위해 포함된다.
서론
형광성 단백질을 발현하는 형질전환 동물 모델은 분과내 현미경 검사법과 결합될 때 생물학 및 병리생리학을 해결하기 위한 강력한 플랫폼을 제공합니다. 이러한 기술을 척수에 적용하려면 척수를 이미징을 위해 특수 프로토콜이 필요합니다. 그러한 전략 중 하나는 라민 절제술과 척수 창 이식을 수행하는 것입니다. 현미경 검사법을 위한 이상적인 laminectomy 프로토콜의 주요 특징은 네이티브 조직 구조 및 기능의 보존, 화상 진찰 필드의 안정성, 빠른 처리 시간 및 결과의 재현성을 포함합니다. 특별한 도전은 호흡과 심장 박동에 의해 유도된 운동에 대하여 화상 진찰 필드를 안정시키는 것입니다. 여러 ex vivo 및 생체 내 전략은 이러한 목표를 달성하기 위해보고되었다1,2,3,4,5. 대부분의 생체 내 방법은 척추2,4의 측면을 클램핑하는 것을 포함하고 종종 수술 중 안정성을 위해 경질 금속 장치3,4를 이식하고 다운스트림 이미징 애플리케이션. 척추를 고정하면 잠재적으로 혈류를 손상시키고 혈액 -뇌 장벽 (BBB) 단백질 리모델링을 유도 할 수 있습니다.
이 방법의 목적은 프로토콜의 침략을 최소화하고 결과를 개선하면서 살아있는 마우스에서 광학 이미징에 사용할 수있는 그대로 척수를 만드는 것입니다. 우리는 여전히 강력한 기계적 안정성을 달성 최소 침습 타원형 플라스틱 3D 인쇄 백 플레이트와 결합 한 단일 laminectomy 및 커버 유리 이식 절차를 설명합니다. 백플레이트는 치과 시멘트가있는 전방 및 후방 척추 척추에 직접 부착됩니다. 백플레이트에는 금속 암을 통해 현미경 스테이지에 단단히 부착되는 나사 구멍이 있는 측면 확장 암이 장착되어 있습니다. 이것은 효과적으로 현미경 단계에 온전한 전방 및 후방 척추를 고정하고, 그렇지 않으면 호흡과 심장 박동에 의해 소개될 운동 아티팩트에 기계적 저항을 제공합니다. 이 방법은 흉부 수준 12에서 단일 척추의 하구 절제술에 최적화되어 생체 내 이미징 중 안정성을 위한 대체 전략에 사용되는 클램프를 생략합니다. 절차는 마우스 당 대략 30 분 취하는, 급속합니다.
이 프로토콜은 BBB의 질병 기전을 연구하는데 사용될 수 있다. BBB는 중추 신경계 (CNS)에 대한 매우 선택적 환경을 제공하는 내피 세포, 혈관 평활근, pericytes 및 성상 세포 발 과정으로 구성된 동적 미세 혈관 시스템입니다. 대표적인 데이터는 향상된 녹색 형광 단백질(eGFP):클라우딘-5, BBB 단단한 접합 단백질을 발현하도록 설계된 형질전환 마우스에서 이 프로토콜의 적용을 묘사한다. 제공된 백플레이트 인쇄 파일은 대체 응용 프로그램에 맞게 사용자 지정할 수도 있습니다.
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프로토콜
모든 실험은 일리노이 대학, 시카고 기관 동물 관리 및 사용 위원회 프로토콜을 따릅니다. 이것은 터미널 절차입니다.
1. 시약 준비
- 인공 대뇌 척수액 (aCSF)을 준비하여 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM 포도당, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2·6H2O, ddH2O. 멸균 필터에서 2mM CaCl2/2H 2O를 포함하고 개별 사용 별표에서 동결합니다. 사용 전에 수조에서 aCSF를 39°C로 데우면 됩니다.
- 따뜻한 저융점 아가로즈 (2%) 65°C로 설정된 수조에 완전히 용해될 때까지 aCSF에 라미네크 절제술 동안, 용융된 아가로즈 알리쿼트(agarose aliquot)를 수조에서 39°C로 냉각하여, 5.2단계의 생리적 온도에 가깝게 준비할 수 있도록 한다.
참고: 아가로즈 용액은 일회용 알리쿼트에서 -20°C에서 저장할 수 있습니다. - 살균 50 mg /mL 카프로펜을 정균물에 준비하십시오. 4 °C에서 보관하십시오.
- 70% 에탄올, 3개의 ddH2O세척으로 커버 안경을 청소하고 먼지가 없는 용기에 건조보관하십시오.
2. 백 플레이트 3D 프린팅
- 3D CAD 소프트웨어를 사용하여 그림 1에표시된 치수에 대한 모델을 작성하는 데 사용됩니다. 내부는 프린터와 관련하여 아래쪽 표면에서 가장 넓은 타원이며 반대면에 루멘을 형성하는 작은 타원으로 로프트 컷으로 절단됩니다. 나사를 수용할 구멍이 있는 두 개의 투사 암이 측면으로 확장되어 포크를 들고 있는 백플레이트에 부착됩니다. 이 3D 구조에서 삼각3D 메시 파일( STL 파일)을 참조하십시오.
참고: 그림 1B\u2012D 및 보조 파일 1 및 2를참조하십시오. - 삼각형 3D 메시 파일을 3D 프린터에 업로드합니다.
- 0.4mm 핫 엔드 노즐과 0.2mm 레이어 높이를 사용하여 백플레이트를 인쇄합니다. 205°C의 노즐 온도, 45°C의 취침 온도 및 45mm/s의 인쇄 속도를 선택합니다.
- 구조적 무결성을 위해 결과 3D 인쇄 백플레이트를 시각적으로 평가합니다(그림1E); 총 구조적 고장(루멘 부재, 붕괴된 벽)은 인쇄 결함을나타냅니다(그림 1F).
3. 외과 준비
- 가열 패드를 예열합니다.
- 화학 연기 후드에서 작업하는 동안 전달 주사기에 이소플루란을 로드합니다. 배달 주사기를 이소플루란 장치에 부착합니다.
- 8\u201212주된 마우스를 선택합니다. 동물의 무게를 측정합니다. 유도 챔버에서 2 % 이소플루란을 사용하여 마취를 유도하십시오. 카프로펜을 5 mg/kg에 피하주사하십시오.
- 코-콘을 배치하고 마취의 수술 평면의 유지 보수를 위해 150 mL / min의 유량으로 2 %에서 이소플루란을 전달합니다(그림 2A\u2012E). 가열 패드를 일회용 흡수 패드로 감싸서 청소가 용이합니다.
- 수술 실의 가열 패드에 동물을 배치하고 코 콘을 설치합니다. 석유 젤리로 온도계를 윤활하고 직장에 5mm를 삽입하십시오. 안정성을 위해 온도계 프로브를 꼬리에 테이프로 바입니다. 마우스의 눈에 안과 연고를 바하십시오.
- 수분을 유지하려면 실험이 종료될 때까지 30분마다 피하 주사를 통해 수유링링거 용액 200 μL을 적용합니다.
- 도르섬에 70% 에탄올을 뿌리고, 모피를 클리퍼로 제거하고, 포비동 요오드로 부위를 청소하세요.
4. 라미네절제술
- 이어바 사이에 동물을 위치; 이들은 코 콘에 대하여 마우스의 헤드 위치를 유지합니다.
- 동물은 깊은 디지털 핀치 반사와 꾸준한 호흡 패턴의 부족에 의해 평가로 마취되어 있는지 확인합니다.
- #11 블레이드를 사용하여 하부 흉부 / 상부 요추 부위의 중간선에서 1.5 cm 로스트랄 코말 절개를 합니다(그림 2). 무딘 이빨 집게 및 / 또는 장갑을 낀 손가락으로 피부를 파악하여 피부를 분리하십시오. 포셉을 사용하여 피부 아래에 남아있는 투명한 결합 조직을 분리하고 껍질을 벗깁니다. 피상적 인 근육은 이제 노출되어야합니다. 거품 수술 창으로 이것을 대체하십시오.
- 폼 수술 용 창 (또는 curette)을 사용하여 대상 척추의 나머지 깊은 근육을 치웁니다 (흉부 12). 백플레이트에 대한 시트를 만들려면, 또한 흉부(11)의 후방 측면및 흉부(13)의 전방 양상으로부터 근육을 제거한다. 외과 용 창으로 부드러운 압력을 가하여 출혈을 제어하거나 소작 총으로 최소한의 맥박을 사용합니다. 집게를 사용하여 힘줄에서 남은 근육을 계속 제거합니다.
- 근육이 제거되면 집게로 절단하여 힘줄을 조심스럽게 분리하십시오. 이 단계가 완료되면 코드를 시각화하고 조작할 수 있는 충분한 공간이 있어야 합니다. 척추 간 공간의 경막 문제, 반투명 층상 뼈, 뼈 아래 중앙 표면 혈관 및 전방 방사 동맥이 명확하게 보이는지 확인하십시오.
- 따뜻한 aCSF로 이 지역을 적십니다. 마이크로드릴을 사용하여 척수의 긴 축과 평행한 직선 스트로크를 사용하여 층상 뼈를 반복적으로 얇게합니다(그림 2, 그림 3). 원하는 경우, 글라이딩 스테이지를 활용하여 향상된 인체공학적 편안함을 위해 수술 플랫폼을 회전시킵니다(예를 들어, 오른손잡이 연산자는 드릴링 단계에 대해 수술 플랫폼을 시계 반대 방향으로 회전시킬 수 있음).
참고: 사용되는 글라이딩 스테이지는 고정 베이스 플레이트와 관련하여 ±15mm 슬라이드되는 상부 알루미늄 플레이트로 구성됩니다. - 포셉으로 표면가소 과정을 부드럽게 잡고 척추를 들어 올립니다. 뼈가 쉽게 들어올려야 합니다. 저항이있는 경우, 드릴로 뼈 숱이 반복하고 필요한 경우 홍채 가위를 사용, 조직을 손상시키지 않도록 위쪽으로 가위 팁을 목표로주의.
참고: 내구성을 그대로 유지하려면 뼈를 잡아 당기지 않는 것이 필수적입니다. - #4 집게를 사용하여 뼈 조각을 치웁습니다. 외과 용 창을 사용하여 출혈을 제어하기 위해 부드러운 꾸준한 압력을 가하십시오. 따뜻한 aCSF로 티슈를 헹굽니다. 조직이 마르지 않도록 하십시오.
5. 커버 유리 이식
- 노출된 코드에 3mm 보로실리케이트 커버 글래스를 부드럽게 바릅니다.
- 아가로즈가 39°C로 냉각되었는지 확인합니다. 작은 주걱을 사용하여 커버 글래스 가장자리에 따뜻한 2% 아가로즈/aCSF를 바르고 모세관작용이 표면 아래에 그릴 수 있도록 합니다.
참고: 39°C 이하의 온도에서는 아가로오스가 젤화되기 시작할 수 있습니다. 이 경우 수조 나 전자 레인지를 사용하여 다시 따뜻하게하십시오. 일부 작업자는 먼저 아가로즈 한 방울을 적용하고 상단에 커버 유리를 배치하는 것을 선호합니다. - 흉부 수준 11 척추 및 흉부 수준 13 척추에서 그대로 인접한 척추의 노출 된 뼈 관절 과정에 조직 접착제를 적용합니다. 인접한 힘줄 및 횡방향 과정을 통해 라민 절제술 부위 주변의 고리에 추가 조직 접착제를 적용하십시오.
참고: 후속 단계에서 치과 시멘트를 적절히 준수하려면 조직 접착제가 필요합니다. 관절 과정은 백플레이트가 안정적으로 휴식을 취할 수 있는 자연스러운 시트를 형성합니다(그림3). 관절 공정에 대한 접착력은 가장 강한 부착 지점을 형성합니다. - 치과 시멘트를 도자기 혼합 트레이에 가속제와 혼합합니다. 작은 주걱을 사용하여 치과 시멘트를 조직 접착제 층으로 옮김을 옮김을 활용합니다. 치과 용 시멘트를 사용하여 창 을 중심으로 백플레이트를 수술 장에 부착하십시오. 치과 용 시멘트가 치료될 수 있도록 10분 간 기다립니다.
참고: 전방 및 후방 관절 공정에 대한 백플레이트의 확고한 접착력은 임플란트의 근본적인 구조적 안정성을 제공합니다. - 백 플레이트의 내부 베이스와 백 플레이트의 밑면을 채우기 위해 추가 치과 시멘트를 사용합니다: 티슈 인터페이스.
참고 : 치과 시멘트의 추가 응용 프로그램은 부착을 개선하고 백 플레이트의 바닥 밖으로 현미경 객관적인 침지 유체 (식염수)의 누출의 위험을 줄일 수 있습니다. - 갈아진 백플레이트 홀더를 창 위에 있는 적절한 위치로 전진시다. 나사로 백플레이트를 백플레이트 홀더에 고정합니다.
참고: 이 프로토콜은 사용자 지정 가공백플레이트 홀더(그림 2G\u2012H)를활용했습니다. - 백플레이트에 식염수를 적용하여 누출 을 테스트합니다. 액체가 누출되면 해당 영역을 건조시키고 더 많은 치과 시멘트를 적용하십시오.
6. 이미징 준비
- 수술 플랫폼에 있는 동물을 광학 테이블로 옮김을 옮김으로 옮김.
참고 : 우리의 수술 플랫폼, 백 플레이트 홀더 및 이소플루란 코 콘 홀더는 연속 이소플루란 마취를 적용하면서 외과 및 2 광자 이미징 스테이션 간에 하나의 단위로 운반 할 수 있습니다(그림 2D,H). 유사한 단위는 상업 소스에서 얻을 수있는 포크, 빔 및 지지 기둥 기둥 기둥을 들고 조립 할 수 있습니다(예 :. 소랩). intravital 현미경 검사법의 경우, 수술 플랫폼의 높이를 수용하기 위해 현미경 목표와 광학 테이블 사이에 적어도 11 인치의 여유가 있어야합니다. - 스테인리스 스틸 마운팅 포스트와 카운터보어 클램핑 포크를 사용하여 수술 플랫폼을 광학 테이블에 부착합니다.
- 백플레이트의 웰에 신선한 식염수를 바넣습니다. 우물에 수분 침수 렌즈를 낮춥습니다.
- 투과또는 에피플루전광등을 사용하여 관심 영역과 초점 영역을 식별합니다. 레이저 스캐닝 모드로 전환하고 조직에 존재하는 형광단에 대한 적절한 2 광자 레이저 여기 파장, 이색 및 밴드패스 필터에 따라 생체 내 이미징을수행한다 6.
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결과
이식된 유리 창과 활력 내 2광자 현미경 검사는 CNS 단백질의 동적 변화를 평가하는 데 유용한 도구를 제공합니다. BBB의 기능적 무결성은 타이트한 접합 단백질의 발현, 세포외 국소화 및이직률7에의해 영향을 받습니다. 이전 연구는 단단한 접합 단백질이 정상 상태8에서신속하고 역동적 인 리모델링을 겪는다는 것을 입증했습니다. 현재 설명된 라민 절제술 및 유리 창 제제는 형광 타이트 접합 단백질을 낳는 형질전환 eGFP:클라우딘-5 마우스9에사용되어 실험적 자가면역에서 BBB 단단한 접합 리모델링을 평가하였다. 다발성 경화증의 뇌척수염 (EAE) 모델10. 대표적인 데이터에서, eGFP:Claudin-5의 이미징은 920 nm 여기, 40× 적외선 목표(0.8 NA) 및 녹색 형광 방출 필터를 가진 2광...
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토론
여기에 설명된 방법은 유리 창을 통해 마우스에서 척수의 안정적인 이미징을 허용합니다. 이 방법은 형광 BBB 단단한 접합 단백질을 발현하는 형질전환 eGFP:Claudin5+/- 마우스에서 BBB 리모델링을 평가하기 위하여 적용되었습니다, 그러나 척수에 있는 어떤 형광성 단백질 또는 세포의 연구 결과를 위해 동등하게 잘 적용될 수 있었습니다.
라민 절제술과 척수 안정화를위한 여러 방법이 개발되었습니다. 모든 프로토콜은 관심 있는 구조에 대한 시각적 접근을 위해 이미징 및 창 구현 중에 척수를 안정화시다룹니다. 제거된 척추의 수와 사용 가능한 프로토콜의 침략의 정도는 다양합니다(예를들어, 본 프로토콜에서와 같이 피상적 뼈의 표면에 붙어 있는 성분, 더 깊게 내장된 것 대). 다발로스와 아카소글로2는 척수를 안정시키기 위해 척추의 양쪽에 분리가능한 클램프와 마우스 꼬리 의 밑에 하나의 클램프를 사용하여 하구 ...
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
S.E. Lutz는 그랜트 KL2TR002002 및 일리노이 대학 시카고 의과 대학 창업 기금에 따라 국립 번역 과학, 국립 보건원, 국립 연구소의 지원을 받고 있습니다. 사이먼 알포드는 RO1 MH084874에 의해 지원됩니다. 이 콘텐츠는 전적으로 저자의 책임이며 반드시 NIH의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다. 저자는 TG eGFP에 대한 컬럼비아 대학 의료 센터의 신경학과에서 Dritan Agalliu 감사합니다: 클라우딘-5 마우스, 과학적 토론, 수술 프로토콜 및 이미징 응용 프로그램의 개발에 대한 통찰력. 저자는 캘리포니아 대학의 신경 생물학 및 행동학과의 Sunil P. Gandhi에게 감사하고, 어바인은 입체 적 장치 및 동물 온도 컨트롤러의 첫 번째 프로토 타입을 설계하고, 수술 프로토콜에 대한 논의, 2 광자 현미경 검사법에서 훈련. 저자는 또한 수술 입체 현미경을 사용자 정의에 도움을 스티브 피켄스 (W. Nuhsbaum, Inc.) 감사, 론 리핀스키 (고래 제조) 입체 부품을 가공.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 3D 프린터 | Raise3D | Pro2 | 백 플레이트 인쇄 PLA |
| 3D 인쇄 필라멘트 | 내륙 | PLA + -175-B | 블랙 플라스틱 3D 인쇄 재료 |
| 3D CAD 소프트웨어 | Dassault Systemes | Solidworks 3D | 형상 설계에 사용되는 |
| 3D 프린터 소프트웨어 | Raise3D | Ideamaker 소프트웨어 | 3D 프린터와 인터페이스하는 데 사용되는 |
| 3D 인쇄 된 타원형 백 플레이트 | 맞춤형 | 안정화 이미징 필드 | |
| 외과 해부 현미경 | Leica | M205 C | Leica FusionOptics, Planapo 0.63x M 시리즈 대물 및 글라이딩 스테이지 장착 |
| 현미경 카메라 | Leica | MC170 | HD 컬러 카메라 |
| 라이딩 스테이지 | Leica | 10446301 | 글라이딩 스테이지는 두 개의 금속판으로 구성됩니다. 베이스 플레이트가 고정되어 있습니다. 상부 플레이트는 그리스가 칠해진 인터페이스로 미끄러져 회전 및 선형 이동을 허용합니다. |
| 수술 스테이션 및 안정화 포크 | 고래 제조 맞춤형 | Laminectomy | |
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| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | aCSF |
| KCl | Fisher Scientific | 7447-40-7 | aCSF |
| 포도 | Fisher Scientific | 50-99-7 | aCSF |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | aCSF |
| MgCl2& 미드 도트; 6H2O | Fisher Scientific | 7791-18-6 | aCSF |
| CaCl2·용; 2H2O | Fisher Scientific | 10035-04-8 | |
| 카프로펜 | 리마딜 | QM01AE91 | 진통제균 |
| 정균수 | Henry Schein | 2587428 | 카프로펜 |
| 이소플루란 | Henry Schein | 11695-6776-2 | 마취 |
| 젖산 링거 용액 | Baxter | 0338-0117-04 | 수분 공급 마우스 |
| Agarose High EEO | Sigma | A9793 | 젤 포인트 34-37도 C |
| 안과 윤활 연고 | Akwa Tears | 68788-0697 | 각막 건조 방지 |
| MOM Two-Photon Microscope | Sutter |
참고문헌
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재인쇄 및 허가
