이 프로토콜은 쥐의 척수에 유리 창을 이식하여 분사 내 현미경 검사법에 의한 시각화를 용이하게 합니다.
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이 논문에서
요약
초록
이 프로토콜은 마우스 척수의 생체 내 이미징을 위한 척수 하구 절제술 및 유리 창 이식방법을 기술한다. 통합 된 디지털 기화기는 이소플루란의 낮은 유량에서 마취의 안정적인 평면을 달성하기 위해 활용된다. 단일 척추척추가 제거되고 시판되는 커버 글래스가 얇은 아가로즈 침대에 겹쳐져 있습니다. 3D 인쇄 플라스틱 백플레이트는 조직 접착제 및 치과 시멘트를 사용하여 인접한 척추 척추에 부착됩니다. 안정화 플랫폼은 호흡과 심장 박동에서 모션 아티팩트를 줄이기 위해 사용됩니다. 이 신속하고 클램프가없는 방법은 급성 다중 광자 형광 현미경 검사법에 적합합니다. 대표적인 데이터는 eGFP:Claudin-5 -단단한 접합 단백질을 발현하는 형질전환 마우스에서 척수 혈관의 2광자 현미경 검사법에 이 기술의 적용을 위해 포함된다.
서론
형광성 단백질을 발현하는 형질전환 동물 모델은 분과내 현미경 검사법과 결합될 때 생물학 및 병리생리학을 해결하기 위한 강력한 플랫폼을 제공합니다. 이러한 기술을 척수에 적용하려면 척수를 이미징을 위해 특수 프로토콜이 필요합니다. 그러한 전략 중 하나는 라민 절제술과 척수 창 이식을 수행하는 것입니다. 현미경 검사법을 위한 이상적인 laminectomy 프로토콜의 주요 특징은 네이티브 조직 구조 및 기능의 보존, 화상 진찰 필드의 안정성, 빠른 처리 시간 및 결과의 재현성을 포함합니다. 특별한 도전은 호흡과 심장 박동에 의해 유도된 운동에 대하여 화상 진찰 필드를 안정시키는 것입니다. 여러 ex vivo 및 생체 내 전략은 이러한 목표를 달성하기 위해보고되었다1,2,3,4,5. 대부분의 생체 내 방법은 척추2,4의 측면을 클램핑하는 것을 포함하고 종종 수....
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프로토콜
모든 실험은 일리노이 대학, 시카고 기관 동물 관리 및 사용 위원회 프로토콜을 따릅니다. 이것은 터미널 절차입니다.
1. 시약 준비
- 인공 대뇌 척수액 (aCSF)을 준비하여 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM 포도당, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2·6H2O, ddH2O. 멸균 필터에서 2mM CaCl2/2H 2O를 포함하고 개별 사용 별표에서 동결합니다. 사용 전에 수조에서 aCSF를 39°C로 데우면 됩니다.
- 따뜻한 저융점 아가로즈 (2%) 65°C로 설정된 수조에 완전히 용해될 때까지 aCSF에 라미네크 절제술 동안, 용융된 아가로즈 알리쿼트(agarose aliquot)를 수조에서 39°C로 냉각하여, 5.2단계의 생리적 온도에 가깝게 준비할 수 있도록 한다.
참고: 아가로즈 용액은 일회용 알리쿼트에서 -20°C에서 저장할 수 있습니다. - 살균 50 mg /mL 카프로펜을 정균물에 준비하십시오. 4 °C에서 보관하십시오.
- 70% 에탄올, 3개의 ddH2O세척으로 커버 안경을 청소하고 먼지가 없는 용기에 건조보관하십시오.....
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결과
이식된 유리 창과 활력 내 2광자 현미경 검사는 CNS 단백질의 동적 변화를 평가하는 데 유용한 도구를 제공합니다. BBB의 기능적 무결성은 타이트한 접합 단백질의 발현, 세포외 국소화 및이직률7에의해 영향을 받습니다. 이전 연구는 단단한 접합 단백질이 정상 상태8에서신속하고 역동적 인 리모델링을 겪는다는 것을 입증했습니다. 현재 설명된 라민 절제술 및 유리 창 제제는 형광 타이트 접합 단백질을 낳는 형질전환 eGFP:클라우딘-5 마우스9에사용되어 실험적 자가면역에서 BBB 단단한 접합 리모델링을 평가하였다. 다발성 경화증의 뇌척수염 (EAE) 모델10. 대표적인 데이터에서, eGFP:Claudin-5의 이미징은 920 nm 여기, 40× 적외선 목표(0.8 NA) 및 녹색 형광 방출 필터를 가진 2광.......
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토론
여기에 설명된 방법은 유리 창을 통해 마우스에서 척수의 안정적인 이미징을 허용합니다. 이 방법은 형광 BBB 단단한 접합 단백질을 발현하는 형질전환 eGFP:Claudin5+/- 마우스에서 BBB 리모델링을 평가하기 위하여 적용되었습니다, 그러나 척수에 있는 어떤 형광성 단백질 또는 세포의 연구 결과를 위해 동등하게 잘 적용될 수 있었습니다.
라민 절제술과 척수 안정화를위한 여러 방법이 개발되었습니다. 모든 프로토콜은 관심 있는 구조에 대한 시각적 접근을 위해 이미징 및 창 구현 중에 척수를 안정화시다룹니다. 제거된 척추의 수와 사용 가능한 프로토콜의 침략의 정도는 다양합니다(예를들어, 본 프로토콜에서와 같이 피상적 뼈의 표면에 붙어 있는 성분, 더 깊게 내장된 것 대). 다발로스와 아카소글로2는 척수를 안정시키기 위해 척추의 양쪽에 분리가능한 클램프와 마우스 꼬리 의 밑에 하나의 클램프를 사용하여 하구 .......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
S.E. Lutz는 그랜트 KL2TR002002 및 일리노이 대학 시카고 의과 대학 창업 기금에 따라 국립 번역 과학, 국립 보건원, 국립 연구소의 지원을 받고 있습니다. 사이먼 알포드는 RO1 MH084874에 의해 지원됩니다. 이 콘텐츠는 전적으로 저자의 책임이며 반드시 NIH의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다. 저자는 TG eGFP에 대한 컬럼비아 대학 의료 센터의 신경학과에서 Dritan Agalliu 감사합니다: 클라우딘-5 마우스, 과학적 토론, 수술 프로토콜 및 이미징 응용 프로그램의 개발에 대한 통찰력. 저자는 캘리포니아 대학의 신경 생물학 및 행동학과의 Sunil P. Gandhi에게 감사하고, 어바인은 입체 적 장치 및 동물 온도 컨트롤러의 첫 번째 프로토 타입을 설계하고, 수술 프로토콜에 대한 논의, 2 광자 현미경 검사법에서 훈련. 저자는 또한 수술 입체 현미경을 사용자 정의에 도움을 스티브 피켄스 (W. Nuhsbaum, Inc.) 감사, 론 리핀스키 (고래 제조) 입체 부품을 가공.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 3D 프린터 | Raise3D | Pro2 | 백 플레이트 인쇄 PLA |
| 3D 인쇄 필라멘트 | 내륙 | PLA + -175-B | 블랙 플라스틱 3D 인쇄 재료 |
| 3D CAD 소프트웨어 | Dassault Systemes | Solidworks 3D | 형상 설계에 사용되는 |
| 3D 프린터 소프트웨어 | Raise3D | Ideamaker 소프트웨어 | 3D 프린터와 인터페이스하는 데 사용되는 |
| 3D 인쇄 된 타원형 백 플레이트 | 맞춤형 | 안정화 이미징 필드 | |
| 외과 해부 현미경 | Leica | M205 C | Leica FusionOptics, Planapo 0.63x M 시리즈 대물 및 글라이딩 스테이지 장착 |
| 현미경 카메라 | Leica | MC170 | HD 컬러 카메라 |
| 라이딩 스테이지 | Leica | 10446301 | 글라이딩 스테이지는 두 개의 금속판으로 구성됩니다. 베이스 플레이트가 고정되어 있습니다. 상부 플레이트는 그리스가 칠해진 인터페이스로 미끄러져 회전 및 선형 이동을 허용합니다. |
| 수술 스테이션 및 안정화 포크 | 고래 제조 맞춤형 | Laminectomy | |
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| KCl | Fisher Scientific | 7447-40-7 | aCSF |
| 포도 | Fisher Scientific | 50-99-7 | aCSF |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | aCSF |
| MgCl2& 미드 도트; 6H2O | Fisher Scientific | 7791-18-6 | aCSF |
| CaCl2·용; 2H2O | Fisher Scientific | 10035-04-8 | |
| 카프로펜 | 리마딜 | QM01AE91 | 진통제균 |
| 정균수 | Henry Schein | 2587428 | 카프로펜 |
| 이소플루란 | Henry Schein | 11695-6776-2 | 마취 |
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| Agarose High EEO | Sigma | A9793 | 젤 포인트 34-37도 C |
| 안과 윤활 연고 | Akwa Tears | 68788-0697 | 각막 건조 방지 |
| MOM Two-Photon Microscope | Sutter |
참고문헌
- Weinger, J. G., et al. Two-photon imaging of cellular dynamics in the mouse spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy. Journa....
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