방법 논문

이방성 고분자 인공 항 원 제시 세포 CD8 + T 세포 활성화의 제조

DOI:

10.3791/58332

⸱

2018년 10월 12일

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1Biomedical Engineering, Translational Tissue Engineering Center, Institute for Nanobiotechnology, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Biomedical Engineering, Translational Tissue Engineering Center, Institute for Nanobiotechnology, Ophthalmology, Oncology, Neurosurgery, Materials Science and Engineering, Chemical and Biomolecular Engineering, and the Bloomberg-Kimmel Institute for Cancer Immunotherapy, Johns Hopkins University School of Medicine

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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여기, 우리는 빨리 그리고 reproducibly 생물학적 영감, 생 분해성 유일 항 원 제시 세포 (aAPC) 가변 크기, 모양, 및 T 셀 확장 비보 전 또는 vivo에서 표면 단백질 프레 젠 테이 션을 생성 하는 프로토콜을 제시 .

초록

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인공 항 원 제시 세포 (aAPC)는 T 세포를 자극 하는 강력한 능력으로 인해 면역 변조에 대 한 유망한 플랫폼입니다. Acellular 기판 신호 프레 젠 테이 션 매개 변수 정밀 제어 및 aAPC 표면 조절 T 세포와의 상호 작용의 물리적 속성을 포함 하는 셀 기반 aAPC에 비해 주요 장점을 제공 합니다. 비 등방성 입자에서 건설 aAPC 특히 타원 입자 자극 T 세포 증가 바인딩 및 T 세포에 사용할 수 있는 더 큰 표면 영역에 구형 들 문의 또한 보다 더 효과적인 것으로 표시 되었습니다 로 일반적인 이해 및 향상 된 pharmacokinetic 속성 감소. 비 등방성 입자에 대 한 관심 증가도 불구 하 고도 광범위 하 게 구현 하 고 사용할 reproducibly 도전적 일 수 있다 박막 스트레칭과 같은 비 등방성 입자를 생성의 방법 허용.

이 위해, 우리는 가변 크기, 모양, 생 분해성 비 등방성 입자 기반 aAPC의 급속 하 고, 표준화 된 제조에 대 한 프로토콜을 설명 하 고 T 세포 확장 비보 전 또는 vivo에서함께 하는 방법에 대 한 프레 젠 테이 션을 신호 그들의 크기, 형태, 및 표면 단백질 콘텐츠, 특성 및 그들의 기능을 평가 하기 위해. 이방성 aAPC 날조에이 접근은 확장 가능 하 고 재현성, 이상적 aAPC "상용" immunotherapies에 대 한 생성.

서론

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그들은 강력한 항 원 특정 T 세포 응답을 생성할 수 있기 때문에 인공 항 원 제시 세포 (aAPC) immunomodulatory 대리인으로 약속으로 나타났습니다. 이러한 플랫폼에 필수적인 그들의 능력을 효율적으로 T 세포 활성화에 대 한 중요 한 신호를 제시 있습니다. 그들은 쉽게 하 고 적은 비용이 많이 드는 조작, 스케일 업 및 번역, 중 적은 직면 및 세포 기반 치료와 관련 된 위험을 완화 하기 때문에 acellular aAPC 셀 기반 aAPC에 매력적인 대안 있습니다. Acellular aAPC는 또한 높은 정도의 제어 신호 프레 젠 테이 션 매개 변수 및 T 세포1인터페이스 표면의 물리적 특성에 대 한 수 있습니다.

aAPC는 2 개의 신호 T 세포 활성화에 대 한 필수 최소를 정리 해야 합니다. 신호 1 항 원 인식 하며 T 세포 수용 체 (TCR)를 인식 하 고 I 또는 II 베어링의 동족 항 원 TCR 복잡 통해 신호에 culminating MHC 클래스와 함께 종사 하는 경우에 발생 합니다. 항 원 특이성 요구 하지 않아도, aAPC 시스템은 종종 agonistic 단일 클론 항 체를 nonspecifically TCR 복잡 한 자극 CD3 수용 체에 대 한 부담. MHC, 특히....

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프로토콜

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여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 존스 홉킨스 대학에 의해 승인 되었습니다.

1. 가변 크기의 구형 PLGA 입자의 제조

  1. 입자 합성에 대 한 자료의 준비
    1. 5 %w / w 폴 리 비닐 알코올 (PVA) 솔루션을 준비 합니다.
      1. 마그네틱 볶음 바 삼각 플라스 크에 이온된 (DI) 수의 500 mL를 추가 하 고 온도계로 핫 플레이트 활동가 500 rpm 및 모니터 온도에 놓습니다. 증발을 방지 하기 위해 은박지와 플라스 크를 커버.
      2. 물 온도 약 70 ° C에 도달 하면 추가 25 g 총 PVA의 작은 배치에서 시간이 지남에, PVA를 더 추가 하기 전에 해산을 기다리는.
      3. 모든 PVA (일반적으로 30-60 분)를 해산 하 고, 일단 하자 솔루션 시 원하고 살 균 필터. 나중에 사용할 4 ° C에서 저장 합니다.
    2. 10 %w / w PVA의 영화 캐스팅 솔루션 및 2 %w / w 글리세롤을 준비 합니다.
      1. 마그네틱 볶음 바 삼각 플라스 크에 디 물 500 mL를 추가 합니다. 실내 온도와 혼합 분쇄 하 여 글리세롤의 8 mL를 추가 합니다.
      2. ....

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결과

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자동화 된 2D 박막 장치를 스트레칭 위한 회로도 그림 1에서 주어진 다. 회로도 및 장치를 스트레칭 1 D 박막에 대 한 설명을 들 것은 알루미늄 부품 표준 밀링 및 가공 기술을 사용 하 여에서 건설 하는 호 외.17 에 부여 됩니다. 1 D 들 것와 마찬가지로, 2D 들 것 금속 그립 및 가이드 레일의 구성 되어 있습니다. 양방향 리드 나사 선형 회전 운동에 번역 하는 데 사용 됩니다. 리드 나사는 충분 한 토크를 가진 동일한 스테퍼 모터를 기계 탭을 통해 연결 된. 8 스테퍼 모터 제어 전선 박막 스트레칭을 위한 오븐 제어 콘솔에 쉽게 첨부 파일에 대 한 8-핀 열 amphenol 커넥터에 납땜 될 수 있다. 소계 (PTFE) 코팅 와이어 충분 한 길이의 스테퍼 모터 드라이버 제어 콘솔에서 연결을 사용 해야 합니다. 추천된 컴퓨터 제어 구조는

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토론

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이 프로토콜 이방성 고분자 입자의 정확한 세대에 대 한 다양 한 방법을 자세히 설명합니다. 여기서 설명 하는 기술 스트레칭 박막 확장성, 높은 재현성 및 저렴 한입니다. 비 등방성 입자를 생성 하기 위한 대체 기술 높은 비용, 낮은 처리량, 그리고 제한 된 입자 크기를 포함 하 여 많은 한계에서 고통. 박막 접근 스트레칭 또한 유리 입자 합성, 후 이방성 되도록 수정 때문에 이며, 결과적으로 다양 한 입자 크기 및 합성 기술을와 호환 됩니다. 그림 1 자동 2 차원 기지개 장치의 설치를 자세히 설명합니다. 이 장치 또한 영화 스트레칭의 원하는 수준에 도달 했습니다 때까지 나사를 수동으로 설정 하 여 전자 부품 없이 사용할 수 있습니다. 그러나, 우리가 훨씬 더 일관 되 고 수동 작업15보다 빠른 자동화 된 프로세스를 발견 했다. 다양 한 기술은 미세 접근17,,<.......

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공개 사항

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저자는 공개 없다.

감사의 글

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EBA (DGE-1746891)와 KRR (DGE-1232825) NSF 대학원 연구 친교 프로그램을 지원 위한 감사합니다. RAM 국가 연구 서비스 상 NIH NCI F31 감사 (F31CA214147)와 지원을 위해 대학 과학자 들은 친목을 위한 성과 보상. 저자 감사 NIH (R01EB016721 및 R01CA195503), 방지 실명 제임스와 캐롤 무료 카 탈 수상, 연구 및 지원에 대 한 암 Immunotherapy JHU 블룸버그 Kimmel 연구소.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
폴리(비닐 알코올), MW 25000, 88% 가수분해Polysciences, Inc.02975-500
글리세롤Sigma-AldrichG9012
디지털 온도계FlukeN/A모델명: Fluke 52 II
침수 온도 프로브Fluke N/A모델명: Fluke 80PK 22
디지털 핫플레이트 및 StirrerBenchmark ScientificH3760-HS
멀티포인트 교반기Thermo Fisher Scientific50093538
Resomer RG 504 H, Poly(D,L-lactide-co-glycolide)Sigma-Aldrich719900
DichloromethaneSigma-AldrichD65100
HomogenizerIKA 
Sonicator음향 및 재료, Inc.N / A모델 번호 : VC 505
Sonicator 소음 감소 인클로저Sonics & 재료, Inc.N/A부품 번호: 630-0427
초음파 발생기 프로브Sonics & 재료, Inc.N/A부품 번호: 630-0220
Sonicator microtipSonics & 재료, Inc.N/A부품 번호: 630-0423
고속 원심분리기Beckman CoulterN/A모델 번호: J-20XP (단종), 대체 모델: J-26XP
고속 원심분리기 로터Beckman Coulter369691모델 번호: JA-17
고속 폴리카보네이트 원심분리기 튜브Thermo Fisher Scientific3118-005050 mL, 나사 캡
직사각형 일회용 페트리 접시VWR International25384-32275 x 50 x 10 mm
사각형 일회용 페트리 접시VWR International10799-140100 mm x 100 mm
LEAF  정제된 안티-마우스 CD3&엡실론; 항체Biolegend100314
InVivoMab 안티 마우스 CD28, 클론 37.51Bio X CellBE0015-1
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochlorideSigma-AldrichE6383
N-Hydroxysulfosuccinimide sodium saltSigma-Aldrich56485
MESSigma-AldrichM3671
Alexa Fluor 488 안티-마우스 CD3 항체Biolegend100212
APC 안티-마우스 CD28 항체Biolegend102109
Corning  96웰 고체 폴리스티렌 마이크로플레이트Sigma-AldrichCLS3915평평한 바닥, 검은색 폴리스티렌
단백질 LoBind 튜브, 1.5 mLEppendorf22431081
RPMI 1640 Medium (+ L-Glutamine)ThermoFisher Scientific11875093
Fetal Bovine SerumSigma-AldrichF4135Heat Inactivated, sterile-Aldrich
CiprofloxacinSigma-Aldrich17850
2-메르캅토에탄올Sigma-AldrichM6250
Biolegend(
100 mM)ThermoFisher Scientific11360070
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)ThermoFisher Scientific11140050
MEM 비타민 솔루션 (100X)ThermoFisher Scientific11120052
CD8a+  T 세포 분리 키트, 마우스Miltenyi Biotech130-104-075
CellTrace CFSE 세포 증식 키트ThermoFisher ScientificC34554
LS 컬럼Miltenyi Biotech130-042-401
MidiMACS 분리기Miltenyi Biotech130-042-302
MACS MultistandMiltenyi Biotech130-042-303
유세포 분석기Accuri C6
Synergy 2 다중 검출 마이크로플레이트 리더BioTek
autoMACS Running BufferMiltenyi BIotech130-091-221
세포 여과기ThermoFisher Scientific22363548Sterile, 70 µ m 나일론 메쉬
ACK 용해 버퍼ThermoFisher ScientificA1049201
C57BL/6J (Black 6) 마우스The Jackson Laboratory000664Male, 최소 7주 된
U-Bottom 조직 배양 플레이트VWR353227멸균, 96-웰 조직 배양 처리 폴리스티렌 플레이트
40V DC 전원 공급 장치ProbotixLPSK-4010
PTFE 코팅된 와이어Mouser602-5858-100-01이것은 100피트 스풀용이지만 동등한 와이어가 작동합니다.
스테퍼 모터 드라이버ProbotixMondoStep5.6
IDC 커넥터 키트ProbotixIDCM-10-12
마이크로컨트롤러ProbotixPBX-RF
4A 퓨즈라디오 쉑2701026등가 퓨즈도 작동합니다
DB25 남성-남성 케이블ProbotixDB25-6
USB-A to USB-B 케이블스테이플2094915동등한 케이블도 작동합니다
. 8핀 Amphenol 커넥터 남성 및 여성Mouser654-97-3100A-20-7P 및 654-97-3106A20-7S
스테퍼 모터ProbotixHT23-420-8
오른손 리드 스크류Roton60722
왼손 리드 스크류Roton60723
나사McMaster Carr92196A151
네오프렌 고무McMaster Carr8698K51
오른손잡이 플랜지 리드 너트Roton91962
왼손잡이 플랜지 리드 너트Roton91963
Linux 제어 컴퓨터ProbotixLCNC-PC일치하는 사양 및 Linux 운영 체제를 갖춘 모든 컴퓨터가 작동합니다
Corning 병 상단 진공 필터 시스템Sigma-AldrichCLS431097
Trypan Blue Solution, 0.4 %ThermoFisher Scientific15250061
0003725001 피루브산 나트륨 589102 .

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Eggermont, L. J., Paulis, L. E., Tel, J., Figdor, C. G. Towards efficient cancer immunotherapy: Advances in developing artificial antigen-presenting cells. Trends in Biotechnology. 32 (9), 456-465 (2014).
  2. Maus, M. V., Riley, J. L., Kwok, W. W., Nepom, G. T., June, C. H.

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