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방법 논문

침공을 공부 하 고 방광 암에서 치료제를 평가 하기 위한 3 차원 셀 문화 시스템

8.6K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/58345

⸱

2018년 9월 13일

 ,  ,  , 
1Departments of Internal Medicine, Hematology/Oncology Division, Rogel Cancer Center, University of Michigan Medical Center, 2Department of Urology, Division of GU Oncology, Rogel Cancer Center, University of Michigan Medical Center, 3Departments of Surgery and Pathology, Perlmutter Cancer Center, NYU Langone Health

이 논문에서

요약

방광 암 침공을 관리 하는 프로세스는 바이오 마커 및 치료 개발을 위한 기회를 나타냅니다. 여기 우리는 종양 spheroids 시간 경과 화상 진 찰, confocal 현미경 검사 법의 3 차원 문화를 통합 하는 방광 암 침공 모델 제시. 이 기술은 침략 과정의 기능을 정의 하 고 치료제 심사에 대 한 유용 합니다.

초록

방광 암은 중요 한 건강 문제 이다. 그것은 추정 이상 16000 사람들 방광 암에서 미국에서 올해를 죽을 것 이다. 방광 암의 75%는 비 침 습과 전이 가능성, 약 25%는 침략 적인 성장 패턴을 진행 합니다. 침 윤 성 암 환자의 절반 최대 치명적인 전이성 재발을 개발할 것입니다. 따라서, 환자 결과 예측 하 고 치명적인 전이 방지 하는 중요 한 이다 방광 암에 침략 적 진행의 메커니즘을 이해. 이 문서에서는, 우리는 종양 세포 및 기질 구성 요소 vivo에서 발생 하는 조건에서 방광 종양 microenvironment 모방의 설립을 허용 하는 3 차원 암 침공 모델 제시. 이 모델에는 시간 경과 화상 진 찰을 사용 하 여 실시간으로에서 침입 과정을 관찰, 블록 침공 가능성 confocal immunofluorescent 이미징 및 화면 화합물을 사용 하 여 관련 된 분자 경로 심문 하 기회를 제공 한다. 이 프로토콜은 방광 암에 초점을 맞추고, 그것은 유사한 방법 침공과 운동 성 뿐만 아니라 다른 종양 유형에서 검사 사용 될 수 가능성이 높습니다.

서론

침략은 암 진행, 전이, 필요한 이며 낮은 생존 및 환자에 있는 빈약한 예 지와 관련 있는 중요 한 단계 이다. 인간의 방광 암, 요로 전세계 연간 약 165000 사망 원인의 가장 일반적인 악성 암 단계, 치료 및 예 후는 직접 관련이 침공1의 유무. 방광 암의 경우 약 75%는 비 근육 침략과 관리 지역 절제와 함께. 반면, 근육 침 윤 성 방광 암 (모든 경우의 약 25%) 높은 전이성 속도 공격적인 종양 이며 적극적인 multimodality 치료2,3와 함께 처리 됩니다. 따라서, 이해 하는 분자 경로 침략을 방 아 쇠를 침략 적 진행을 방지할 수 있는 치료 내정간섭을 개발 하 고 더 침략 적 진행의 위험 특성을 필수적 이다.

종양 침 습 진행 복잡 한 3 차원 (3 차원) 환경에서 발생 하 고 다른 종양 세포, 기질, 지하실 멤브레인와 다른 종류의 세포 면역 세포, 섬유 아 세포, 근육 세포를 포함 하 여 종양 세포 상호 작용을 포함 하 고 혈관 내 피 세포입니다. 그들은 실시간으로 침공 과정의 미세한 모니터링을 허용 하지 않습니다 때문에 침투성 지원 (예, Transwell) 분석 결과 시스템은 일반적으로 암 세포 침공4, 하지만이 시스템을 quantitate를 고용 제한 됩니다 및 검색 더 얼룩 및 분자 분석에 대 한 샘플의 도전 이다. 체 외에 시스템의 편의 함께 정의 된 microenvironmental 구성 요소의 설립을 허용 하기 때문에 침공을 공부 하는 3 차원 방광 종양 회전 타원 체 시스템 개발이 바람직합니다.

이 프로토콜에서 세포 운동 성 모니터링 조사 관 수 있도록 콜라겐 기반 젤 매트릭스와 confocal 현미경 검사 법 통합 3 차원 회전 타원 체 침공 분석 결과 사용 하 여 인간의 방광 암 세포의 침입 과정을 심문 하는 시스템을 설명 하 고 실시간으로 (그림 1A)에 침공. 이 시스템은 다양 한 고가 다양 한 stromal 종양 설정을 수정할 수 있습니다. 그것은 암 관련 된 섬유 아 세포 및 면역 세포5,,67와 같은 대부분의 방광 암 세포 선 또는 기본 방광 종양와 추가 stromal 세포 통합할 수 있습니다. 이 프로토콜 타입-1 콜라겐으로 구성 된 행렬을 설명 하지만 fibronectin, laminin, 또는 다른 콜라겐 단백질 등 다른 분자를 포함 하도록 수정할 수 있습니다. 현미경을 사용 하는 시스템의 기능에 따라 72 h 이상 침입 프로세스를 다음 수 있습니다. 고정 및 이전, 도중, 그리고 침략 후 3 차원 매트릭스에 포함 된 종양의 면역 형광 얼룩 수 단백질 upregulated 침입 세포에 따라서 일반적으로 결 석 또는 수집 하기 어려운 중요 한 정보를 제공의 심문 다른 3 차원 문화 모델을 사용 하 여. 이 시스템 신호 경로 같은 화합물에 의해 영향을 나타냅니다 하 고 침입을 차단 하는 스크린 화합물에도 활용할 수 있습니다.

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프로토콜

1. 성장 암 Spheroids

  1. 셀 라인에서 성장
    1. 기존의 점착 아래 문화 인간 방광 암 세포 세포 문화 조건 하 고 5% CO2와 함께 제공 되는 37 ° C 배양 기에서 유지 합니다. 에 셀 유지 < 90 %confluency.
      참고: 사용 하는 문화 미디어는 Dulbecco의 최소 필수 미디어 (DMEM) 4.5 g/L D-포도 당, L-글루타민, 110 mg/L 나트륨 pyruvate, 포함 된 수정 하 고 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)이이 프로토콜을 통해 제공.
    2. 실험의 시작에 앞서 1 일 trypsinize (0.25%를 사용 하 여 트립 신-EDTA) 셀 셀 농도 측정 및 1 x 106 셀 6-잘 매우 낮은 부착 판의 각 잘 3 mL 문화 미디어에 배포.
    3. ≥16 h에 대 한 37 ° C에서 낮은 첨부 조건 셀을 품 어. 이 셀에 대 한 충분 한 시간을 허용 해야 대부분 방광 암 세포 라인에 대 한 spheroids로 집계 하.
      참고: spheroids의 형성은 거꾸로 밝은 분야 현미경으로 관찰할 수 있습니다. 최적의 크기와 spheroids의 수, 개별 실험에 따라 달라질 수 있습니다 하지만 우리는 50 µ m에서 150 µ m 직경을 가진 spheroids는 일반적으로 렌즈는 20 X를 사용 하 여 시간 경과 영상에 적합 찾을.
    4. 추가 셀 형식, 섬유 아 세포 등 면역 세포는 spheroids로 통합을 원하는 비율로 암 세포를 원하는 세포 혼합 (1:1, 1:10, 등.) 매우 낮은 첨부에 접시와의 형성을 허용 하도록 ≥16 h 37 ° C에서 품 어 혼합된 셀 형식 spheroids입니다.
  2. 1 차 종양에서 성장
    참고: spheroids 또한 기본 방광 종양에서 파생 될 수 있다 종양 종양 발암 물질 유발 방광 종양 모델8개발 같은 소스. 예를 들어 방광 종양 생쥐에서 생성 된 n 먹이-부 틸-N-(4-hydroxybutyl) nitrosamine (BBN)을 수확 하 고 무 균 수술 도구를 사용 하 여 (약 0.5 m m3) 작은 조각으로 다진 수. 기본 샘플 암 또한이 시스템에 공부 될 수 있다 인간 방광의 소화.
    1. 수집 하 고 5 mL 차가운 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)에서 0.5 m m3 종양 조각 씻어. 4 ° c.에서 5 분 동안 200 x g 에서 원심 분리 한 번이 세 단계를 반복 합니다.
    2. 4 ° c.에서 10 분 동안 200 x g 에서 원심 분리에 의해 종양 조각 수집 상쾌한을 제거 하 고 10% 포함 된 DMEM의 5 mL을 추가 FBS. 6 잘 매우 낮은 정판에 종양 회전 타원 체/미디어 혼합물을 전송. ≥16 콜라겐 매트릭스에 포함 하기 전에 h 37 ° C에서 품 어 (단계 2.3 참조).

2. 3 차원 문화 챔버 준비

  1. 10% 포함 된 DMEM에 타입-1 콜라겐 (쥐 꼬리에서 파생) 희석 FBS 제조업체의 지침에 따라 2 mg/mL의 혼합물을 만들기 위해.
    1. 즉, 1 N NaOH 솔루션의 적절 한 양의 콜라겐을 혼합 하 고 부드러운 pipetting으로 DMEM 생리 pH를 달성 하는 제조업체의 지침에 따라.
    2. 콜라겐과 DMEM 혼합 후 신속 하 게 코트 챔버 슬라이드의 우물 (에 대 한 대부분의 응용 프로그램, 숫자 1.5 커버 유리 챔버 슬라이드 최적의) 응고 (200 µ L/잘) 전에 콜라겐 DMEM 혼합. 15 분 동안 실내 온도에 고정 되도록 코팅된 챔버 슬라이드를 수 있습니다.
      참고: 콜라겐 기반 매트릭스의 구성을 수정할 수 있습니다 fibronectin 등 laminin, 다른 기질 재료를 추가 하 여 실험의 목적에 따라.
  2. 부드럽게 피펫으로 500 µ L 빈 1.5 mL microcentrifuge 관으로 6-잘 매우 낮은 정판에서 spheroids (또는 종양, 주 종양 샘플을 사용 하는 경우)를 포함 하는 미디어의. 튜브의 바닥에 침전 하는 spheroids를 2 분 동안 기다립니다.
  3. 튜브에서는 상쾌한을 조심 스럽게 제거. 10% 포함 된 DMEM 혼합 1 형 콜라겐 (2 mg/mL)의 또 다른 튜브 준비 FBS는 spheroids에이 혼합물의 500 µ L를 신속 하 게 추가. 부드럽게 천천히 pipetting으로 spheroids과 콜라겐을 섞는다.
  4. 콜라겐 사전 코팅 챔버 슬라이드의 250 µ L spheroids/콜라겐 혼합의 추가. 콜라겐 매트릭스 완전히 응고를 spheroids 포함 된 (37 ° C에서 약 30 분)을 허용 합니다.
  5. 콜라겐 매트릭스 경화 후 추가 10% 포함 된 DMEM의 1 mL FBS을 각 영역 (그림 1B). 이미징에 대 한 준비까지 5% CO2 와 함께 제공 된 37 ° C 배양 기에서 챔버 슬라이드를 품 어.

3. 라이브 셀 시간 경과 영상

  1. Confocal 현미경 제조업체의 지침에 따라 켜고 기후 챔버 37 ° C에 도달 하 고 5% CO2와 함께 제공 됩니다.
    참고: 우리의 현미경 및 챔버 일반적으로 시스템이 평형에 도달 하는 1 h 필요 합니다.
  2. 신중 하 게 현미경에 부착 된 슬라이드 어댑터 챔버 슬라이드를 전송 합니다.
  3. 낮은 전력 목표 (예를 들어, 5 X)를 사용 하 여 관심사의 spheroids를 찾아서 높은 전력 목표와 이미징 시작 (현재 프로토콜, 20 X 목표는 그것의 더 나은 이미지 품질에 대 한 라이브 셀 이미징의 대부분).
    참고: 기본 방광 종양 샘플, 5 X 10 X 목적과 필요할 수 있습니다 큰 이미지 영역을 커버 하기 위하여. 우리의 시간 경과 영상에 대 한 이미징 간격을 30 분으로 설정 하 고 Z 스택 전체 회전 타원 체의 이미지를 사용 된다. 일반적으로 Z 슬라이스 간의 거리 설정 됩니다 4 µ m에 대 한 목표, 및 Z 축의 총 거리 20 약 200 μ m 이미지 DIC를 사용 하 여 얻을 수 있습니다와 형광 세포/조직 항구 형광 단백질 마커.
  4. 24-72 h에 대 한 시간 경과 영상을 수행 합니다.
    참고: 기간 셀 종류와 실험의 요구에 의해 결정 됩니다.

4. 냉동된 조직 단면에 대 한 암 Spheroids를 포함 하는 샘플 블록의 준비

  1. 조심 스럽게 작은 집게를 사용 하 여 콜라겐 젤과 챔버 슬라이드에서 spheroids의 블록을 들어올립니다. 플라스틱 조직학 형에서 콜라겐 젤 블록을 배치 합니다.
  2. 간단히, 1 x PBS와 콜라겐 젤 린스 하 고 수정 4 %paraformaldehyde (PFA)와 함께 PBS에 실 온에서 30 분.
    주의: PFA 잠재적인 발암 물질 이며 신중 하 게 처리 되어야 한다.
  3. 워시 15 분 바꾸기에 대 한 통에 1 x PBS의 1.5 mL와 콜라겐 젤 PBS와 이전 세척 단계 3를 반복.
  4. 최적의 절삭 온도 (10 월) 새로운 플라스틱 조직학 몰드의 하단 커버 화합물의 얇은 층 (약 3 m m)를 적용 합니다. 고정 배치 하 고 콜라겐 젤 OCT 위에 씻어 화합물, 후 신중 하 게 포함 전체 젤 oct OCT에서 모든 공기 거품의 형성을 피하고 있는 동안 복합 금형을 작성 하 여.
  5. 1 시간에 4 ° C에서 금형을 둡니다.
  6. 금형 샘플 및 10 월 복합 액체 질소에 100 mm 페 트리 접시에 놓습니다. 완전히 플래시 동결을 샘플을 수 있습니다.
  7. 나중에 사용-80 ° C에서 냉동된 샘플 블록을 저장 합니다.

5. 면역 형광 이미징 냉동된 Sectioned 암 Spheroids에 대 한

  1. 양도 cryostat의 상공 회의소는-20 ° C-80 ° C 냉장고에서 냉동된 샘플 블록.
  2. 기존의 냉동 단면 7 µ m 단면도 간격을 설정 하 여 수행 합니다. Sectioned 샘플 주름 없이 유리 슬라이드에 연결 하거나 공기 갇혀.
    1. 더 얼룩을 수행 하기 전에-80 ° C에 슬라이드를 저장 합니다.
      참고: 다른 간격으로 실험적인 요구에 맞게 사용할 수 있습니다.
  3. 공기 건조 실 온에서 1 h에 대 한 슬라이드.
  4. 0.5%를 포함 하는 PBS를 가진 샘플 permeabilize 15 분에 대 한 트라이 톤 X-100.
  5. 워시 워시 당 10 분에 대 한 PBS 가진 3 배를 샘플링합니다.
  6. 소수 성 장벽을 펜을 사용 하 여 소수 장벽 슬라이드에 샘플을 둘러싸 자.
  7. 실 온에서 1 h에 대 한 차단 솔루션 (1 x PBS 5% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)를 포함), 샘플을 처리 합니다.
  8. 기본 포함 하는 항 체 솔루션 (1 x PBS 포함 하는 1 차적인 항 체의 1: 100 희석와 5 %BSA)의 40 µ L 각 샘플 슬라이드에 적용 됩니다.
  9. 1 차적인 항 체 또는 하룻밤 (보육 시간 및 조건에 따라 다를 1 차적인 항 체) 실 온에서 1 h 동안 37 ° C에서의 슬라이드를 품 어.
  10. 세척 (세척) 당 15 분에 대 한 PBS 가진 3 배를 샘플링합니다.
  11. 2 차 항 체를 포함 하 솔루션 (1:300 이차 항 체 희석 BSA의 5%를 포함 하는 1 x PBS)의 40 µ L 각 샘플 슬라이드에 적용 됩니다.
  12. 세척 (세척) 당 15 분에 대 한 PBS 가진 3 배를 샘플링합니다.
  13. 10 분 동안 실내 온도에 Hoechst 33342 솔루션 (1 µ g/mL, PBS에 희석) 샘플을 얼룩. 다음 샘플 PBS 가진 5 분 동안 세척.
  14. 설치 매체와 함께 샘플을 탑재 하 고 적절 한 크기의 덮개 미 끄 러 짐으로 그들을 커버. 24 h에 대 한 실 온에서 어둠 속에서 슬라이드를 두고 confocal 현미경 검사 법을 수행.

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결과

침 윤 성 방광 암 종양 회전 타원 체의 성공적인 창조 적절 한 크기의 종양 세포 선 또는 1 차 종양에서 spheroids의 형성을 필요합니다. 그림 2 A 4 인간의 방광 암 세포 선 (UM UC9, UM UC13, UM UC14, 253J, 및 UM UC18)에서 개발 하는 적절 한 크기의 spheroids를 보여 줍니다. 그림 2 B 콜라겐 매트릭스에 포함 된 BBN 생성 마우스 방광 종양에서 종양 회전 타원 체를 보여줍니다. 위에서 설명한 대로 이러한 spheroids 포함 했다 고 대표 이미지 라이브 셀 이미징에 대 한 장비는 현미경을 사용 하 여 체포 되었다. 마우스 방광 종양 spheroids 5 X 10 X 렌즈를 사용 하 여 시험 되었다 반면 20 X 객관적 렌즈 이미징 UM UC9, U...

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토론

여기는 방광 암은 암 진행과 전이 대 한 중요 한 침입의 실시간 관찰을 허용 하는 3 차원 종양 회전 타원 체 모델에 설명 합니다. 이 시스템은 다양 한 기질과 세포 구성 요소 있도록 더 나은 정리를 조사 조직 microenvironment 방광 암 침공 수행의 의무가 있습니다. 방광 암 spheroids (를 포함 하 여 유전자 변형된 세포 선을 침공 프로세스에 영향을 주는 경로 신호의 검사에 유용), 셀 라인 등 다양 한 소스에서 생성 될 수 있습니다 및 기본 마우스 종양 (여기에 설명 된). 그것은 잠재적으로 수 또한 인간의 기본 종양 분석에 대 한 적응. 이미징 시스템 사용에 따라 실시간으로 또는 고정 및 다양 한 시간 포인트에서 얼룩 면역 형광 형광을 모니터링할 수 있습니다. 시스템 내 습의 잠재적인 억제제를 테스트를 사용할 수 있습니다. 이것은 시스템 방광 암 생물학을 평가 하기 위해 다양 하 고 강력한 도구.

기후 챔버 온도 제어, 습도 제어, 및 CO2

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공개 사항

저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.

감사의 글

저자는 기술 지원 및 제공 자료와이 연구에 대 한 장비 및 기술 지원에 대 한 앨런 Kelleher 박사 하 워드 크로포드 (미시간 대학)의 실험실을 감사 하 고 싶습니다.

이 작품은 미시간 Rogel 암 센터 코어 그랜트 CA046592-26S3, NIH K08 CA201335-01A1 (PLP), BCAN YIA (PLP), NIH R01 CA17483601A1 (DMS)의 대학에서 교부 금에 의해 투자 되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
인간 방광암 세포주 UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, UM-UC18, 253J
DMEM 세포 배양 배지Thermo Fisher Scientific11995065
태아 소 혈청 Thermo Fisher Scientific26140079
항생제-항진균제 (100x)Thermo Fisher Scientific15240062
트립신-EDTA (0.25%), 페놀 레드Thermo Fisher Scientific25200056
소 혈청 알부민 (BSA)Sigma-AldrichA3803
인산염 완충 식염수 (PBS), pH 7.4 Thermo Fisher Scientific10010023
Costar Ultral-low 첨부 6-웰 클러스터 Corning3471
기존 도립 현미경 Carl Zeiss491206-0001-000세포 배양 및 스페로이드 검사를 위한 일반 사용
콜라겐 타입 1, 쥐 꼬리에서 추출, 고농도 Corning354249
Nunc Lab-Tek II 챔버 커버글라스Thermo Fisher Scientific155382
컨포칼 현미경 Carl ZeissLSM800기후 챔버, 다중 위치 이미징 및 Z-스택 스캐닝 기능을 갖춘 컨포칼 미스코스코프 
저온 유지 장치 마이크로톰Leica BiosystemsCM3050 S
Zen 2 이미지 처리 소프트웨어 Carl Zeiss
파라포름알데히드 용액전자 현미경 과학15710
ImmEdge 소수성 장벽 PAP 펜벡터 실험실 H4000
O.C.T 컴파운드 Thermo Fisher Scientific23730571
Hoechst 33342 솔루션 Thermo Fisher Scientific62249
Anti-ATDC (Trim29) 항체Sigma-AldrichHPA020053
Anti-Cytokeratin 14 항체Abcamab7800
Anti-Vimentin 항체Abcamab24525
ProLong Diamond 장착 매체

참고문헌

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