HMCA 기반 이미징 접시 침공 분석 결과 성능을 위해 제공 됩니다. 이 접시는 spheroids 3 차원 (3D) 종양의 형성과 기질 (ECM)에 암 세포의 측정을 촉진 한다. 침공 분석 결과 정량화 자동 분석 함으로써 이루어집니다.
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방법 논문
암 세포 침입과 반대로 전이성 마약 히드로 마이크로-챔버 배열 (HMCA)를 사용 하 여 심사 분석-플레이트를 기반으로
이 논문에서
요약
초록
암 전이 암 치의 90% 원인으로 알려져 있다. 전이 인접 조직으로 종양 세포의 침투/침공과는 다단계 프로세스입니다. 따라서, 침략 전이, 매우 중요 한 침공 과정 연구와 반대로 전이성 약물의 개발을 하는 중요 한 단계입니다. 이 수요를 해결 하기 위해 단단한 종양의 구조를 모방 하는 3 차원 생체 외에서 모델을 개발할 필요가 있다 그리고 vivo에서 상태 한 손으로, 하지만 동시에 가장 밀접 하 게 그들의 microenvironment 재현, 강력 하 고 적합 고수익 고 높은 콘텐츠 측정입니다. 현재, 대부분 침공 분석 적절 한 정교한 미세 기술을 의지할 연구 하지만 대량 약물 검사. 각 잘에서 격리 된 개별 spheroids와 플레이트 기반 장치를 사용 하 여 다른 분석 실험 자료 소모 고 조건 당 낮은 샘플 크기. 현재 프로토콜의 목표는 종양 spheroids의 큰 인구에서 침략 용량 분석을 위한 간단 하 고 재현성 biomimetic 3D 셀 기반 시스템을 제공 하는입니다. 우리는 종양 침입과 반대로 전이성 신약의 연구에 대 한 HMCA 이미징 플레이트에 따라 침입 분석 결과 대 한 3D 모델을 개발 했다. 이 장치는 지속적으로 하 고 동시에 관찰 하 고 측정 하는 매체에 대 한 단일 요소 해상도에서 spheroids 동안 ECM 구성 요소에 의해 포위 잘 (조건 당 높은 샘플 크기) 당 수많은 균일 한 spheroids의 생산 수 있습니다. 반대로 전이성 약물의 처리량 심사입니다. 이 플랫폼 여기 헬러와 MCF7 예증 단일 셀 및 집단의 침략에 대 한 spheroids의 생산에 의해 제공 됩니다. 우리는 헬러 spheroids 주위의 콜라겐의 침략 적 용량에 ECM 성분 히 알루 론 산 (HA)의 영향을 비교 합니다. 마지막으로, 우리 소개 Fisetin (침공 억제제) 헬러 spheroids 및 산화 질소 (NO) (침공 활성 제) MCF7 spheroids. 결과 다중 매개 변수 검사를 용이 하 게 하는 반자동, 간단 하 고 빠른 분석을 가능 하 게 사내 소프트웨어에 의해 분석 된다.
서론
암 사망은 먼 위치에 전이성 세포의 보급에 주로 기인 합니다. 암 치료에 많은 노력 대상 또는 전이성 식민지의 형성과 조직의 전이성 질환1의 진행 방지에 초점. 암 세포 마이그레이션 종양 전이 과정에서 중요 한 단계 이다, 따라서, 암 침입 캐스케이드의 연구는 매우 중요 하 고 필수 안티 전이성 치료제를 찾는 데는.
전이성 질환 연구 도구로 동물 모델의 사용은 매우 비싼 고 하지 항상 인간의 종양의 대표적인 발견 되었습니다. 또한, 세포 외 microenvironment 토폴로지, 역학 및 구성 강하게 영향을 암 세포 행동2. Vivo에서 모델은 본질적으로 분리 및 암 내 습 및 전이에 공헌 하는 같은 특정 매개 변수를 제어 하는 능력 부족, 이후 제어 생체 모방 체 외에서 모델에 대 한 필요가 있다.
먼 장기에 전이 하기 위해서는 암 세포 치료에 대 한 대상으로 지정할 수 있는 철새와 침략 phenotypic 특성 전시 한다. 그러나, 때문에 대부분의 시험관에 암 모델 고체 종양3의 실제 기능을 모방 하지 않는, 순수 관련 고기 감지 하 매우 도전 이다. 또한, 종양, 내 존재 하는 phenotypic이 지시 형 감독 요법, 예를 들어, 전이 시작 셀을 대상으로 검색 하려면 단일 요소 해상도 종양 마이그레이션 분석 필요 다른 유형의 종양4내의 인구입니다.
세포 운동 성 및 집단의 연구는 주로 균질 평면 표면에 상피 세포의 단층 문화에서 실시 됩니다. 암 세포 마이그레이션에 대 한 이러한 기존의 셀룰러 모델 막과 ECM의 구성 요소5를 통해 침입 하는 개별 셀의 인구 분석을 기반으로 하지만 이러한 시스템에서 개별 셀 사이의 본질적인 차이점 수 없습니다. 공부. 건설 기계를 통해 또는 비 계 없는 마이크로 구조에서 우수한 종양 연구 수단으로 간주 됩니다 생성 3D spheroids 세포 성장과 암 침공6,,78. 그러나, 가장 3D 시스템은 높은 처리량 형식에 적합 하 고 격리 된 개별 spheroids 각 마이크로 잘9에서 생성 되므로 간 회전 타원 체 상호 작용 달성 일반적으로 수 없습니다. 그러나 암 마이그레이션 관련 된 최근 연구는 미세 장치3,10,,1112에 근거 하,, 이러한 정교한 미세 도구 생산 하기 어려운 고 수 없습니다. 반 침략 적 약물의 (HTS)을 상영 하는 높은 처리량에 사용할 수 있습니다.
두 가지 주요 고기, 집단 및 개별 셀 마이그레이션, ECM 장벽을 극복 하는 종양 세포에서 역할을 하 고 주변 조직 침입 되어 시연된13,14, 각 고유 표시 형태학 특성, 생화학, 분자 및 유전적 메커니즘입니다. 또한, 두 가지 형태의 마이그레이션 종양 세포, 섬유 아 세포와 같은 및 amoeboid, 각 표현 형에서 관찰 된다. 둘 다, 이후 침공 고기 및 마이그레이션 모드, 주로 형태학 속성에 의해 정의 됩니다, 그리고 휴대에 대 한 필요 모델 그 사용 영상 기반 탐지와 종양 내 습 및 마이그레이션 모든 형태의 시험 세포.
현재 방법의 전반적인 목표는 종양 spheroids의 큰 인구에서 침략 용량 분석을 위한 간단 하 고 재현성 biomimetic 3D 체 외에서 세포 기반 시스템을 제공 하는입니다. 여기, 종양 침입과 반대로 전이성 치료의 연구에 대 한 HMCA 기반 6-잘 이미징 플레이트를 소개합니다. 기술은 균일 한 3D 종양 spheroids (우물 당 450) 히드로 마이크로-챔버 (MC) 구조에서 다 수의 형성 수 있습니다. 다양 한 ECM 구성 요소는 주변 환경에 셀의 침공 수 있도록 회전 타원 체 배열에 추가 됩니다. 침공 과정 같은 개별 spheroids/침입 세포의 단기 및 장기 관찰에 의해 지속적으로 모니터링 하 고 형태학 상 특성, 형광 얼룩이 지 고 언제 든 지 특정 spheroids의 검색을 용이 하 게. 수많은 spheroids 공유 공간과 매체, 개별 spheroids와 그들의 영향을 서로 사이 용 해 분자를 통해 상호 작용 가능 하다. 자동 이미지 분석은 많은 양의 데이터 빠르고 효율적 컬렉션을 가능 하 게 사내 MATLAB 코드를 사용 하 여 수행 됩니다. 플랫폼 안티 침공 마약의 중간 처리량 심사 허용 시간 효율적인 방식으로 수많은 spheroids/침입 셀의 정확한, 동시 측정을 쉽게 합니다.
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프로토콜
1. HMCA 플레이트 엠보싱
참고: 완전 한 프로세스 설계 및 제조입니다 (PDMS) 스탬프 및 HMCA 이미징 플레이트가이 프로토콜에 사용에 대 한 우리의 이전 기사15,16에 자세하게 설명 되어 있습니다. PDMS 스탬프 (부정적인 모양)는 잘 (그림 1A) 당 약 450 MCs를 이루어져 있는 HMCA (긍정적인 모양)을 돋을새김 하는 데 사용 됩니다. 그림 1B에서처럼 MCs의 마다 잘린된 거꾸로 사각형 모양의 피라미드의 모양 (높이: 190 µ m, 작은 기본 영역: 90 µ m x 90 µ m, 그리고 큰 기본 영역: 370 µ m x 370 µ m). HMCA 판 준비 및 3D 종양 spheroids의 배양과 그 후, 침공 분석 결과 대 한 사용 됩니다. 또는, 상업 스탬프 HMCA 생산 사용 될 수 있습니다.
- 6% 낮은 녹는 agarose (LMA)의 솔루션을 준비 합니다. LMA 분말 및 버퍼링 멸 균 인산 염 (PBS) PBS의 10 mL 당 LMA (0.6 g) 유리 병에는 자력으로 삽입 합니다. 난방 접시에 병을 배치 하 고 균일 한 솔루션 달성 될 때까지 몇 시간 동안 80 ° C에가 열 하는 동안 솔루션을 저 어. 70 ° C에서 솔루션을 계속 사용까지.
- 미리 70 ° c 오븐에서 PDMS 스탬프 열. 그것은 따뜻한까지 계속 사용. 또는 상업 스탬프 사용 하 고 지시를 따르십시오.
- 미리 75 ° c가 열 건조 목욕 상업 6 잘 유리 하단 플레이트 위에 접시는 완전히 따뜻한 때까지 몇 분 정도 기다립니다.
- 접시에 우물의 각자의 유리 하단에 미리가 열된 LMA (400 µ L) 한 방울을 붓는 다. 부드럽게 agarose 드롭 사전 온수 PDMS 스탬프 장소. 중 고 및 사전 냉각에 대 한 5-10 분 동안 실 온 (RT)에서 품 어. 전체 agarose 겔 화를 달성 하기 위해 20 분에 4 ° C에서 품 어. 그런 다음, 부드럽게 mcs 꽃무늬 agarose 젤 떠나 PDMS를 벗기십시오.
참고:이 단계는 동시에 모든 웰 스에서 수행 됩니다. - 자외선 (UV) 램프를 장착 하는 시스템을 치료 하는 빛에 양각된 접시를 놓고 3 분 동안 품 어.
참고: 지금 HMCA 플레이트는 UV 살 균입니다. - 되도록 그들은 습 한, 지켜진다 다음 접시 커버, parafilm 포장 사용까지 4 ° C에서 저장 살 균 PBS로 매크로 웰 스를 채우십시오.
- 사용 하기 전에 빈 HMCA 접시에서 PBS 오차. 생물 학적 후드에 배치.
2. 로드 셀 및 회전 타원 체 형성
- 다음과 같이 셀을 수집: 10 cm 문화 접시 셀 단층에서 모든 매체를 제거, 혈 청 오차의 처리, 트립 신 (37 ° C에 미리 예 열)의 5 mL을 추가 하 고 37 ° c.에 인큐베이터에서 3 분 동안 품 어에 PBS의 10 mL로 두 번 씻어 그런 다음 접시 단층 분리, 동종 세포 현 탁 액 달성 될 때까지 완전 한 매체 (37 ° C에 미리 예 열)와 여기저기 피 펫의 10 mL를 추가를 부드럽게 흔들어. 원심 신선한 매체의 15 mL로 세포 현 탁 액을 씻어 그리고, 신선한 완전 한 매체에 적절 한 농도에서 일시 중단.
- 부드럽게 로드 셀 서 스 펜 션 (50 µ L, 매체, 103 셀/mL x 150-360 ~ 16-40 MC 당 세포)는 HMCA의 위에 허용 15 분 동안 중력에 의해 침전 하는 세포.
- 부드럽게 외부 링과 히드로 배열 매크로 잘 플라스틱 바닥의 가장자리에 500 µ L 신선한 매체 (총 3-4 mL)의 6-8 aliquots를 추가 합니다.
- 72 h에 대 한 HeLa 세포와 spheroids의 대형을 위한 습도 분위기에서 37 ° C, 5% CO2, 48 h에 대 한 MCF7 세포를 품 어.
3. 생존 Propidium 요오드 화물 (PI) 얼룩에 의해 검출
- PI의 재고 솔루션을 준비 (500 µ g PI의 PBS의 1 mL 당). 4 ° C에서 약 6 개월 동안 그것을 유지. 갓 6 잘 HMCA 플레이트 (2 mL 잘 당)에 대 한 페 놀 레드, 없이 완전 한 매체의 12 mL 재고의 6 µ L의 추가 의해 1:2,000 (0.25 µ g/mL), 희석을 준비 합니다.
- 생물 학적 후드에 인큐베이터에서 48-72 h spheroids와 HMCA 접시를 전송 합니다. 팁 끝 히드로 배열 옆에 매크로 잘 플라스틱 바닥의 가장자리에 기대 여는 HMCA에서 모든 매체를 제거, 매체 가득한 배열 탱크를 떠나.
- 부드럽게 PI 희석의 2 mL 단계 3.1에서 각 잘 하 여 추가 매크로 잘 플라스틱 바닥의 가장자리에 팁 끝을 기대 합니다. 37 ° C, 5% CO2, 습도 분위기에서 1 h HMCA 접시를 품 어. 7 단계로 계속.
참고: 다른 염료 사용할 수 여기 뿐만 아니라, 예: 핵 얼룩에 Hoechst 얼룩, fluorescein diacetate (FDA) 라이브 셀 검출, apoptosis Annexin V에 대 한 미토 콘 드리 아 막 잠재력에 대 한 tetramethylrhodamine 메 틸 에스테 르 (TMRM) 탐지 그리고 다른 사람입니다.
4. 콜라겐 혼합물 준비
- 압력솥과 1m NaOH 필터 살 균 솔루션의 100 mL의 주식에 의해 살 균 두 배 증류수 (DDW)을 준비 합니다. RT, 그리고 사용까지-20 ° C에서 냉동 콜라겐 혼합 준비를 위해 사용 하는 팁에 있는 자료를 유지 한다.
- 사용 하기 전에 10-20 분 배치 등 모든 intergrades: 살 균 DDW, 1 M NaOH 살 균 솔루션, 메 마른 10 PBS, x 나 완전히 냉각 될 때까지 얼음 양동이에 쥐 꼬리 (3-개월 동안 4 ℃에서 저장)와 무 균 튜브에서 콜라겐을 입력. 생물 학적 후드 안에 얼음 양동이 놓습니다.
- 다음과 같이 6 잘 HMCA 침공 분석 결과 플레이트 (잘 당 300 µ L) 1800 µ L 3 mg/mL의 최종 농도에 콜라겐 혼합물의 준비. 다음 순서에 따라 냉각된 튜브에 intergrades를 추가: DDW, 1 M NaOH의 24.8 µ L와 10 x PBS의 180 µ L의 515 µ L. 얼음에 다시 소용돌이 및 장소에 의해 잘 믹스. 마지막으로, 혼합물, 다시 소용돌이에 콜라겐의 1080 µ L을 추가 하 고 다시 얼음에 넣어.
5. 하 고 콜라겐 혼합물 준비
- 2 ml의 멸 균 DDW HA의 10 mg을 디졸브. 품 어 RT에서 혼합 몇 분 및 소용돌이 부드럽게 가루 완전히 녹아 때까지. 최대 2 년 동안 4 ° C에서 재고 솔루션을 저장 합니다.
- 바로 사용 하기 전에 생물 후드 안에 얼음 양동이에 하 재고 솔루션을 놓습니다.
- 준비 3 mg/mL 콜라겐 혼합 4 단계에에서 설명 된 대로. 20 µ g/mL의 최종 농도 대 한 콜라겐 혼합물을 사용할 준비가의 1800 μ로 하의 36 µ g (7.2 µ L)를 추가 합니다. 다음, 다시 짧게 소용돌이 그리고 다시 얼음에 넣어.
6. ECM 혼합물 추가
- 생물 학적 후드에 인큐베이터에서 48-72 h spheroids와 HMCA 접시를 전송 하 고 얼음에 그것을 배치. 접시는 냉각 될 때까지 10 분 동안 품 어. 예약에 1%의 솔루션 열 물 욕조에 37 ° C에 LMA.
- 하이드로 겔 배열 옆에 매크로 잘 플라스틱 바닥의 가장자리에 팁 끝을 기대 하 여 HMCA, 주위에서 모든 매체를 제거 합니다. 다음, 매우 신중 하 게, 모든 매체에서에서 제거 배열 탱크 좋은 팁/젤 팁 끝 배열 가장자리, 부드럽게 그리고 천천히 빨 아 밖으로 모든 매체에 기대 여 팁, 로드 합니다.
참고: 히드로 배열 주위에서 모든 매체를 제거 후 배열 탱크 여전히 채워집니다 매체. 이 매체는 히드로 MC의 파괴와 spheroids의 전위를 방지 하기 위해 매우 부드럽게 제거할 수 있다. - 좋은 팁을 미리 냉동 하 고 콜라겐 혼합 (ECM 혼합물) 또는 콜라겐 혼합물의 150 µ L 고 배열 가장자리 끝을 연결 하 여 배열 탱크에 추가. 천천히 회전 타원 체 전위를 피하려고 혼합물을 놓습니다. 잘 당 총 300 µ L에 대 한 150 µ L의 다른 약 수와 함께이 단계를 반복 합니다. 모든 우물 가득 때까지 각 잘 동일한 절차를 따릅니다. 다음 ECM의 전체 겔 화에 대 한 1 시간을 위한 인큐베이터에 접시를 놓습니다.
- ECM의 완전 겔 화 달성 된 후에 미리 데워 진된 1%의 400 µ L 플라스틱 ECM 젤 위에 LMA. 커버는 뚜껑 접시, 접시 RT에 5-7 분 후 agarose 겔 화에 대 한 4 ° C에서 2 분 동안 품 어. 마지막으로, 부드럽게 매크로 잘 플라스틱 바닥의 가장자리에 팁 끝을 기대 하 여 완전 한 매체의 2 개 mL를 추가 합니다.
참고: agarose 레이어는 HMCA에서 콜라겐 젤 매트릭스의 분리를 방지합니다.
7. 침입 분석 결과 수집 및 분석
- 부하는 동력에 HMCA 플레이트 장착 인큐베이터, 37 ° C, 5% CO2 와 습도 분위기를 미리 조정 된 현미경 단계 반전.
- 미리 각 이미지 수집을 위한 위치 전체 배열 영역을 커버 하기 위하여 잘 하 고 10 배 또는 4 X 목표를 사용 하 여 결정 (이 단계는 여기에 사용 되는 이미지 수집 소프트웨어에 대 한 필요, 자세한 내용은 아래의 재료 표 참조). 또는 어떤 이미지 수집 소프트웨어를 사용 하 여 선택 하 여 전체 필요 면적의 자동 검색을 용이 하 게 하는 "Stich" 옵션.
- 취득 밝은 필드 (BF) 이미지 마다 2-4 h 총 24-72 h 동안 주변 ECM에 셀의 침공 회전 타원 체 몸에서 따라 하기.
- (여기 필터 530-550 nm, dichroic 거울 565 nm 긴 패스와 방출 필터 600-660 nm) 전용된 형광 큐브를 사용 하 여 PI 검출을 위한 형광 이미지를 취득 합니다.
- 이미지 수집 소프트웨어에서 시간 경과 BF/형광 이미지를 내보내고 전용된 폴더를 도구 모음 및 다음 "레코드 파일 내보내기" 버튼의 "데이터베이스" 탭을 사용 하 여 태그 이미지 파일 형식 (TIFF)에 저장.
참고: 우리는 침략에 분석 실행 될 수 있습니다 빠르고 쉽게 디자인 된 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI)를 포함 하는 MATLAB 소프트웨어에서 특별 한 사내 분석 코드를 개발 했다. 이 분석 코드에서는 spheroids 및 내 습 지역 세분화 반자동 형태학 연산자 침식과 팽창 뒤 소블 필터를 사용 하 여 이루어집니다. 자동 분할 영역의 후 정확도 높이기 위해 필요한 수동 수정 되었다. 분할 완료 후 매개 변수 집합이 자동으로 소프트웨어에 의해 계산 되었고 추가 조작에 대 한 excel 파일에 수출. 매개 변수 목록이: 시간에 기본 회전 타원 체 단면적 = 0, 회전 타원 체 몸에 연결 된 셀의 침공 지역 = 주요 내 습 지역, 지역, 주요 내 습 지역에서 분리 된 셀의 셀의 수의 평균 거리, 주요 내 습 지역에서 분리 주요 내 습 지역 및 분리 된 세포 집단 침공 거리 매개 변수의 둘레에는 기본 회전 타원 체의 질량 중심에서에서 침략 = d (d = √ (2 -1X) (X2 + (Y2 -Y1)2)의 밖으로 X와 Y 회전 타원 체의 질량 중심 좌표, 전에 (X1, Y1) 후 (X2, Y2) 집단 침공 과정). 또는, 이미지 분석은 다른 전문된 소프트웨어와 함께 할 수 있었다. - GUI를 열고 "BF 로드" 버튼을 밀어 합니다. 이미지를 연 후 분할 매개 변수를 조정 (최소 크기: > 1과 반경 닫습니다: > 1) 회전 타원 체 및 그것의 내 습의 정확한 세분화를 위해 다음, 실행에 대 한 "관심 (ROI) 세분화의 영역" 단추를 눌러 및 테두리는 각 회전 타원 체 주위에 표시 됩니다. 자동 분할 올바르지 않으면, "삭제" 또는 "추가" 버튼을 누르고 수동으로 요청한 수정. 다음 이미지에 대 한 동일한 단계를 반복 합니다.
- 번호는 spheroids "추적" 버튼 누르고 소프트웨어 시간 경과 이미지의 각 각 회전 타원 체에 대 한 동일한 번호를 할당 합니다. 그런 다음 모든 매개 변수와 함께 스프레드시트 생성 됩니다 "측정" 버튼을 누릅니다. 결과 처리에 사용 하 고 excel 소프트웨어에서 통계에 대 한 excel 파일로이 스프레드시트를 저장 합니다.
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결과
영상 판 독특한 HMCA 3D 종양 spheroids의 침공 분석 결과 대 한 사용 됩니다. 전체 분석 결과, 회전 타원 체 형성으로 시작 하 고 침공 과정과 추가 조작으로 끝나는 같은 접시에 내에서 수행 됩니다. 회전 타원 체 형성에 대 한 HeLa 세포 배열 분 지에 로드 되 고 중력에 의해 히드로 MCs에 정착. 하이드로 겔 부착/저 첨부 파일 특성 있는 MCs 세포 세포 상호 작용 및 3D 종양 spheroids의 형성을 촉진 한다. 그림 2A 에서는 150 x 103 셀/mL 로드 솔루션의 사용에 따라 MCs에 정착 하는 셀 (즉., MC 당 ~ 16 셀 값 계산). 그것은 분명 MC 당 셀 인 배열을, 균등 하 게 배포 되지 및 평균 취득된 통계 분포는 MC 당 14.78 ± 3.60 셀. 그림 2b에서 테이블 전체 H...
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토론
그것은 잘 문서화 살아있는 유기 체, 그들의 복잡 한 3D 다세포 조직이 특징으로하는 꽤 다른 일반적으로 사용 되 2 차원 단층 배양 세포, 더 나은 기능을 모방 하는 휴대 전화 모델을 사용 하는 중요 한 필요를 강조 그리고 마약에 대 한 생명체의 프로세스 심사. 최근, 다세포 spheroids, organotypic, organoids 문화와 장기 온 칩 도입된8 표준화 된 약물 발견에 사용 되었습니다. 그러나, 3D 다세포 모델의 위대한 복잡성 크게 그것의 견고성, 병렬화 및 분석 결과 효율성에 대 한 중요 한 데이터 분석을 위태롭게.
침공 용량의 정량적 인 평가 일반적으로 히드로 자료를 통해 세포의 움직임을 측정합니다. 전통적인 마이크로-잘 접시를 사용 하 여 종양 침입을 측정, 암 세포의 큰 숫자는 하단 플레이트 라운드에서 시드 고 강제로 원심21,
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공개 사항
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
감사의 글
이 작품은 쉐 시몬과 주 디스 Weisbrodt의 유 증에 의해 지원 됩니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 14mm 마이크로 웰 #1.5 커버 유리가 있는 6개의 마이크로 웰 유리 바닥 플레이트 | Cellvis | P06-14-1.5-N | HMCA 엠보싱에 사용되는 상업용 유리 바닥 플레이트, |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520100 | 6% 아가로스의 용액은 최대 80°C까지 예열됩니다. C 사용하기 전에 1 % 아가로 스 용액을 37 °C로 가열합니다. C |
| Trypsin EDTA 솔루션 B | 생물학 산업 | 03-052-1A | 37 °로 따뜻한; C 사용 전 |
| DMEM 매체, 고 포도당 | 생물 산업 | 01-055-1A | 37 °C로 따뜻한; C 사용 전 |
| 특수 신생아 송아지 혈청 (NBCS) | 생물학 산업 | 04-122-1A | 열 비활성화 |
| DPBS (10x), 칼슘 없음, 마그네슘 없음 | 생물학 산업 | 02-023-5A | 사용 전 얼음에 보관 |
| NaOH, 무수 | Sigma-Aldrich | S5881-500G | 1 M NaOH 용액 |
| Cultrex Type I 콜라겐 제조에 사용, 5 mg / mL | Trevigen | 3440-100-01 | 사용 전 얼음에 보관 |
| 히알루론산 나트륨 염 | Sigma-Aldrich | H5542-10MG | 사용 전 얼음에 보관 |
| 피세틴 | Sigma-Aldrich | F505-100MG | 배양 배지에 추가, 침입 억제제 |
| DETA/NO | Enzo Life Sciences | alx-430-014-m005 | 배양 배지에 추가, 산화질소 공여체 |
| PI | Sigma-Aldrich | P4170 | 세척할 필요 없이 매우 낮은 농도에서 사용 |
| 맥스 5000-EC UV 플러드 램프 라이트 쉴드 및 라이트 쉴드가 있는 전체 시스템 다이맥스 400W EC 전원 공급 장치 | 다이맥스 코퍼레이션 | PN 39823 | 에 의한 HMCA 플레이트 멸균에 사용 |
| Olympus | 자동 이미지 획득에 사용 | ||
| 용 인큐베이터 | Life Imaging Services | 이미지 획득을 통한 타임 랩스 실험에 필수, 37°도로 사전 조정됨; C, 5 % CO2< / sub> 및 가습 대기 유지 | |
| 서브 마이크론 전동 스테이지 타입 SCAN-IM | Marzhauser Wetzlar GmbH | 이미지 획득 영역을 미리 결정하는 데 사용, 자동 이미지 획득 | |
| 14 비트, ORCA II C4742-98 냉각 카메라 | Hamamatsu Photonics | 고감도, | |
| PI 감지용 형광 필터 큐브 | Chroma Technology Corporation | 필터 큐브 사양 : 여기 필터 530-550 nm, 이색성 거울 565 nm 장거리 통과 및 방출 필터 600-660 nm | |
| Olympus Cell^P 운영 소프트웨어 | 현미경, 전동 스테이지, 카메라 및 이미지 획득을 제어하는 데 사용되는 | Olympus | |
| Matlab R2014B 분석 소프트웨어 | Mathworks | 이미지 분석을 위한 사내 그래픽 사용자 인터페이스를 개발하는 데 사용됩니다 | |
| 소프트웨어 | Microsoft | 는 데이터 관리, 계산, 플롯 생성 및 통계에 사용됩니다 |
참고문헌
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