암 세포 침입과 반대로 전이성 마약 히드로 마이크로-챔버 배열 (HMCA)를 사용 하 여 심사 분석-플레이트를 기반으로

요약

HMCA 기반 이미징 접시 침공 분석 결과 성능을 위해 제공 됩니다. 이 접시는 spheroids 3 차원 (3D) 종양의 형성과 기질 (ECM)에 암 세포의 측정을 촉진 한다. 침공 분석 결과 정량화 자동 분석 함으로써 이루어집니다.

초록

암 전이 암 치의 90% 원인으로 알려져 있다. 전이 인접 조직으로 종양 세포의 침투/침공과는 다단계 프로세스입니다. 따라서, 침략 전이, 매우 중요 한 침공 과정 연구와 반대로 전이성 약물의 개발을 하는 중요 한 단계입니다. 이 수요를 해결 하기 위해 단단한 종양의 구조를 모방 하는 3 차원 생체 외에서 모델을 개발할 필요가 있다 그리고 vivo에서 상태 한 손으로, 하지만 동시에 가장 밀접 하 게 그들의 microenvironment 재현, 강력 하 고 적합 고수익 고 높은 콘텐츠 측정입니다. 현재, 대부분 침공 분석 적절 한 정교한 미세 기술을 의지할 연구 하지만 대량 약물 검사. 각 잘에서 격리 된 개별 spheroids와 플레이트 기반 장치를 사용 하 여 다른 분석 실험 자료 소모 고 조건 당 낮은 샘플 크기. 현재 프로토콜의 목표는 종양 spheroids의 큰 인구에서 침략 용량 분석을 위한 간단 하 고 재현성 biomimetic 3D 셀 기반 시스템을 제공 하는입니다. 우리는 종양 침입과 반대로 전이성 신약의 연구에 대 한 HMCA 이미징 플레이트에 따라 침입 분석 결과 대 한 3D 모델을 개발 했다. 이 장치는 지속적으로 하 고 동시에 관찰 하 고 측정 하는 매체에 대 한 단일 요소 해상도에서 spheroids 동안 ECM 구성 요소에 의해 포위 잘 (조건 당 높은 샘플 크기) 당 수많은 균일 한 spheroids의 생산 수 있습니다. 반대로 전이성 약물의 처리량 심사입니다. 이 플랫폼 여기 헬러와 MCF7 예증 단일 셀 및 집단의 침략에 대 한 spheroids의 생산에 의해 제공 됩니다. 우리는 헬러 spheroids 주위의 콜라겐의 침략 적 용량에 ECM 성분 히 알루 론 산 (HA)의 영향을 비교 합니다. 마지막으로, 우리 소개 Fisetin (침공 억제제) 헬러 spheroids 및 산화 질소 (NO) (침공 활성 제) MCF7 spheroids. 결과 다중 매개 변수 검사를 용이 하 게 하는 반자동, 간단 하 고 빠른 분석을 가능 하 게 사내 소프트웨어에 의해 분석 된다.

서론

암 사망은 먼 위치에 전이성 세포의 보급에 주로 기인 합니다. 암 치료에 많은 노력 대상 또는 전이성 식민지의 형성과 조직의 전이성 질환¹의 진행 방지에 초점. 암 세포 마이그레이션 종양 전이 과정에서 중요 한 단계 이다, 따라서, 암 침입 캐스케이드의 연구는 매우 중요 하 고 필수 안티 전이성 치료제를 찾는 데는.

전이성 질환 연구 도구로 동물 모델의 사용은 매우 비싼 고 하지 항상 인간의 종양의 대표적인 발견 되었습니다. 또한, 세포 외 microenvironment 토폴로지, 역학 및 구성 강하게 영향을 암 세포 행동². Vivo에서 모델은 본질적으로 분리 및 암 내 습 및 전이에 공헌 하는 같은 특정 매개 변수를 제어 하는 능력 부족, 이후 제어 생체 모방 체 외에서 모델에 대 한 필요가 있다.

먼 장기에 전이 하기 위해서는 암 세포 치료에 대 한 대상으로 지정할 수 있는 철새와 침략 phenotypic 특성 전시 한다. 그러나, 때문에 대부분의 시험관에 암 모델 고체 종양³의 실제 기능을 모방 하지 않는, 순수....

프로토콜

1. HMCA 플레이트 엠보싱

참고: 완전 한 프로세스 설계 및 제조입니다 (PDMS) 스탬프 및 HMCA 이미징 플레이트가이 프로토콜에 사용에 대 한 우리의 이전 기사^15,16에 자세하게 설명 되어 있습니다. PDMS 스탬프 (부정적인 모양)는 잘 (그림 1A) 당 약 450 MCs를 이루어져 있는 HMCA (긍정적인 모양)을 돋을새김 하는 데 사용 됩니다. 그림 1B에서처럼 MCs의 마다 잘린된 거꾸로 사각형 모양의 피라미드의 모양 (높이: 190 µ m, 작은 기본 영역: 90 µ m x 90 µ m, 그리고 큰 기본 영역: 370 µ m x 370 µ m). HMCA 판 준비 및 3D 종양 spheroids의 배양과 그 후, 침공 분석 결과 대 한 사용 됩니다. 또는, 상업 스탬프 HMCA 생산 사용 될 수 있습니다.

1. 6% 낮은 녹는 agarose (LMA)의 솔루션을 준비 합니다. LMA 분말 및 버퍼링 멸 균 인산 염 (PBS) PBS의 10 mL 당 LMA (0.6 g) 유리 병에는 자력으로 삽입 합니다....

결과

영상 판 독특한 HMCA 3D 종양 spheroids의 침공 분석 결과 대 한 사용 됩니다. 전체 분석 결과, 회전 타원 체 형성으로 시작 하 고 침공 과정과 추가 조작으로 끝나는 같은 접시에 내에서 수행 됩니다. 회전 타원 체 형성에 대 한 HeLa 세포 배열 분 지에 로드 되 고 중력에 의해 히드로 MCs에 정착. 하이드로 겔 부착/저 첨부 파일 특성 있는 MCs 세포 세포 상호 작용 및 3D 종양 spheroids의 형성을 촉진 한다. 그림 2A 에서는 150 x 10³ 셀/mL 로드 솔루션의 사용에 따라 MCs에 정착 하는 셀 (즉., MC 당 ~ 16 셀 값 계산). 그것은 분명 MC 당 셀 인 배열을, 균등 하 게 배포 되지 및 평균 취득된 통계 분포는 MC 당 14.78 ± 3.60 셀. 그림 2b에서 테이블 전체 H.......

토론

그것은 잘 문서화 살아있는 유기 체, 그들의 복잡 한 3D 다세포 조직이 특징으로하는 꽤 다른 일반적으로 사용 되 2 차원 단층 배양 세포, 더 나은 기능을 모방 하는 휴대 전화 모델을 사용 하는 중요 한 필요를 강조 그리고 마약에 대 한 생명체의 프로세스 심사. 최근, 다세포 spheroids, organotypic, organoids 문화와 장기 온 칩 도입된⁸ 표준화 된 약물 발견에 사용 되었습니다. 그러나, 3D 다세포 모델의 위대한 복잡성 크게 그것의 견고성, 병렬화 및 분석 결과 효율성에 대 한 중요 한 데이터 분석을 위태롭게.

침공 용량의 정량적 인 평가 일반적으로 히드로 자료를 통해 세포의 움직임을 측정합니다. 전통적인 마이크로-잘 접시를 사용 하 여 종양 침입을 측정, 암 세포의 큰 숫자는 하단 플레이트 라운드에서 시드 고 강제로 원심^21,

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
14mm 마이크로 웰 #1.5 커버 유리가 있는 6개의 마이크로 웰 유리 바닥 플레이트	Cellvis	P06-14-1.5-N	HMCA 엠보싱에 사용되는 상업용 유리 바닥 플레이트,
UltraPure Low Melting Point Agarose	Invitrogen	16520100	6% 아가로스의 용액은 최대 80°C까지 예열됩니다. C 사용하기 전에 1 % 아가로 스 용액을 37 °C로 가열합니다. C
Trypsin EDTA 솔루션 B	생물학 산업	03-052-1A	37 °로 따뜻한; C 사용 전
DMEM 매체, 고 포도당	생물 산업	01-055-1A	37 °C로 따뜻한; C 사용 전
특수 신생아 송아지 혈청 (NBCS)	생물학 산업	04-122-1A	열 비활성화
DPBS (10x), 칼슘 없음, 마그네슘 없음	생물학 산업	02-023-5A	사용 전 얼음에 보관
NaOH, 무수	Sigma-Aldrich	S5881-500G	1 M NaOH 용액
Cultrex Type I 콜라겐 제조에 사용, 5 mg / mL	Trevigen	3440-100-01	사용 전 얼음에 보관
히알루론산 나트륨 염	Sigma-Aldrich	H5542-10MG	사용 전 얼음에 보관
피세틴	Sigma-Aldrich	F505-100MG	배양 배지에 추가, 침입 억제제
DETA/NO	Enzo Life Sciences	alx-430-014-m005	배양 배지에 추가, 산화질소 공여체
PI	Sigma-Aldrich	P4170	세척할 필요 없이 매우 낮은 농도에서 사용
맥스 5000-EC UV 플러드 램프 라이트 쉴드 및 라이트 쉴드가 있는 전체 시스템 다이맥스 400W EC 전원 공급 장치	다이맥스 코퍼레이션	PN 39823	에 의한 HMCA 플레이트 멸균에 사용
	Olympus		자동 이미지 획득에 사용
용 인큐베이터	Life Imaging Services		이미지 획득을 통한 타임 랩스 실험에 필수, 37°도로 사전 조정됨; C, 5 % CO2< / sub> 및 가습 대기 유지
서브 마이크론 전동 스테이지 타입 SCAN-IM	Marzhauser Wetzlar GmbH		이미지 획득 영역을 미리 결정하는 데 사용, 자동 이미지 획득
14 비트, ORCA II C4742-98 냉각 카메라	Hamamatsu Photonics		고감도,
PI 감지용 형광 필터 큐브	Chroma Technology Corporation		필터 큐브 사양 : 여기 필터 530-550 nm, 이색성 거울 565 nm 장거리 통과 및 방출 필터 600-660 nm
Olympus Cell^P 운영 소프트웨어	현미경, 전동 스테이지, 카메라 및 이미지 획득을 제어하는 데 사용되는	Olympus
Matlab R2014B 분석 소프트웨어	Mathworks		이미지 분석을 위한 사내 그래픽 사용자 인터페이스를 개발하는 데 사용됩니다
소프트웨어	Microsoft		는 데이터 관리, 계산, 플롯 생성 및 통계에 사용됩니다

쥐 꼬리에서 다이 UV Inverted IX81 현미경현미경 이미징에 사용 소프트웨어. Excel .