지방 조직 유래 Stromal 혈관 분수 잠재적인 연골 재생을 위한 생산의 임상 프로토콜

요약

여기, 선물이 지방 조직 유래 stromal 혈관 분수와 인간의 골 관절염 환자에서 연골 같은 조직의 재생성 하 여 무릎 기능을 개선 하는 응용 프로그램을 생성 하는 프로토콜.

초록

관절염 (OA) 가장 일반적인 쇠 약 질환 중 하나입니다. 최근, 중간 엽 줄기 세포 (MSCs)의 다른 형태를 사용 하 여 무릎의 기능을 개선 하기 위해 수많은 시도 되었습니다. 한국, 골 집중, 코드 혈액에서 파생 된 줄기 세포 연골 재생을 위한 한국 식품 의약품 안전 청 (식약청)에 의해 승인 되었습니다. 또한, 한 지방 조직 유래 stromal 혈관 분수 (SVF) 인간 환자에서 관절 주사에 대 한 식약청에 의해 허용 되었습니다. 자가 지방 조직에서 파생 된 SVF 중간 엽 줄기 세포 외 기질 (ECM)를 포함합니다. ECM 배설 히 알루 론 산 (HA) 및 혈소판이 풍부한 혈장 (PRP) 염화 칼슘에 의해 활성화 MSCs 재생성 연골 및 무릎 기능을 개선에 도움이 될 수 있는 다양 한 cytokines. 이 문서에서는, 우리는 OA 인간 환자에서 연골 같은 조직의 재생성 하 여 무릎 기능을 개선 하는 프로토콜을 제시. 프로토콜의 결과 뒤에 몇 가지 추가적인 간행물 2011 년에 처음 보고 되었다. 프로토콜 콜라 섞인 헌 lipoaspirates를 지방 흡입을 포함 한다. 이 lipoaspirates 콜라 혼합물 다음 잘라내어 동안 주사 바늘을 방해할 수 있습니다 큰 섬유 조직을 제거 하는 무 균. 나중에, 혼합물 지방 조직에서 파생 된 SVF를 incubated. 포함 하는 지방 조직에서 파생 된 MSCs와 ECM의 나머지 결과 지방이 많은 직물에서 파생 된 SVF HA와 함께 환자의 무릎에 주입 하 고 염화 칼슘 PRP를 활성화. 무릎 통증, 붓기, 그리고 유리 모양의 연골 같은 조직의 MRI 증거 함께 모션의 범위에 따른 우리의 프로토콜으로 치료 했다 환자의 세 가지 경우는 있습니다.

서론

중간 엽 줄기 세포 (MSCs) 연골^1,2,,34,,56을 다시 생성 하는 기능으로 알려져 있습니다. 그들은 쉽게 다양 한 소스에서 얻어질 수 있다: 골 수, 제대혈, 및 많은 다른 사람의 사이에서 지방 조직. 이러한 소스 중 지방 조직 임상 설정^7,8에 연골을 다시 생성 하려면 어떤 문화 확장 없이 MSCs의 충분 한 수를 구할 수 있는 유일한 소스 이다. 자가 골 수 기질 혈관 분수 (SVF) 얻어질 수 있다 쉽게 뿐만 아니라. 그러나, 줄기 세포 문화 비 확장 된 골 수에 포함 된 수는 매우 낮은^7,8. 코드 혈액은 MSCs의 충분 한 번호를 포함할 수 있습니다. 그러나, 탯 줄 혈액 헌 SVF의 쉽게 사용할 수 있는 소스 되지 않습니다.

SVF를 처리 지방 조직의 수많은 방법 임상 응용 프로그램에 대 한 사용할 수 있습니다. 이러한 가운데, 콜라를 사용 하 여 지방 조직에서 MSCs를 얻기의 방법 개발 및 Zuk 외 에 의해 확인 ^{5 , 6}, 잘 허용 됩니다. 콜라를 사용 하는이 방법은 정형 외과에 임상 응용 프로그램에 대 한 수정 되었습니다. 임상 설정으로 적용 하기 위해서는 시스템 편의 유지 하면서는 불 임을 유지 하기 위해 폐쇄 시스템 이어야 합니다. 이 문서에서 제공 하는 하나의 특정 수정은 lipoaspirates의 균질 화를 포함 한다. 작은 크기의 lipoaspirates는 분해의 결과에 고르지 못한 지방이 많은 직물의 큰 것 들 보다는 상대적으로 빨리 소화 된다. 또한, 이러한 큰 크기 lipoaspirates 관절 주사^9,10를 수행 하는 동안 주사기와 바늘을 방해할 수 있는 섬유 조직을 생성할 수 있습니다. 이러한 문제를 방지 하기 위하여는 lipoaspirates 자르고 콜라와 부 화 하기 전에 lipoaspirates를 닦지 무 균 수 있습니다. 결과 지방이 많은 직물에서 파생 된 SVF 더 균일 한 세포 외 기질 (ECM) 무 균된¹¹하지 않은 lipoaspirates에 비해 포함할 수 있습니다. Broken-down ECM에 있는 SVF 포함 된 비 계¹²으로 작동 수 있습니다.

2009 년, 자가 지방 조직에서 파생 된 SVF 한국 식품 의약품 안전 청 (식약청) 의사¹³에서 최소한의 처리와 의료 시설 내에서 처리 될 때에 의해 허용 되었습니다. 나중에, 자가 지방 조직에서 파생 된 SVF은 잠재적으로 재생성 연골 같은 조직의^10,,1415 에 의해 관절염 (OA) 환자의 무릎 기능을 개선 하기 위해 잠재적인 대리인으로 이용 되어 ^{, 16 , 17 , 18} .

2011 년 박 보였다 처음으로 지방 조직 유래 줄기 세포 (ASCs) 지방이 많은 직물에서 파생 된 SVF에 포함 된 잠재적으로 인간의 OA 환자 혈소판이 풍부한 주사 때에 연골 같은 조직의 재생성 무릎 기능을 향상 시킬 수 있습니다. 플라즈마 (PRP) ¹⁴. 또한, 박 외. 2013 관련 91 환자에서 안전 데이터를 보고 있다. 말은 효능이 안전 데이터에 보고 이었다 67¹⁵. 그 후, 박 외. 추가 연구는 초승달 모양의 눈물과 chondromalacia patellae^{10,16,17 가진 환자에서 연골 같은 조직 재생 때문에 잠재적으로 향상 된 무릎 기능 보였다 ,18}. 기사 보고에 따라, 그것은이 문서에서 제공 하는 프로토콜에 의해 처리 하는 지방 조직의 100 g에 포함 된 줄기 세포의 수에 따라 환자의 특성^8, 1000000 40,000,000에서 범위 수 있습니다 알려져 있다 ^{19 , 20 , 21 , 22 , 23}.

여기, 우리는 하와 염화 칼슘을 활성화 하는 PRP 자가 지방 조직에서 파생 된 SVF를 사용 하 여 인간 무릎 OA의 임상 프로토콜을 제시. 이 임상 프로토콜, 불 임, 유지 하기 위해 폐쇄, 수동 시스템을 포함의 첫 번째 버전 2011¹⁴에 보고 되었다. 동일한 프로토콜 최적화 되었다, 불 임, 유지 하 고 2013 2016^10,15에서 보고 했다. 여기, 최적화 된 프로토콜 제공 됩니다. 프로토콜의 개요 개요는 그림 1에 표시 됩니다.

그림 1: 프로토콜의 도식 개요. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

프로토콜

승인 및 동의 사건 보고서를 다음 보고서를 명 지 대학 기관 검토 위원회 위원회 (MJUIRB)에 의해 기권 했다. 또한,이 임상 프로토콜 식약청의 헬싱키의 선언 및 규제 지침을 준수 했다. 절차에 대 한 통지 해준 동의 환자 로부터 얻은 했다.

1입니다. 지방 흡입

참고: 무 균 기법으로 수행 합니다.

1. 다음 포함 조건 사용: 3 단계의 (1) MRI 증거 OA; (2) 남성 또는 여성; (3) 18 세 이상; (4) 충분 한 (100-110 g) 지방이 많은 직물 지방 흡입;에 대 한 (5) 외 과적 수술;과 진행 방식 (6) 보수 관리;의 실패 그리고 (7) 지속적인 비활성화 통증입니다.
2. 다음 제외 기준을 사용 하 여: (1) 활성 염증 또는 결합 조직 질병 통증 상태 (즉,루 푸 스, 류 마티스 관절염, fibromyalgia); 영향을 생각 (2) 활성 내 분 비 장애 통증 상태 (즉, 저하 증, 당뇨병);에 영향을 줄 수 있는 (3) 활성 신경 장애 통증 상태 (즉, 주변 신경 병, 다 발성 경화 증);에 영향을 줄 수 있는 (4) 활성 폐 질환 필요한 약물 사용; (5) 호르몬 관절 주사 지난 3 개월의 역사.
3. 생물 학적 클래스 A 후드와 함께 수술 실에 환자를 가져오고 그 (또는 그녀) 부정사 위치에 배치.
4. 5 %betadine (povidone-요오드)와 환자의 복 부 영역을 청소 하 고 복 부 지방 흡입에 대 한 청소 영역을 노출 무 균 기술을 사용 하 여 환자를 드러 워 진.
5. Infero-옆으로 배꼽에서 약 5 cm 절 개 투-수-만든 (25 게이지, 1½ 인치) 바늘 5 mL 주사기에 피 네 프 린 없이 2 %lidocaine 2 개 mL를 사용 하 여 두 사이트 (왼쪽에는 배꼽의 오른쪽에 다른 하나) anesthetize 표 피 수준에서 각 사이트 주입 하 여
6. 투-수-사용 하 여 만든 tumescent 솔루션 (2 %lidocaine, 0.5 %bupivacaine, 1:1000 피 네 프 린의 0.5 mL의 20 mL의 정상적인 염 분, 40 mL 500 mL)의 5 mL 10 mL 주사기에서 바늘 (25 게이지, 1½ 인치) 절 개의 사이트 anesthetize
7. 피하 레벨의 깊이를 피부를 곤란 하 게 하 여 옆으로 배꼽 아래 0.5 cm 대략 5 cm의 2 절 개를 확인 합니다.
8. 11 호 블레이드를 사용 하 여 제기 피부 피하 수준까지 침투를 하지만 복 벽을 통해 관통 구멍.
9. 20 cm 16 게이지 cannula를 사용 하 여 anesthetize tumescent 솔루션의 700 ~ 800 mL 투 수 liposuctioned는 전체 더 낮은 복 부 지역 피하 수준.
10. 후에 연결 하는 3.0 m m 정을 연결 하 여 지방 흡입 기구를 준비 tumescent 솔루션 전체 더 낮은 복 부의 침투를 마무리 60 mL (30 mL) 수동 지방 흡입 또는 특별히 고안 된 3.0 m m 정에 연결에 대 한 주사기를 원심 분리기 키트, 불 임, 유지 하기 위해 폐쇄 시스템 주사기에 진공 기계 진공 기반 지방 흡입에 대 한 연결.
11. 지방 흡입 지방 조직의 tumescent 솔루션을 제외 하 고 100-110 g를 수행 합니다. 지방 흡입을 수행할 때 지방 조직 분리 하 고 제거 해야 tumescent 솔루션과 함께 가져옵니다.
12. Tumescent 솔루션, 별도로 먼저 중력, 60 mL 주사기를 원심 분리기 키트에 지방 조직 전송 및 장소 (즉, 주사기의 부분은 하단에) 아래로 주사기. 5-6 분을 대기, 지방 조직 및 tumescent 액체 구분 됩니다. 주사기 플런저의 상단 부분에 눌러 주사기의 바닥에서 액체를 제거 합니다.
13. 100-110 g 무릎 당 지방 조직 (lipoaspirates)의 총 축적 되었습니다 때까지 1.9-1.11 위의 단계를 수행 합니다.

2. 살 균 닫힌 시스템 ASC/ECM 혼합물의 준비

1. 분리 후 중력 및 각 60 mL 원심 분리기 키트, 살 균 닫힌된 시스템 당 lipoaspirates의 50-55 g 축적 tumescent 솔루션 배치 원심 분리기 컨테이너 양동이와 1600 x g 5 분, 응축에서 스핀 2 원심 분리기 키트는 lipoaspirates 고 지방 조직에서 액체를 분리입니다. 이 추가의 과정 응축, lipoaspirates는 특정 경우에 지방 기름 생성 될 수 있습니다.
2. 동요, 안전 모자와 원심 분리기 키트의 하단에 플러그를 제거 주의 되 고.
3. 눌러서 천천히 아래로 원심 분리기 키트의 플런저 상단 하단 액체를 제거 합니다.
4. 별도 60 mL 주사기에 정상적인 염 분의 50 mL와 콜라 (콜라 결합 조직²⁴ 에 대 한 특정의 5 밀리 그램) 및 지방 조직²⁵에 대 한 특정 콜라의 5 mg의 10 mg을 디졸브.
5. 원심 분리기 키트를 사용 하 여 60 mL 주사기를 연결 하 여 압축 된 lipoaspirate의 약 25-30 mL 녹은 콜라 (콜라 결합 조직에 대 한 특정의 5 밀리 그램) 및 지방 조직에 대 한 특정 콜라의 5 mg의 1:1 (v: v)의 비율로 혼합 특수 커넥터입니다.
6. 60 mL 주사기와 원심 분리기 키트 막대 또는 미는 사람을 사용 하 여 콘텐츠를 추진 하 여 압축 된 lipoaspirate와는 콜라로 믹스 철저 하 게.
7. 60 mL 주사기를 다시는 lipoaspirate와는 콜라의 혼합물을 전송 합니다.
8. 블레이드를 포함 하는 조직 균질 화기와 혼합물을 포함 하는 각 60 mL 주사기를 연결 합니다.
9. 빈 60 mL 주사기는 균질 화기의 다른 쪽 끝을 연결 합니다.
10. 4-6 시간에는 균질 화기를 통해 다른 60 mL 주사기 혼합물 밀어 절단 하 고는 lipoaspirate의 닦지.
11. 무 균된 lipoaspirate과 콜라 혼합 60 mL 원심 분리기 키트 전문된 커넥터를 통해 다시 전송
12. 원심 분리기 키트 미리 37 ° c.에가 열 된 인큐베이터에 배치 하는 컨테이너에 배치
13. 45 rpm에 회전 하는 동안 40 분 동안 37 ° C에서 무 균 혼합 두 개의 원심 분리기 키트를 품 어.
14. 외피의 40 분 후 살 균 방식에서 인큐베이터에서 컨테이너를 제거 합니다. 그런 다음, 원심 분리기 키트를 제거 하 고 원심 분리기 기계에 넣어.
15. 지방 조직 유래 SVF 분리 5 분 800 x g 에서 혼합물 원심
16. 원심 분리기, 후 (이 콜라를 포함 하 고 지방 조직 소화) 상쾌한에서에서 제거 각 원심 분리기 키트 플런저 위에 주사기 모자를 제거 하 고 주사기 잠금을 통해 여 플런저에 30 mL 주사기를 배치 하 여 연결입니다.
17. 천천히 30 mL 주사기로 채우기 위해 상쾌한에 대 한 30 mL 주사기의 배럴 부분을 누르십시오.
18. 지방 조직 유래 SVF의 마지막 3-4 mL를 떠나 원심 분리기 키트의 아래쪽의 마지막 3-4 mL까지 30 mL 주사기 배럴 아래로 누릅니다. 상쾌한 삭제 됩니다.
19. 플런저의 위에서 30 mL 주사기를 제거 하 고 lactated 벨의 솔루션 (D5LR)에 5% 포도 당 주사기를 채우십시오.
20. 채우기 원심 분리기 키트, D5LR와 함께 지방 조직에서 파생 된 SVF의 3-4 mL를 포함 하 여 플런저 상단 D5LR 가득 30 mL 주사기를 연결 하 여 최대 55 mL.
21. 30 mL 주사기를 제거 하 고 플런저, 모자 원심 분리기 키트 4 분의 300 x g 에서 다시.
22. 4 빨 래의 총 단계 2.17-2.21를 반복 합니다. 사용된 콜라 xenogenic입니다. 따라서, 대부분 콜라 4 빨 래에 의해 제거 됩니다. 그러나, FDA 승인에 대 한 프로토콜의 미세 조정 해야 할 수 있습니다 완전히 최종 볼륨에 콜라 잔류물을 제거 콜라 잔류물의 현재 금액이 없는 어떤 임상 환자에 대 한 충분히 무시할 수 있지만 부작용입니다.
23. 4^번째 원심 분리 후 주입에 대 한 최종 SVF를 얻으려면 제거 안전 모자와 원심 분리기 키트의 하단 오프닝에 플러그 없이 떨고 하거나 원심 분리기 키트.
24. 특별히 디자인 된 커넥터를 사용 하 여 열고 원심 분리기 키트 하단에 20 mL 주사기를 연결 합니다.
25. 원심 분리기 키트의 하단에 정착 하는 셀을 흔들어 앞뒤로 여러 번 주사기의 플런저를 당겨.
26. 다른 세포 및 조직 ASCs와 ECM을 포함 된 SVF의 원하는 총 볼륨 제거 (보통 각 원심 분리기 킷 무릎 관절 주사에서에서 약 3-4 mL).

3. PRP 준비 살 균 기술

1. ASCs 및 ECM을 준비 하는 동안 항 응 혈 약 시트르산 포도 당 솔루션의 2.5 mL와 헌 혈액의 30 mL를 그립니다.
2. 60 mL 원심 분리기 키트에 그려진된 혈액을 전송 합니다.
3. 730 x g 5 분에 그려진된 혈액을 원심 하 고 새로운 60 mL 원심 분리기 키트에는 상쾌한을 제거 합니다. 4 분, PRP의 3-4 mL의 결과 1300 x g 에서 상쾌한 원심
4. 10: 2의 비율로 3% (w/v) 염화 칼슘을 추가 주사, 앞 (PRP: 염화 칼슘, v: v) 그것을 활성화 하기 위해 PRP를.
5. 염화 칼슘 활성화 하는 PRP를 0.5% (w/v)를 발판으로 하를 추가 합니다. ECM, PRP, 함께 함께 이러한 ASCs 칼슘 염화 물에 의해 활성화 하 고 하 서 ASC/ECM 혼합물에 대 한.

4. ASC/ECM 혼합물에 기초를 둔 치료

1. 5 %betadine 환자의 무릎을 청소 하 고 살 균 방식으로 드러 워 진.
2. 만져 tibial와 대 퇴 뼈 사이 공동 공간에 대 한 무릎의 앞쪽.
3. 공동 캡슐 외부 그냥 피부에서 피상적으로 희석된 lidocaine (정상적인 염 분의 4 mL에 희석 1 %lidocaine 1 mL)으로 사출 사이트 anesthetize.
4. 희석된 ropivacaine (1 mL 0.75 %ropivacaine 정상적인 염 분 3 mL로 희석)와 공동 캡슐의 내부 anesthetize
5. HA의 믹스 2 mL 주사기 주사기 커넥터를 통해 20 mL 주사기에 포함 된 SVF의 6-8 ml
6. 주사기 주사기 커넥터를 사용 하 여 헌 이미 준비 된 PRP와 5 mL 주사기에 준비 되 고 3-4 mL를 염화 칼슘 0.4 mL를 추가 합니다.
7. 3.5-4.5 mL 5 mL 주사기에 PRP/칼슘 염화 물의 8-10 mL 주사기 주사기 커넥터를 통해 20 mL 주사기에 HA/SVF 혼합물의 결합.
8. 즉시 혼합물 (약 12-15 mL)를 천천히 주사 또는 초음파 지도 없이 38 m m 18 게이지 바늘을 사용 하 여 무릎의 앞쪽 tibio-대 퇴 관절에.
9. 주입 후 접는 거 즈 4 x 4 면 4 번 고 접힌된 4 x 4 거 즈 위에 테이프를 배치 하 여 압력 사출 사이트 붕대.
10. 60 분 셀 첨부 파일에 대 한 허용 여전히 남아 환자를 지시 합니다.
11. 지시 하는 활동을 제한 하는 환자는 병원에서 퇴원 후 1 주 최소.
12. 3 주 이상 칼슘 염화 물에 의해 활성화 하는 PRP의 3 개의 추가 주사 클리닉에 반환 합니다.

5. 치료 후 후속

1. 시각 아날로그 척도 (VAS) 측면 통증 개선 및 물리 치료 매개 변수에서 기능 향상에 대 한 2, 4, 16 18 (22)의 주에 환자를 평가 합니다. 앞에서 설명한^26,27기능 평가 지 수 (금), VAS, 및 모션 (ROM)의 범위를 결정 합니다.
2. 치료 후 MRI 3 개월 치료 후 환자를 따라 합니다.

결과

3 환자 (87 세 여성을 무대 3 OA, 한 68 세 남성 하나 3 OA, 무대와 함께 한 60 세 여성 무대 3 OA) 가능성에 대 한 어떤 중요 한 과거 의료 기록을 영구 무릎 통증으로 병원에 제시 하 고 원하는 없이 자가 지방 조직에서 파생 된 SVF 치료. 모든 3 명의 환자 정형 외과 의사에 의해 검사를 그들의 무릎을 했다 총 무릎 보충 (TKR)을 제공 했다 하 고는 수술을 꺼 려 했다. 절차, 이전 모든 세 환자 장기 개선 없이 스테로이드와 HA의 여러 주사를 받았습니다 했다.

87 세 한국 여성 환자, 심한 통증의 불평, 시험의 때에 (8;의 VAS 점수 그림 2A) 나머지에 있는 동안. 그녀는 고통을 증가 설명 ([금: 37; 그림 2A) ...

토론

2001 년에, Zuk 외. 콜라⁶콜라겐 매트릭스를 파괴 함으로써 지방 조직에서 분리 된 줄기 세포. 나중에, 그룹이 보여주었다 지방 조직에서 분리 된 줄기 세포 연골 및 mesoderm 원점에서의 다른 조직으로 변환 수 증명 하는이 줄기 세포에에서 엽 했다.

마찬가지로,이 문서에 제공 된 절차 인간 환자에 게 비슷한 메서드를 적용 하는 수정 된 프로토콜입니다. 프로토콜의 주요 수정 및 절차 수행의 용이성을 유지 하면서 공기 접촉을 최소화 하기 위하여는 lipoaspirates 처리에 닫힌된 시스템 주사기의 설립 이다. 이러한 닫힌된 시스템 주사기를 사용 하 여, 지방이 많은 직물 지방 흡입을 통해 얻은. 다음, 닫힌된 시스템 주사기 내 콜라는 lipoaspirates 혼합 했다. 나중에, 콜라는 닫힌된 시스템 주사기 내 콜라 농도 diluting 하 여 혼합물에서 제거 되었습니다. 최종 결과 과정의 쉽게...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
<강력한>소재
5% 베타딘 (포비돈-요오드)	공급자:Firson Co., Ltd.
2% 리도카인	대한제약(주)
Tumescent 솔루션	(주)명문제약	N01BB01	용액은 500mL 생리식염수, 40mL 2% 리도카인, 20mL 0.5% 마르카인, 0.5mL 에피네프린 1:1000으로 구성하였다.
리바아제 TL 및 TM 연구 등급	Roche 응용 과학	5401020001
D5LR	Dahan Pharm. 주식회사	645101072	젖산 Ringer의 용액에 포도당 5 %
항응고제 구연산염 포도당 용액	펜왈, Inc.	NDC : 0942-0641	용액은 0.8 % 구연산, 0.22 % 구연산 나트륨 및 0.223 % 포도당으로 구성되었다.
3%(w/v) 염화칼슘	충웨이제약(주
0.5% (w/v) HA (히알루론산)	Dongkwang pharm. Co., Ltd.
0.25% Ropivacaine	Huons Co., Ltd. (주)	670600150
Equipment
3.0 mm 캐뉼라	(주)우주의료기기
60mL Luer-Lock 주사기	BD (Becton Dickinson)
원심분리기 배럴 키트	공급자:CPL Co., Ltd.	30-0827044
블레이드를 함유한 조직 균질화기	(주)씨피엘	30-0827045
회전배양기 믹서	(주)메디칸	MS02060092
원심분리기	한일과학(주)	CE1133
자기 공명 영상	필립스 의료 시스템 Inc.	18068
초음파 검사	삼성 메디슨 (주	) CT-LK-V10-ICM-09.05.2007