성인 표 피를 통해 초파리 다리 모터 신경 축 삭을 시각화

요약

여기는 고정, 설치, 영상, 및 후 이미징 단계 초파리 의 성인 다리에 형광 단백질 axonal 대상으로 시각화 하는 프로토콜에 설명 합니다.

초록

대부분 신경 사양에 대 한 작업의 유전자와 순수 세공 모델 C에서 실시 되었습니다. 선 충, 초파리 애벌레 및 물고기, 모든 운동의 그들의 기본 모드 (예: 크롤링 또는 수영) undulatory 운동에 참여. 그러나, 보다 정교한 개별 모터 신경 (미네소타) 규격의 이해-이상 질병 치료를 알리는 측면에서-더 나은 모델의 복잡 한 돌출부 기반 운동 체계는 동등 하 게 세공 시스템 요구 척추 동물입니다. 걸어 담당 성인 초파리 운전 시스템 모두 충족 이러한 기준의 쉽게, 이후이 모델에서 쉽게 고유 다리 MNs (다리 당 약 50 MNs) 작은 수의 규격을 연구 수 둘 다 광대 한 사용 강력한 유전자 도구, 및 돌출부 기반 운동 체계의 생리 적 맥락에서 배열입니다. 여기 우리는 성인 비행에 다리 근육 신경 분포를 시각화 하는 프로토콜을 설명 합니다.

서론

척 추가 있는 사지 처럼 초파리 성인 다리 세그먼트로 구성 됩니다. 각 비행 다리는 각각의 구성 하는 여러 근육 섬유^1,214 근육을 포함 되어 있습니다. 성인 다리 MNs의 셀 시체 (prothoracic) T1, t 2 (mesothoracic), 및 복 부 신경 코드 (VNC), 척추 척수 (그림 1)에 유사한 구조의 각 측에 T3 (metathoracic) 중추에 있습니다. 어떤 대상 근육은 동측 다리 (고관절, trochanter, 대 퇴 골, 경골)의 4 개의 세그먼트에서 (그림 1)³각 중추에 약 50 MNs가 있다. 중요 한 것은, 각 개별 성인 다리 미네소타 동물^3,4사이 진부 매우 독특한 형태학 상 id를 있다. 이러한 독특한 MNs 라는 neuroblasts (NBs) 다리 MNs 애벌레 단계^3,4....

프로토콜

1. 다리 절 개 및 고정

1. 유리 다 잘 접시와 채우기 적절 한 수의 70% 에탄올과 웰 스 가져가 라. 추가 15-20 공동₂-각 (중 섹스의 모든 나이) 마 취 파리 잘와 브러쉬를 사용 하 여 부드럽게 소량 에탄올 솔루션으로 파리 파리 완전히 잠긴 때까지.
   참고:이 단계는 표 피의 hydrophobicity를 제거 하는. 이 자동-형광 표 피의 증가 하기 때문에 1 분 이상 씻지 않는.
2. 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) x 1에서 3 번 0.3% 비 계면 활성 제 세제 솔루션으로 파리를 헹 구 십시오. 적어도 10 분 동안이 솔루션에 파리를 유지.
   참고: 때 다리 안쪽 정착 액의 침투를 증가 하는 세제를 포함 하 여 다리 고정 잘 됩니다.
3. 4 %paraformaldehyde (PFA) 튜브 함께 얼음에 다 잘 접시를 놓습니다.
   참고: 신선한 4%의 준비는 16 %PFA 에탄올 무료 재고 솔루션에서 PFA이 중요 합니다.
4. 집게를 사용 하 여 머리와 파리의 복 부 흉부 세그먼트 또는 다리를 손상 없이 제거 하.
   참고: 비행 하 고 다리 부를 쉽게 제거 하는 복 부.
5. 집게와 흉부 세그먼트에서 다리를 해 부하 고 4%를 포함 하는 우물에서 다리 PFA. 이 위해, 다리 ....

결과

그림 4에서 같이,이 절차 그들의 터미널 버는 함께 성인 초파리 다리 GFP 표시 된 축 삭의 우수한 영상이 있습니다. 중요 한 것은 깨끗 한 GFP 신호 다리 표 피에 의해 방출 하는 형광에서 어떤 오염 없이 얻은 것입니다. 표 피에서 신호는 GFP 신호 식별 (그림 4E, 그림 1및 비디오 1) 다리에 축 삭의 위치를 다음 결합 수 있습니다. 비판적으로, 잘 고정 다리를 얻기 위해 중요 하다. 그림 5 는 잘 고정 (그림 5A)와 심하게 고정 다리 (그림 5B)의 예를 보여줍니다. 경우에서 다리 안쪽 내부 구조는 균일 한 색상의 고이 .......

토론

표 피 성인 초파리와 다른 절지동물의 많은 어두운 안료를 포함 하는 그들의 신체 내부 구조를 보기 위한 중요 한 장애 이다. 또한, 그것은 강력 하 게 고정 하 여 악화 시킨 자동 형광입니다. 이 두 기능은 매우 형광 염료 또는 외 골격을 가진 동물의 체 내 분자의 관찰에 대 한 문제가 있다.

우리가 설명 하 고 우리가 일상적으로 실험실에서 사용 하는 절차는 축 삭 궤도의 고 성인 초파리 다리에 그들의 터미널 엔딩의 깨끗 하 고 상세한 이미지를 생성 합니다. 중요 한 것은 깨끗 한 GFP 신호 다리 표 피에 의해 방출 하는 형광에서 어떤 오염 없이 얻은 것입니다. 이 기능은 시각화 및 3D 이미징 프로그램을 사용 하 여 축 삭 아 버의 3 차원 기능을 quantitate 수 필수입니다. 이 방법으로 여러 다리에서 얻은 데이터를 비교할 수 있습니다. 절차 쉽게 다른 형광 단백질에서 신호를 관찰에 대 한 적응 하 고 다른 성인 절지동물 축 삭 이미지를 쉽게 사용할 수.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
에탄올 앱솔루트	Fisher	E/6550DF/17	앱솔루트 분석 시약 등급
비이온 계면활성제 세제	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100, 분자생물학용
미세 집게	Sigma-Aldrich	F6521	Jewelers 겸자, Dumont No. 5
유리 멀티 웰 플레이트	전자 현미경 과학	71563-01	9 캐비티 파이렉스, 100mm x 85mm
PFA	Thermofisher	28908	Pierc 16% 포름알데히드(w/v), 메탄올이 없는
글리세롤	Fisher BioReagents	BP 229-1	글리세롤(분자 생물학)
스페이서	Sun Jin Lab Co	IS006	iSpacer, 4개의 웰, 약 12 μ L 웰 당 작업 볼륨, 직경 7mm, 깊이 0.18mm
정사각형 22mm x 22mm 커버 슬립	Fisher Scientific	FIS#12-541-B	No.1.5-0.16 - 0.19mm 두께
장착 매체	Vector Laboratories	H-1000	Vectashield 안티페이드 장착 매체
컨포칼 현미경	Carl Zeiss		LSM780; 용도 사용 LD LCI Plan-Apochromat 25X/0.8 Imm Korr DIC M27 (oil/ silicon/glycerol/water immersion) (420852-9871-000)
이미징 소프트웨어	Carl Zeiss		ZEN 2011
3D-Image 소프트웨어	ThermoFisher Scientific		Amira 6.4
ImageJ	National Institutes of Health	https://imagej.nih.gov/ij/	ImageJ/FIJI