성인 Zebrafish의 구강 삽 관 법: 생리 활성 화합물의 장의 이해를 평가 하기 위한 모델

요약

생물 학적;와 intubating 성인 zebrafish를 프로토콜에 설명 합니다. 그리고 해 부 cytometry, confocal 현미경 검사 법 및 정량에 대 한 소장을 준비 합니다. 이 메서드는 관리를 장의 글귀와 로컬 면역 자극을 갖는 생리 활성 화합물의 수 있습니다. 그것은 구두 prophylactics의 장 역학 테스트 관련이 있습니다.

초록

대부분 병원 체 유기 체 그들의 점 막을 통해 침입 한다. 이것은 생선에 특히 사실 그들은 지속적으로 미생물이 풍부한 물 환경에 노출 되는. Immunostimulants 또는 백신, 전염 성 질병에 대 한 면역 시스템을 활성화 하는 구두 납품을 위한 효과적인 방법을 개발 하는 것이 매우 바람직하다입니다. 예방 도구를 고안, 좋은 실험 모델의 성능을 테스트 필요 합니다. 여기, 우리는 성인 zebrafish의 구강 삽 관 법에 대 한 방법 및 해 부 cytometry, confocal 현미경 검사 법 및 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량) 분석에 대 한 소장을 준비 하는 절차의 집합을 보여줍니다. 이 프로토콜, 우리가 정확 하 게 동물을 해치지 않고 약 1 g을 간단 하 고 신속 하 게, 무게 물고기 50 µ L까지 볼륨을 관리할 수 있습니다. 이 방법은 삽 관 법 후 장 점 막 및 로컬 사이트에 같은 생물 의약품의 immunomodulatory 용량 붙일 이라는 화합물의 직접 vivo에서 이해를 탐험 수 있습니다. 장 조직의 confocal 현미경 검사 법, 정량, 조직학, cytometry 등 다운스트림 메서드를 결합해 서, 우리는 immunostimulants 또는 예방 접종 수 있는 방법을 장 점 막 방 벽을 교차, 통과 lamina propria 이해할 수 있다 고 장내 점 막 면역 시스템에 효과 발휘 하는 근육에 도달 합니다. 모델 후보 구두 prophylactics 및 전달 시스템 또는 로컬 효과 있는 구두 관리 생리 활성 화합물의 테스트 사용 될 수 있습니다.

서론

이 문서의 목표는 깊이에 유용한 연결 된 다운스트림 절차 함께 zebrafish의 구강 삽 관 법에 대 한 간단한 방법 설명. 제 브라를 사용 하 여 구강 삽 관 법의 전염병 역학, 구강 백신/immunostimulant, 마약/나노 통풍 관 및 효능, 장내 점 막 면역 연구에 실용적인 모델 되고있다. 예를 들어 zebrafish 구강 삽 관 법 진 균 marinum 고 진 균 peregrinum 감염¹의 연구에 사용 되었습니다. Lovmo 외. 또한 나노 입자 및 M. marinum 는 위장 지역 성인 zebrafish²를 제공을 성공적으로이 모델을 사용. 첸 외. 마약, 나노 입자에 의해 캡슐화 보여 zebrafish 구강 삽 관 법을 사용 하는 또한 때 관리를 통해 위장 관의 혈액 두뇌 방 벽³에서 수송 되었다. 이 저자 수행 Collymore 그 외 여러분 에 의해 설명 하는 gauvage 방법에 따라 삽 관 법 몇 가지 수정 ⁴ . 그러나, 그들은 구두 삽 관 법 절차를 설명 하는 매우 상세한 프로토콜을....

프로토콜

Zebrafish (Danio rerio)를 포함 하는 모든 실험 절차 연구와 관련 된 동물 (국제 원칙와 Universitat Autònoma de 바르셀로나 (CEEH 수 1582)의 윤리 위원회에 의해 승인 되었다 EU 2010/63). 라이브 zebrafish 모든 실험 26-28 ° c.에 수행 되었다

1. 구강 삽 관 법에 대 한 장비 준비

1. 31 G Luer 잠금 바늘 바늘 팁을 커버 하기에 좋은 실리콘 튜브의 대략 1 cm를 놓습니다.
2. 컷 10 µ L 살 균 필터 피 펫 팁 (약 2cm), 미세한 끝과 칼 집으로 실리콘 튜브 위에 그것을 배치. 피펫으로 확장 부상 동물을 피하기 위해 바늘의 끝 다는 것을 확인 하십시오.
3. 100 µ L Luer 잠금 주사기 바늘을 연결 합니다.
   참고: 항상 에탄올으로 씻어 고 다음 인산 염 버퍼 (PBS, 자료를 참조) 치료 사이의 철저 하 게.

2입니다. 솔루션 필요

1. 150 mg/L (마 취) 또는 300 mg/L (안락사)는 zebrafish 유지는 수족관에서 물과 에틸 3-aminobenzoate methanes....

결과

제 브라 (중량 평균: 1.03 ± 0.16 g) 혼합 섹스 했다 성공적으로 intubated 다른 재조합 단백질 나노 입자 (세균 포함 시체)가 우리 집에서 만든 구강 삽 관 법 장치 (그림 1)를 사용 하 여 함께. 우리는 성공 구강 삽 관 법을 수행 하 고 낮은 평균 비율 사망률 (6.8%) (표 1)입니다. Zebrafish 되었고 중 intubated 30 µ L 또는 나노 입자 현 탁 액의 50 µ L 사망률 24 h 게시물 삽 관 법 내에서 산출 되었다. 실험 두 연산자에 의해 수행 되었다, R 작업 제이 보다 zebrafish 구강 삽 관 법을 덜 경험을 했다 심지어 새로운 연산자 독립적으로 수행할 수 없는 구강 삽 관 법을 보여준 결과 실험 쉽게이 프로토콜에 의해 높은 생존 율을 달성. 우리의 경험에서 최적의 물고기 크기 1 g, 하지만 우리는 성공적으로 intubated.......

토론

이 프로토콜은 Collymore 그 외 여러분 에 의해 구강 삽 관 법에 대 한 앞에서 설명한 방법의 개선 ⁴ 우리의 프로토콜 구강 삽 관 법 방법 자세히 설명 하 고 다운스트림 분석에 대 한 내장의 준비를 포함 한다. 우리의 방법은 사업자 사이 많은 변화 없이 빠르게, 전체 프로토콜을 수행 하는 한 사람을 허용 하는 물고기 조작 속도를 향상 시킵니다. 우리의 이전 프로토콜의 주요 차이점은 우리 복지에 대 한 동물의 관찰에 의해 뿐만 아니라 구강 삽 관 법 실험의 성공을 평가 하는 (예를 들어, 아무 출혈)와 확인 하 여 뿐만 아니라 관리, 액체의 누설에 대 한 다운스트림 분석 (cytometry, confocal 현미경 검사 법 및 정량)를 사용 하 여 대 장의 생리 활성 나노의 이해. 우리는 intubated 붙일 레이블된 나노 입자 소장에서 발견 된 것을 보여줍니다.

실용적인 측면에서 삽 관 법 장비.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
실리콘 튜브	Dow Corning	508-001	0.30 mm 내경 및 0.64 mm
외경 Luer lock needle	Hamilton	7750-22	31 G, Kel-F Hub
Luer lock syringe	Hamilton	81020/01	100 μ L, Kel-F 허브
필터링 피펫 팁	Nerbe Plus	07-613-8300	10 μ L
MS-222	시그마 알드리치	E10521	파우더
10x PBS	시그마 알드리치	P5493
여과지	Filter-Lab	RM14034252
콜라겐 분해 효소	Gibco	17104019
DMEM	Gibco	31966	Dulbecco의 변형된 독수리 매체
페니실린과 스트렙토마이신	Gibco	15240
세포 여과기	Falcon	352360
CellTrics 필터	Sysmex Partec	04-004-2326 (Wolflabs)	30 &마이크로; 2 mL 리저버가 있는 메시 크기 필터
Tissue-Tek O.C.T. 화합물	SAKURA	4583
플라스틱 금형 냉동 절제용	SAKURA	4557	일회용 비닐 몰드. 25 mm x 20 mm x 5 mm
슬라이드	Thermo Scientific	10149870	SuperFrost Plus 슬라이드
커버 안경	Labbox	COVN-024-200	24&급성; 24mm
파라포름알데히드(PFA)	시그마-알드리치	158127
Atto-488 NHS 에스테르	시그마-알드리치	41698
중탄산나트륨	시그마-알드리치	S5761
DMSO	시그마-알드리치	D8418
맥스웰 RSC SimplyRNA Tissue Kit	Promega	AS1340
1-티오글리세롤/균질화 솔루션	Promega	Maxwell RSC simplyRNA 조직 키트 내부	20 &mu 추가; l 1-Thioglycerol에서 1 mL 균질화 용액 (2%)
수직 실험실 회전자	Suministros Grupo Esper	10000-01062
크라이오스타트	라이카
Homogenizer	KINEMATICA	Polytron PT1600E
유세포 분석기	Becton Dickinson	FACS Canto
5 mL 라운드 바닥 튜브	Falcon	352058
컨포칼 현미경	Leica	SP5
흄 후드	Kottermann	2-447 BST
Nanodrop 1000	Thermo Fisher Scientific	ND-1000	분광 광도계
Agilent 2100 Bioanalyzer System	Agilent	G2939A	RNA 바이오분석기
맥스웰 인스트루먼트	Promega	AS4500
iScript cDNA 합성 키트	Bio-rad	1708891
CFX384 실시간 PCR  감지 시스템	Bio-Rad	1855485
iTaq 유니버설 SYBR 그린 슈퍼믹스 키트	Bio-rad	172-5120
물	Sigma-Aldrich	W4502
극저온 바이알	Thermo Fisher Scientific		375418 CryoTube 바이알
마운팅 매체	Sigma-Aldrich	F6057	Fluoroshield with DAPI

CM3050S