블루 기본 젤 전기 이동 법에 의해 Thylakoid 막 단백질 복합물의 분석

요약

프로토콜 식물의 해명 thylakoid 단백질 복잡 한 조직 및 구성 블루 네이티브 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (BN-페이지) 및 2D SDS 페이지 설명. 애기 thaliana, 프로토콜 최적화 작은 수정으로 다른 식물 종에 대 한 사용할 수 있습니다.

초록

광합성 전자 전송 체인 (등) NADPH와 ATP의 형태로 화학 에너지로 태양 에너지를 변환합니다. 4 개의 큰 단백질 복합물 NADP⁺ photosystems 통해 두, 물에서 전자를 드라이브 하 고 생성된 된 양성자 기온 변화도 사용 하 여 ATP의 생산을 위한 thylakoid 막 수확 태양 에너지에 포함. Photosystem PSII, PSI, 시 토 크롬 b₆f (Cyt b₆f) 및 ATPase는 뚜렷한 방향과 thylakoid 막에서 역학으로 모든 multiprotein 복합물. 온화한 세제의 기본 젤 전기 이동 별거 다음으로 막 무결성에서 단지 solubilizing 여 구성과 thylakoid 막에서 단백질 복합물의 상호 작용에 대 한 유용한 정보를 얻을 수 있습니다는 단지입니다. 블루 기본 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (BN-페이지) 그들의 네이티브 및 기능 형태로 단백질 복합물의 분리에 사용 되는 분석 방법 이다. 자세한 구조 분석을 위해 단백질 복잡 한 정화에 대 한 메서드를 사용할 수 있습니다 하지만 그것은 또한 단백질 복합물 간의 동적 상호 작용을 해 부를 도구를 제공 합니다. 메서드를 사용 하면 미토 콘 드리 아 호흡 단백질 복합물의 분석을 위해 개발 되었다 하지만 이후 되었습니다 최적화 있으며 thylakoid 단백질 복합물의 해 부에 대 한 개선. 여기, 우리가 정한 광합성 단백질 복합물 및 애기 thaliana에서 그들의 상호 작용의 분석에 대 한 상세한 최신 프로토콜을 제공합니다.

서론

큰 multisubunit 단백질 복합물 photosystem PSI과 PSII, Cyt b₆f와 ATPase 광합성 빛 반응에서 ATP와 NADPH의 생산 조정. 더 높은 식물의 엽록체에는 단지는 구조적으로 다른 유형의 막 구조, appressed grana 및 appressed 비 기질 thylakoids thylakoid 막에 있습니다. 블루 기본 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (BN-페이지) 그들의 네이티브 및 생물학적 활성 형태로 큰 multisubunit 단백질 복합물의 분석에는 광범위 하 게 사용 되는 방법 이다. 방법¹, 미토 콘 드 리아 멤브레인의 단백질 복합물 해 부에 대 한 설립 되었다 하지만 나중 thylakoid 막 네트워크³에서 단백질 복합물의 분리에 대 한 사용자 지정 된. 방법은 (i) 구조 분석, (ii) 단백질 복합물 사이 기본 상호 작용을 결정 하 고 (iii) 단백질 복합물의 전체 조직 분석에 대 한 개별 thylakoid 단백질 복합물의 정화에 적합 시 환경 큐를 변경 합니다.

이전에 분리, 단백질 복합물 신중 하 게 선택한 비 세제는 일반적으로 온화 하 고 단백질 복합물의 기본 구조를 ....

프로토콜

1. 준비 비 엔 젤^1,2,3

1. 0.75 m m의 스페이서를 사용 하 여 제조업체의 지침에 따라 8 cm x 10 cm 플레이트 (직사각형 유리 및 노치 알 루미나 판)와 젤 캐스터를 설정 합니다.
2. 그라데이션 믹서를 저 어 접시에 놓고는 배관에 의해 연동 펌프와 연결 합니다. 주사기 바늘 튜브의 다른 쪽 끝을 연결 하 고 유리 및 알루미늄 격판덮개 사이 바늘을 배치. "무거운" (H)에 장소 자력-챔버.
3. 대비 3.5% (v/v) 및 12.5% (v/v) 15 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에 아크릴 (AA) 솔루션 분리 젤 그라데이션 (참조 표 1에). 불의 중 합을 방지 하기 위해 솔루션을 준비 하는 동안 얼음에 원심 분리기 튜브를 유지.
   주의: 아크릴은 신경 및 발암 성, 마모 보호 옷과 장갑.
4. 그라데이션 믹서에 대 한 해결책을 pipetting 전에 5 %APS TEMED 오른쪽을 추가 합니다. 피펫으로 H-챔버에 12.5% 솔루션.
   1. L-챔버를 입....

결과

그림 1 에 대표적인 2D BN/SDS 페이지 시스템 digitonin 및 β-DM solubilized thylakoid 단백질 복합물의 분리 및 그들의 상세한 단백질 소 단위 구성 방법을 보여 줍니다. PSII-LHCII-PSI megacomplex, 2 개의 큰 PSII LHCII supercomplexes (sc), PSI-LHCII supercomplex, PSI 단량체 (m), PSII m/Cyt solubilized digitonin thylakoids ( 그림 1A상단 위에 가로 젤)의 단백질 복잡 한 패턴 포함 b₆f, 느슨하게 바운드 (L)-LHCII 삼합체 (그림 1A). 약간 강한 세제, β-DM, 전체 thylakoid 막 ( 그림 .......

토론

광합성 에너지 변환 기계 thylakoid 막에 포함 된 큰 multisubunit 단백질 복합물으로 구성 된다. 이 프로토콜 애기 thaliana 2D SDS 페이지와 결합 된 BN 페이지에서 식물 thylakoid 단백질 복합물의 분석을 위한 기본적인 방법을 설명 합니다. 프로토콜은 또한 담배와 시금치 thylakoids에서 thylakoid 단백질 복합물의 분석에 적합 하지만 작은 조정 해야 할 수도 있습니다.

막 단백질 복합물의 가용 화에 대 한 비 세제는 일반적으로 그들의 능력에 대 한 그들의 기본 형태로 단지를 보존 하기 위해 사용 됩니다. 여기, 두 가지 일반적으로 사용 되 세제 β-DM 및 digitonin 적용 했다. 라우릴 maltoside solubilizes 개별 단백질 복합물, 반면 더 큰 단백질 복잡 한 어셈블리¹⁰의 분석에 대 한 digitonin를 사용할 수 있습니다. 부피가 큰 구조적된 di.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
6-아미노카프로산(ACA)	시그마-알드리치	A2504
비스트리스	시그마-알드리치	B4429
설탕	시그마-알드리치	S0389
아크릴아미드(AA)	시그마-알드리치	A9099	주의: 신경독성!
n-dodecyl-β-D-maltoside	Sigma-Aldrich	D4641
Tricine	Sigma-Aldrich	T0377
Tris	Sigma-Aldrich	T1503
SDS	VWR	442444H
Urea	VWR	28877.292
Glycerol	J.T. Baker	7044
불화나트륨 (NaF)	J.T. 베이커	3688
EDTA 디소듐 염	J.T. 베이커	1073
디지토닌	칼비오켐	300410	주의: 독성!
Pefabloc SC	Roche	11585916001
Serva Coomassie Blue G	Serva	35050
β-메르캅토에탄올	Bio-Rad	1610710
APS(과황산암모늄)	Bio-Rad	161-0700
TEMED(테트라메틸에틸렌디아민)	Bio-Rad	1610801
(N,N'-메틸렌)-비스-아크릴아미드	Omnipur	2610
Glycine	Fisher	G0800
Prestained Protein Marker, Broad Range (7-175 kDa)	New England Biolabs	P7708
Falcon, 원추형 원심분리기 튜브 15 ml	Corning	352093
10 x 8 cm 플레이트가 있는 듀얼 젤 캐스터	Hoefer	SE215
그라디언트 메이커 SG5	Hoefer
0.75mm T-스페이서	Hoefer	SE2119T-2-.75
샘플 젤 빗, 0.75mm	Hoefer	SE211A-10-.75
Mighty Small SE250 수직 전기영동 시스템	Hoefer	SE250
IPC-펌프	Ismatec
전원 공급 장치, PowerPac HV	Bio-Rad	164-5097
원심분리기	Eppendorf	5424R
Rocker-Shaker	Biosan	BS-010130-AAI
PROTEAN II xi Cell	Bio-Rad	1651813