이 프로토콜 심장 조상 세포는 내 피 분화 기법을 설명합니다. 그것은 특히 혈 청 농도 셀 시드 밀도 미치는 내 피 분화 가능성에 초점을 맞추고.
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방법 논문
낮은 혈 청 조건 하에서 심장 조상 세포에서 내 피 분화의 유도
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
심장 조상 세포 (Cpc)는 부상 후 심장 재생을 위한 치료 잠재력을 할 수 있습니다. 성인 포유류 심장에서 본질적인 Cpc는 매우 부족 하지만 확장 된 Cpc 세포 치료에 대 한 도움이 될 수 있습니다. 그들의 사용에 대 한 전제 조건 정의 하 고 효율적인 프로토콜을 사용 하 여 다양 한 심장 계보에 제어 방식으로 차별 하는 그들의 능력 이다. 또한, 생체 외에서 확장에 따라 Cpc 환자 로부터 격리 또는 임상 질병 모델 질병 메커니즘의 조사에 대 한 유익한 연구 도구를 제공할 수 있습니다.
현재 연구는 Cpc를 식별 하기 위해 다른 마커를 사용 합니다. 그러나, 그들의 모든 인간, 일부 임상 연구의 변환에 미치는 영향을 제한 하 표현 됩니다. 격리 기술과 마커 식에 관계 없이 적용 가능한 차별화 프로토콜 표준화 된 확장 및 세포 치료 목적에 대 한 Cpc의 애 벌 칠 수 있게 됩니다. 여기 우리가 낮은 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 농도 낮은 세포 밀도 조건에서 Cpc의 못쓰게 Cpc. 마우스와 쥐 Cpc의 두 개의 서로 다른 모집단을 사용 하 여 내 피 분화를 용이 하 게, 우리는 더 그 laminin 표시 설명 fibronectin 다음 프로토콜에서이 목적을 위해 보다 적합 한 기판: 3.5%와 보충을 포함 하 여 매체에 2-3 일을 유지 multipotency 위한 배양 후 FBS, Cpc에서 laminin에 시드는 < 60% 합류에 교양 및 보충-무료 내 피 분화 매체에 차별화 하기 전에 20-24 시간 동안 FBS (0.1%)의 낮은 농도와 매체. Cpc는 유형이 다른 인구 때문에, 혈 청 농도 및 부 화 시간 각각 CPC 부분 모집단의 속성에 따라 조정 될 필요가 있습니다. 고려, 기술 뿐만 아니라 Cpc의 다른 종류에 적용할 수 있는 그리고 잠재력과 차별화 하 고 어떻게 영향을 받는지 질병에 의해 각각 질병 모델에서 격리 하는 Cpc를 사용할 때의 메커니즘을 조사 하는 유용한 방법을 제공 합니다.
서론
최근 연구 결과 성인 포유류 심장1,2,3, 주민 심장 조상 세포 (Cpc)의 존재를 지원 하 고 Cpc 심장 상해4, 후 세포 치료에 대 한 유용한 소스 될 수 있습니다. 5. 또한, 확장 된 Cpc 마약 검사에 대 한 유익한 모델을 제공할 수 있습니다 및 각 질병 또는 드문 cardiomyopathies 가진 환자에서 분리 될 때 질병 메커니즘의 조사 모델6,7.
성인 심장에서 고립 된 Cpc 소유 줄기/시 조 세포 특성1,2,,38 은 multipotent, clonogenic, 자기 갱신에 대 한 능력. 그러나, Cpc 전시 다른 표면 ....
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프로토콜
셀 격리 목적을 위해 마우스를 사용 하 여 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 가이드 스위스 동물 보호 법률에 따라 되었고 스위스 Cantonal 권위에 의해 승인 되었다.
참고: 격리 Sca-1+/CD31- SP-Cpc 마우스 마음에서 본질적으로 이루어졌다 앞에서 설명한34 약간 수정으로. 재료 및 시 약 사용에 대 한 재료의 표를참조 하십시오. 모든 실험에 대 한 심장 SP-Cpc 쥐에서 분리 증폭, passaged, 되었고 셀 라인 같은 방식에서으로 사용. 구절 7-20이이 연구를 위해 사용 되었다.
1. 조직 준비
참고: 마우스를 사용 하 여 모든 실험 한다 실시 지침 및 규정. 이 프로토콜은 4 개의 마우스를 사용합니다. 직경에서 100 m m는 배양 배지는 P100으로 설명 하 고 지름에서 60 mm 문화 접시는 프로토콜의 다음 부분에 대 한 p 60으로 설명 하 고 있다.
- Intraperitoneally 각 마우스 pentobarbital의 200 mg/kg을 주사 (i.p.) 완벽 하 게 곤란 하 게 ....
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결과
마우스 SP-클릭 당 절연:
이 연구에서 우리는 마우스 Cpc 반면 쥐 Cpc에서 결과 수정 및 권한 (그림 8)33와 이전 보고서에서 추가 SP 형에 따라 격리를 사용 합니다.
다른 혈 청 농도 높고 낮은 세포 밀도에서 세포 증식:
우리의 이전 연구가 보여주었다 심장 혈통 마커 mRNA 표현 단계를 경작 하는 첫 번째 24 시간에서 변경. 세포 외 매트릭스 내 피 분화35를 포함 한 세포 운명 결정에 영향을 미치는 알려져.......
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토론
이 프로토콜의 장점:
이 프로토콜에는 Cpc의 내 피 분화 기술을 제공합니다. 우리는 낮은 혈 청 농도 낮은 세포 밀도 내 피 분화, 그것에 의하여 LN 판명 FN이이 조건 하에서 보다 더 적합 한 기판의 효율을 높일 수 발견. 우리가 사용 하는 Cpc의 두 가지 유형: 쥐 Cpc, 셀 라인 같은 방식으로, 및 마우스 SP Cpc에 사용 했다, 분리 하 고 확장 했다. 특히, 프로토콜 모두에 적용 되는 Cpc. 현재의 기술을 분리 하 고 확장 기본 Cpc 유전자 변형된 마우스 및 전 임상 질병 모델에서 뿐만 아니라 인간28,36에서 과학자를 허용. 이 프로토콜을 사용 하 여 격리 된 Cpc에 뿐만 아니라 질병 메커니즘의 수사 뿐만 아니라 소설 치료 대상의 탐험에 도움이 수 있습니다.
Cpc는 현재 임상 테스트 대 한 세포 치료
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
저자는 실험 및 생물의 약 학과 (DBM), 대학 및 대학 병원 바젤 Flow Cytometry 시설에서 직원 도움이 그녀의 지원에 대 한 베라 로렌스를 감사합니다. 이 작품은 숙박에 트랙 프로그램에 바젤의 대학에서 (Michika 모치즈키) 지원 되었다. 가브리엘라 M. Kuster 스위스 국립 과학 재단 (보조금 번호 310030_156953)에서 교부 금에 의해 지원 됩니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Culture 배지 | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ThermoFisher | #12440 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | Merck | #D8437 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| Fetal Bovine 혈청 (FBS) | Hyclone | #SH30071 | 3.5 % (혈통 유도 0.1 %) |
| L- 글루타민 | ThermoFisher | #25030 | 최종 농도 2 mM |
| 글루타티온 | Merck | #G6013 | |
| 재조합 인간 표피 성장 인자 (EGF) | Peprotech | #AF-100-15 | |
| 재조합 염기성 섬유아세포 성장 인자 (FGF) | Peprotech | #AF-100-18B | |
| B27 보충제 | ThermoFisher | #17504044 | |
| 심장 자극 호르몬 1 | Peprotech | #250-25 | |
| Thrombin | Diagontech AG, Switzerland | #100-125 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-) | ThermoFisher | #14170 | |
| 0.05 % Trypsin-EDTA | ThermoFisher | #25300 | |
| T75 Flask | Sarstedt | #83.3911 | |
| Endothelial differentiation | |||
| Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit | Lonza | #CC-3162 | |
| Ham's F-12K (Kaighn's) Medium | ThermoFisher | #21127 | |
| Laminin | 머크 | #L2020 | |
| 피브로넥틴 | Merck | #F4759 | ddH2O |
| 6웰 플레이트 | Falcon | #353046 | |
| 포름알데히드 용액 | Merck | #F1635 | Diluite 1:10 in PBS (3.7% 최종 농도)Triton |
| X-100 | Merck | #93420 | ddH2O |
| Normal Goat Serum (10%) | ThermoFisher | #50062Z | |
| Anti-von Willebrand Factor 항체 | Abcam | #ab6994 | 10% 염소 혈청 |
| 염소 항 토끼 IgG, Alexa Fluor 546 | ThermoFisher | #A11010 | 1:500 10% 염소 혈청 |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) | ThermoFisher | #62247 | 1:500 ddH2O |
| SlowFade Antifade Kit | ThermoFisher | #S2828 | |
| BX63 광시야 현미경 | Olympus | ||
| Tube formation | |||
| 96 Well Plate | Falcon | #353072 | |
| 5 ml Round Bottom Tube with Strainer Cap | Falcon | #352235 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced | Corning | #354230 | |
| IX50 광시야 현미경 | Olympus | ||
| Sca-1+/CD31- 심장 측 인구 격리34 | |||
| 시약 | |||
| Pentobarbital Natrium 50 mg/ml ad usum 수의사. | 사내 병원 약국 | #9077862 | 작업 솔루션: 200 mg/kg |
| 인산염 완충 식염수 (PBS) CaCl2(-), MgCl2(-) | ThermoFisher | #20012 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-), 페놀 레드 (-) | ThermoFisher | #14175 | Collagenase B 활성을 담금질하기 위해 HBSS 500 mL + 2% FBS 준비 |
| Dulbecco의 Modified Eagle's Medium (DMEM) 1g/L의 D-글루코스, L-글루타민, 피루브산 | ThermoFisher | #331885 | DMEM + 10% FBS를 준비합니다 + 25 mM HEPES+ P/S를 Hoechst stanining |
| Penicillin-Streptomycin에 사용합니다. (P/초) | ThermoFisher | #15140122 | |
| HEPES 1 M | ThermoFisher | #15630080 | 최종 농도 25 mM |
| 소 태아 혈청(FBS) | Hyclone | #SH30071 | |
| RBC LysisBuffer(10X) | BioLegend | #420301/100mL | ddH2O에서 1X로 희석하고 0.2 µ를 통해 여과합니다. m 필터 |
| Collagenase B | Merck | #11088807001 | HBSS에서 최종 농도 1mg/mL, 0.2 µ를 통해 여과; m 필터 |
| bisBenzimide H33342 Trihydrochloride (Hoechst) | Merck | #B2261 | 에 1 mg/mL를 준비하십시오 |
| . | Merck | #V4629 | 최종 농도 83.3 &마이크로; 남 |
| APC 쥐 안티 마우스 CD31 | BD Biosciences | #551262 | 0.25 µ g/107cells |
| FITC 쥐 안티 마우스 Ly-6A/E (Sca-1) | BD Biosciences | #557405 | 0.6 µ g/107cells |
| 7-Aminoactinomycin D (7-ADD) | ThermoFisher | #A1310 | 0.15 &마이크로; g/106cells |
| APC 쥐 IgG2a k 동종 제어 | BD Biosciences | #553932 | 0.25 &마이크로; g/107cells |
| FITC 쥐 IgG2a k 동형 대조군 | BD Biosciences | #554688 | 0.6 µ g/107cells |
| Material | |||
| Needles 27G | Terumo | #NN-2719R | |
| 바늘 18G | Terumo | #NN-1838S | |
| 일회용 주사기 1 mL sterile | CODAN | #62.1640 | |
| Transferpipette 3.5 mL | Sarstedt | #86.1171.001 | |
| Cell 스트레이너 40 & 마이크로; m 블루 | BD 바이오사이언스 | #352340 | |
| 세포 여과기 100 &마이크로; m yellow | BD Biosciences | #352360 | |
| Lumox Dish 50 | Sarstedt | #94.6077.305 | |
| Culture Dishes P100 | Corning | #353003 | |
| Culture Dishes P60 | Corning | #353004 | |
| Mouse | |||
| Line | >Age | 번식 | |
| C57BL/6NRj / 수컷 | 12주 | 사내 | |
| 제품명 | Company | 카탈로그 번호 | |
| Reagents | |||
| Iscove의 Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ThermoFisher | #12440 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/영양 혼합물 F12 Ham | Merck | #D8437 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/초) | ThermoFisher | #15140122 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | |
| L-Glutamine | ThermoFisher | #25030 | |
| 글루타티온 | Merck | #G6013 | |
| B27 보충제 | ThermoFisher | #17504044 | |
| 재조합 인간 표피 성장 인자 (EGF) | Peprotech | #AF-100-15 | |
| 재조합 기본 섬유아세포 성장 인자 (FGF) | Peprotech | #AF-100-18B | |
| 심장 영양 호르몬 1 | Peprotech | #250-25 | |
| Thrombin | Diagontech AG, 스위스 | #100-125 | |
| 내피 세포 성장 배지(EGM)-2 BulletKit | Lonza | #CC-3162 | |
| 배지 조성물 개요. 이 정보 중 일부는 위에 제공된 것과 동일하지만 미디어 1-3의 구성에 따라 정렬됩니다. | |||
| 제품 이름 | Medium 18 | Medium 2 | Medium 3 |
| Reagents | Culture | Lineage induction | Endothelial diff. |
| Iscove의 변형된 Dulbecco's Medium (IMDM) | 35% | 35% | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/영양 혼합물 F12 햄 | 65% | 65% | |
| 페니실린-스트렙토마이신 (P/초) | 1% | 1% | |
| 태아 소 세럼 (FBS) | 3.5% | ≤ 0.1% | |
| L-글루타민 | 2 mM | 2 mM | |
| 글루타티온 | 0.2 nM | 0.2 nM | |
| B27 보충제 | 1.3% | ||
| 재조합 인간 표피 성장 인자 (EGF) | 6.5 ng/mL | ||
| 재조합 기본 섬유아세포 성장 인자 (FGF) | 13 ng/mL | ||
| 심장 영양 1 | 0.65ng/mL | ||
| 트롬빈 | 0.0005 U/mL | 키트에 포함된 모든 필수 구성 요소 | |
| EGM(Endothelial Cell Growth Medium)-2 BulletKit | 키트에 포함된 모든 필수 구성 요소 |
참고문헌
- Beltrami, A. P., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell. 114 (6), 763-776 (2003).
- Hierlihy, A. M., Seale, P., Lobe, C. G., Rudnicki, M. A., Megeney, L. A. The post-natal heart contains a myocardial stem cell population.
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재인쇄 및 허가
