방법 논문

낮은 혈 청 조건 하에서 심장 조상 세포에서 내 피 분화의 유도

DOI:

10.3791/58370

⸱

2019년 1월 7일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedicine, University Hospital and University of Basel, 2Division of Cardiology, University Hospital Basel

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜 심장 조상 세포는 내 피 분화 기법을 설명합니다. 그것은 특히 혈 청 농도 셀 시드 밀도 미치는 내 피 분화 가능성에 초점을 맞추고.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

심장 조상 세포 (Cpc)는 부상 후 심장 재생을 위한 치료 잠재력을 할 수 있습니다. 성인 포유류 심장에서 본질적인 Cpc는 매우 부족 하지만 확장 된 Cpc 세포 치료에 대 한 도움이 될 수 있습니다. 그들의 사용에 대 한 전제 조건 정의 하 고 효율적인 프로토콜을 사용 하 여 다양 한 심장 계보에 제어 방식으로 차별 하는 그들의 능력 이다. 또한, 생체 외에서 확장에 따라 Cpc 환자 로부터 격리 또는 임상 질병 모델 질병 메커니즘의 조사에 대 한 유익한 연구 도구를 제공할 수 있습니다.

현재 연구는 Cpc를 식별 하기 위해 다른 마커를 사용 합니다. 그러나, 그들의 모든 인간, 일부 임상 연구의 변환에 미치는 영향을 제한 하 표현 됩니다. 격리 기술과 마커 식에 관계 없이 적용 가능한 차별화 프로토콜 표준화 된 확장 및 세포 치료 목적에 대 한 Cpc의 애 벌 칠 수 있게 됩니다. 여기 우리가 낮은 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 농도 낮은 세포 밀도 조건에서 Cpc의 못쓰게 Cpc. 마우스와 쥐 Cpc의 두 개의 서로 다른 모집단을 사용 하 여 내 피 분화를 용이 하 게, 우리는 더 그 laminin 표시 설명 fibronectin 다음 프로토콜에서이 목적을 위해 보다 적합 한 기판: 3.5%와 보충을 포함 하 여 매체에 2-3 일을 유지 multipotency 위한 배양 후 FBS, Cpc에서 laminin에 시드는 < 60% 합류에 교양 및 보충-무료 내 피 분화 매체에 차별화 하기 전에 20-24 시간 동안 FBS (0.1%)의 낮은 농도와 매체. Cpc는 유형이 다른 인구 때문에, 혈 청 농도 및 부 화 시간 각각 CPC 부분 모집단의 속성에 따라 조정 될 필요가 있습니다. 고려, 기술 뿐만 아니라 Cpc의 다른 종류에 적용할 수 있는 그리고 잠재력과 차별화 하 고 어떻게 영향을 받는지 질병에 의해 각각 질병 모델에서 격리 하는 Cpc를 사용할 때의 메커니즘을 조사 하는 유용한 방법을 제공 합니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

최근 연구 결과 성인 포유류 심장1,2,3, 주민 심장 조상 세포 (Cpc)의 존재를 지원 하 고 Cpc 심장 상해4, 후 세포 치료에 대 한 유용한 소스 될 수 있습니다. 5. 또한, 확장 된 Cpc 마약 검사에 대 한 유익한 모델을 제공할 수 있습니다 및 각 질병 또는 드문 cardiomyopathies 가진 환자에서 분리 될 때 질병 메커니즘의 조사 모델6,7.

성인 심장에서 고립 된 Cpc 소유 줄기/시 조 세포 특성1,2,,38 은 multipotent, clonogenic, 자기 갱신에 대 한 능력. 그러나, Cpc 전시 다른 표면 표식 프로필을 포함 하 여, 예를 들어, c-키트, Sca-1, 그리고 다른 사람, 또는 다른 절연 기술 (표 1)에 의해 검색의 많은 다른 (하위) 인구 있다. 여러 문화와 차별화 프로토콜 되었습니다 설립된1,2,,89,10,11,12, 13,,1415,,1617,18. 이러한 프로토콜은 성장 인자 및 혈 청 콘텐츠를 하는 경작의 목적에 따라 조정 결과 및 결과, 차별화 효율성 등에서 차이를 낼 수 있는 관하여 주로 다.

마커 기반 격리 기법:

Cpc는 특정 표면 마커 식1,2,,89,10,11,12,13 에 따라 격리 된 수 있습니다. 14,15,,1617,18. 이전 연구는 c-kit 및 Sca-1 주민 Cpc1,,1114,,1920을 최고의 마커를 있을 수 있습니다 제안 합니다. 이러한 마커 중 누구도 진정으로 Cpc에 대 한 특정 있기 때문에, 다른 표시의 조합 일반적으로 적용 됩니다. 예를 들어 c-키트21의 저급을 표현 하는 Cpc, 반면 c-키트는 또한 돛대 세포22,23, 내 피 세포 및 조 혈 줄기/뿌리 셀24를 포함 하 여 다른 세포 유형으로 표현 됩니다. 추가적인 문제는 사실 이다 모든 마커는 모든 종에 걸쳐 표현 됩니다. 이것은 인간의25에 마우스만을 표현 하는 Sca 1에 대 한 경우입니다. 따라서, 격리 표식의 독립적인 프로토콜을 사용 하 여 임상 시험 및 연구 인간의 샘플을 사용 하 여 보기 유리할 수 있습니다.

마커-독립 절연 기술:

몇 가지 주요 기술 CPC 격리는 주로 표면 마커 식의 독립 하지만 ( 표 1참조)을 필요에 따라 특정 마커-긍정적인 subfractions의 연속 선택에 의해 정제 수는 있다. (1) 측 인구 (SP) 기술은 원래 ATP 묶는 카세트 (ABC) 운송업 자27여 경과 DNA 염료 Hoechst 3334226 수에 따라 조 혈 줄기 세포의 기본 인구 특징 되었습니다. 심장 SP 세포를 다른 그룹에 의해 분리 하 고 표현 하는 다양 한 보고서2,8,,1314사이의 작은 차이와 마커를 보고 되었습니다. (2) 콜로 니 형성 단위 fibroblast 세포 (CFU-Fs) 원래에 정의 된 따라 mesenchymal stromal 세포 (MSC)-형 같은. 격리 된 MSCs 식민지 형성을 유도 하는 요리에 교양. MSC 같은 CFU Fs 식민지 형성 등 성인 심장에서 고립 될 수 있다 고 심장 계보15로 분화 할 수 있다. (3) Cardiosphere-파생 셀 (CDC) 조직 생 검에서 성장 하는 셀의 클러스터에서 파생 하는 단 세포 또는 explants28,29,,3031. 최근에 주로 CD105 보였다+/CD90-/c-kit- 셀 분수 cardiomyogenic 및 재생 잠재적인32전시.

여기, 우리 쥐 Cpc 및 마우스 SP Cpc33이전의 연구에 따라 내 피 혈통의 효율적인 유도 프로토콜 제공 SP-Cpc 쥐에서 격리를 사용 하 여. 프로토콜에는 문화에 특정 적응 및 셀 밀도 관하여 확장 기술, 매체, 그리고 기판의 혈 청 내용 포함 되어 있습니다. 그것은 마우스 SP Cpc에 뿐만 아니라 적용할 수 있습니다 하지만 내 피 커밋된 CPC에는 증폭에서 운명 스위치를 유도 하는 목적에 대 한 Cpc의 종류, 이식이 세포 또는 기계적 생체 외에서 연구에 대 한 그들의 사용의 보기.

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프로토콜

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셀 격리 목적을 위해 마우스를 사용 하 여 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 가이드 스위스 동물 보호 법률에 따라 되었고 스위스 Cantonal 권위에 의해 승인 되었다.

참고: 격리 Sca-1+/CD31- SP-Cpc 마우스 마음에서 본질적으로 이루어졌다 앞에서 설명한34 약간 수정으로. 재료 및 시 약 사용에 대 한 재료의 표를참조 하십시오. 모든 실험에 대 한 심장 SP-Cpc 쥐에서 분리 증폭, passaged, 되었고 셀 라인 같은 방식에서으로 사용. 구절 7-20이이 연구를 위해 사용 되었다.

1. 조직 준비

참고: 마우스를 사용 하 여 모든 실험 한다 실시 지침 및 규정. 이 프로토콜은 4 개의 마우스를 사용합니다. 직경에서 100 m m는 배양 배지는 P100으로 설명 하 고 지름에서 60 mm 문화 접시는 프로토콜의 다음 부분에 대 한 p 60으로 설명 하 고 있다.

  1. Intraperitoneally 각 마우스 pentobarbital의 200 mg/kg을 주사 (i.p.) 완벽 하 게 곤란 하 게 발가락에 그것의 응답을 확인 하 여 마 취 될 때까지 기다립니다.
  2. 70% 에탄올과 가슴을 닦아. 흉 강 폭로 위 피부와 흉 벽을 잘라.
  3. 집게와 마음을 들어올리고가 위를 사용 하 여 기초에 그것을 잘라 합니다. 차가운 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) (P100 당 3 ~ 5 마음) 또는 P60 당 1 ~ 2 심 혼의 25 mL P60 (5 mL)와 P100에 마음을 넣어.
  4. 충 치 (그림 1A)에서 피를 분출 하는 집게와 심장 펌프.
  5. 세척에 대 한 차가운 PBS의 25 mL P60 (5 mL)와 P100에 마음을 넣어. Atria 작은 위를 사용 하 여 제거 합니다. 심장 두 경도 조각으로 잘라 하 고 얼음 처럼 차가운 PBS (25 mL/P100, 5 mL/P60)에 다시 그들을 세척.
  6. 차가운 PBS의 25 mL P60 (5 mL)와 함께 새로운 P100 조각을 전송. 작은 위 (그림 1B)를 사용 하 여 작은 조각으로 조각을 잘라. 1 mg/mL 콜라 B 행 크의 균형된 소금물 (HBSS)에 희석 한 방울을 추가 하 고 철저 하 게 멸 균 면도날 (그림 1C)와 작은 조각을 말하다.

2입니다. 소화

  1. 단계 1.6에서에서 1mg/mL 콜라 B 솔루션의 접시 10 mL (P60 2.5 mL)을 추가 합니다.
  2. 포함 하는 기울어진 (약 30 °)에서 다진된 마음 조각 콜라 B 솔루션 P100 (P60) 37 ° C 배양 기 (그림 1D)에.
  3. 최대 30 분;에 대 한 다진된 마음 조각 품 어 균질 하 여 반복적으로 그들 파스퇴르 피 펫 마다 10 분 동안 부 화 (그림 1E).
    참고: 인큐베이션 단계 1.3에 대 한 총 30 분을 초과 하지 중요 하다.

3입니다. 여과

  1. 10 mL (5 mL P60) 차가운 HBSS 보충 2%의 추가 FBS 다진 고 무 균 심장 조각에.
    참고: HBSS 보충 2 %FBS 냉각 콜라와 B 활동.
  2. 100 µ m 필터 제거 소화 되지 않은 조직 및 상 온 (RT) (그림 1 층, 노란색 필터)에서 5 분 동안 470 x g 에서 원심 분리기를 통해 심장 조각 필터링.
  3. 삭제는 상쾌한 붉은 혈액 세포 세포의 용 해 버퍼의 5 mL (P60 3 mL)에 펠 릿을 resuspend 하 고 얼음에 가끔 떨고와 5 분 동안 펠 릿을 품 어.
  4. (세포 반응을 중지)을 PBS의 10 mL (5 mL P60) 추가 샘플 잔여 cardiomyocytes (그림 1 층, 블루 필터)를 포함 하 여 더 큰 셀을 제외 하는 40 µ m 필터를 통해 필터링.
  5. 470 x g (브레이크) 없이 RT 5 분에 튜브 원심 삭제는 상쾌한 고 10%를 포함 한 DMEM의 1 mL에 펠 릿을 resuspend FBS.
  6. hemocytometer와 약 수의 셀을 계산 합니다. DMEM 10% 포함 된 셀을 resuspend FBS, 1 x 106 셀/mL의 최종 셀 농도.
    참고: 약 5 x 106 cardiomyocyte 적혈구 고갈 세포 수 수 추정 마우스 당.
  7. 2 개의 튜브 (그림 2)로 셀 배포: 튜브 A, 추가 Hoechst 33342 얼룩 verapamil;와 1.5 l 관 B, Hoechst 33342 얼룩 18.5 l을 추가 하 고 얼룩을 cytometry (4.1 및 4.2 단계) 심장 SP 셀 정렬 진행.

4. 심장 SP Cytometry 셀의 정렬

참고: Verapamil multidrug 저항 (MDR) ABC 운송업 자 활동을 차단 하 여 Hoechst 경과 억제. Hoechst 33342 DNA 콘텐츠와 연관으로 세포 주기를 감지 하 살아있는 세포에서 사용 될 수 있는 DNA 바인딩 염료 이다. Hoechst 33342 압출 셀 Hoechst 낮은 부분의 두 방출 채널에 표시 (450 nm, Hoechst 블루; 650 nm, Hoechst 레드), 즉, 옆으로 Hoechst-유지의 "주요 인구를", 그들에 게 그들의 이름 "쪽 인구"를 주는. SP 셀 조상 속성에 포함 된 셀에서 농축 하 고 multidrug 저항 ABC 운송업 자 (MDR1, ABCG2) 등의 높은 식 표시. Hoechst 33342 Hoechst 프로토콜의 다음 부분에 대 한로 기록 됩니다. 그것은 이상적인 결과 대 한 감광 재료를 보호 해야 합니다.

  1. 존재와 부재의 verapamil Hoechst와 얼룩
    1. (83.3 μ M의 최종 농도)와 verapamil, Hoechst (5 µ g/106 세포의 최종 농도)와 셀 솔루션에 추가 합니다. 튜브 A, Verapamil 및 Hoechst; 사용 관 B, Hoechst만 사용 합니다. 90 분 (37 ° C)에서 물 욕조에 incubate 고 튜브 마다 20 분 (그림 1G) 복귀.
    2. 470 x g 실시간 삭제는 상쾌한에 5 분에 튜브 원심 고 각 펠 릿 HBSS (1 x 106 셀/mL)에서 resuspend.
    3. 단일 stainings 및 튜브 B (그림 2)에서 부정적인 제어를 위한 aliquot 1.5 mL를가지고: (i) fluorescein isothiocyanate (FITC)-활용 된 안티-Sca-1; (ii) allophycocyanin (APC)-안티-CD31;를 활용 (iii) nonstained 셀 (부정적인 제어).
      참고: Isotype 컨트롤 격리 프로토콜 설정에 대 한 여기에 사용 됩니다.
    4. 원심 관 A와 B와 RT에 5 분 동안 470 x g 에서 단일 얼룩 및 부정적인 제어 aliquots Hoechst, verapamil 밖으로 세척에 대 한.
    5. 삭제는 상쾌한 고 튜브 A 및 (iii) HBSS의 250 µ L에 부정적인 컨트롤의 펠 릿 resuspend 정렬까지 어둠 속에서 얼음에 그들을 유지.
    6. HBSS의 100 µ L에서 단일 얼룩 aliquots HBSS의 200 µ L에 (i, ii)의 펠 릿 관 B의 펠 릿을 resuspend. FITC 활용 된 안티-Sca-1 (0.6 µ g/107 셀)와 APC 활용 된 안티-CD31 (0.25 µ g/107 셀) 추가 합니다. 얼음에 30 분 동안 펠 릿을 품 어 하 고 어둠 속에서 그들을 때때로 흔들어.
    7. 튜브를 HBSS의 2 개 mL를 추가 합니다. 실시간에서 5 분 동안 470 x g 에서 튜브 원심
    8. 삭제는 상쾌한 고 HBSS 및 이상으로 원심 분리기의 1 mL와 함께 모든 알갱이 resuspend. supernatants 삭제 합니다. HBSS의 200 µ L에서 단일 얼룩 aliquots의 펠 릿을 resuspend. HBSS (20 x 106 셀/mL)에서 관 B의 펠 릿을 resuspend.
    9. 얼음에 샘플을 유지 하 고 정렬까지 빛 으로부터 보호.
  2. Cytometry로 정렬
    1. 살 균 1.5 mL 튜브 HBSS 포함 하 여 2%의 500 µ L 정렬 준비 FBS.
    2. 죽은 세포를 제외 하려면 10 분 동안 얼음에 7 aminoactinomycin d (7-AAD) (0.15 µ g/106 셀) 셀 얼룩.
    3. 다음 설정을 사용 하 여 심장 SP 정렬: Hoechst 350 nm (UV) 여기를 사용 하 여 자극, 450/50 nm 대역 통과 필터 (Hoechst 블루)와 670/30 nm 대역 통과 필터 (Hoechst 레드), 형광 방출 수집 및 100 µ m의 노즐 크기의 압력을 사용 하 여 15 psi입니다.
    4. 분석을 위해 기록 5 x 105 정렬 샘플에 대 한 1 x 105 이벤트와 부정적인 제어, verapamil 제어 및 단일 얼룩에 대 한 샘플.
      참고: 심장 SP는 약 0.5%-2% (그림 1 H) 하지만 수 있습니다 실험실과 분리 사이 다. Sca-1+/CD31- 분수는 약 1%-11%의 총 심장 SP (그림 1I) 하지만 실험실과 분리 사이 다를 수 있습니다. Sca-1+/CD31- SP Cpc는 SP-프로토콜의 다음 부분에 대 한 Cpc로 작성 됩니다.

5. 기본 문화 격리 된 SP-Cpc의

참고: 미디어의 세 가지는이 프로토콜에 사용 되었다. 그들은 이라고 합니다 매체 1 (에 따르면 Noseda 외.) 8, 보통 2, 중간 3는 그들의 구성에 관한 자료의 테이블에 에서 설명 된.

  1. 매체를 사용 하기 전에 1 37 ° C 따뜻하고 진정 4 ° c 원심 분리기 4 ° C와 470 x g 6 분에 대 한 정렬 튜브 원심 및 매체 1에서 셀 resuspend.
  2. 4 매체 1 mL와 가스 침투성 P60 접시에 셀을 넣어. 셀에는 70%-80% 합류에 도달 했습니다 때까지 매체 마다 3 d를 변경 합니다.
    참고: 단계 5.2 약 2-3 주를 걸릴 수 있습니다.

6. 확장 및 SP Cpc의 차별화

  1. 세포 배양
    1. 3 x 105 SP-Cpc T75 플라스 크에 중간 1 8 mL에 문화.
    2. 70%-80% 합류, 변화는 매체 마다 2-3 d까지 5% CO2 와 37 ° C에서 SP-Cpc를 품 어.
      참고: 셀 번호 Cpc 사용의 유형, 배 시간 및 셀 크기에 따라 수정 해야 합니다.
  2. SP-클릭 당 성장과 다른 혈 청 농도에서 생존
    1. 문화-Cpc SP 매체 1의 8 mL와 T75 플라스 크에 2-3 d. 신중 하 게 매체를 발음 하 고 따뜻한 (37 ° C) HBSS의 5 mL로 부드럽게 씻어.
    2. 셀 셀 인큐베이터에서 5 분에 대 한 트립 신-EDTA의 5 mL을 취급, 트립 신 활동 중지 중 1의 5 mL을 추가 하 고 15 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 전송.
    3. 470 x g 실시간에 5 분 동안에 세포를 원심
    4. 매체 1 또는 매체 2 (혈통 유도 매체) 및 플레이트 2.5 x 105 SP-Cpc 다른 혈 청 농도 포함 하는 매체의 3 mL와 P60 요리에 셀 resuspend
    5. 매체 1 또는 보통 2 배양의 2 d 후 15 mL 튜브에 죽은 세포의 컬렉션에 대 한 단계 6.2.4의 접시에서 매체를 수집 합니다.
    6. 6.2.2 단계 에서처럼 부착 셀 trypsinize 고 단계 6.2.5의 15 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 수집 합니다. 840 x g 실시간에 5 분 동안에 세포를 원심
    7. 발음은 상쾌한 고 셀 카운팅을 위한 매체 1 또는 보통 2의 1 mL를 추가 합니다. SP-Cpc trypan 파랑 (0.4%)와 수 trypan 블루 양성 (죽은) 및 trypan 블루 제외 (가능한) 세포 얼룩.
      참고: 셀 생존 (6.2.7 단계) 총 휴대폰 번호에 관하여 trypan 블루 제외 휴대폰 번호도 제공 됩니다.
  3. 내 피 분화의 유도
    1. 10 µ g/mL laminin (LN) 또는 fibronectin (FN)와 (6-잘) 문화 접시 precoat
      1. 10 µ g/mL LN 또는 FN의 F12 매체 (또는 PBS)를 포함 하는 기판 솔루션을 확인 합니다. 각 우물에 기판 솔루션의 2 개 mL를 추가 합니다. 37 ° c.에 30 분 동안 접시를 유지
      2. 접시에서 솔루션을 발음 하 고 추가 2 mL PBS의 각 잘까지 그것을 사용 하 여.
    2. 단계의 6.1.2 세포에서 매체를 발음 부드럽게 따뜻한 (37 ° C) HBSS의 5 mL로 씻, 셀 인큐베이터에서 5 분에 대 한 트립 신-EDTA의 5 mL와 함께 그들을 치료, 추가 5 mL 매체 1 트립 신 활동을 중지 하 고 15 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 전송.
    3. 470 x g 실시간 Aspirate는 상쾌한에 5 분 동안에 세포를 원심 고 셀 카운팅을 위한 매체 2를 추가 합니다.
    4. 씨앗 8 x 104 셀 당 보통 2의 3 mL와 코팅된 접시에 잘 고 매체 3의 3 mL를 20-24 h. 변화는 매체에 대 한 37 ° C에서 유지.
      참고: 것이 좋습니다 낮은 혈 청 농도 포함 하는 매체를 사용 하 여-보충 없이-첫 번째 20-24 h에 대 한. 사용 하는 것이 좋습니다 < 60% 셀 합류 (즉, 단계 6.3.4의 셀 번호 셀 크기와 성장 속도 따라 조정 될 수 있다).
    5. 21 d 셀 문화 고 매체 마다 3 d를 변경 합니다.
    6. 폰 Willebrand 같은 내 피 표시와 함께 그들을 착 색 하 여 차별화 된 세포의 내 피 자연 확인 인자 (vWF) 및 공연 형광 현미경 검사 법.
      1. 1 mL의 PBS로 세포 세척 하 고 실시간에 2 분 3.7% 포름알데히드에 셀 수정
      2. 30 분 동안 ddH2O (PBS)에 0.1% 트리톤 X 세포를 permeabilize 및 실시간에서 1 시간에 대 한 10% 염소 혈 청으로 차단
      3. 안티 폰 Willebrand 인자 항 체 (1: 100) 4 ° C에서 48 h에 대 한 셀을 품 어
      4. 3 셀을 씻고 10 분 때마다 PBS의 1 mL x. 어둠 속에서 RT에 1 시간에 대 한 알 렉 사 Fluor 546 염소 안티 토끼 이차 항 체 (1: 500)와 그들을 품 어.
      5. 각각 10 분 동안 세척 다시 3 x 1 mL의 PBS와 함께. 어둠 속에서 RT에 5 분 동안 4'6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI; 1: 500)와 세포 핵을 얼룩.
      6. 3 세포를 씻어 각, 5 분 x 1 mL의 PBS와 함께. 셀을 탑재 하 고 4 ° C에서 저장
        참고: 단계 6.1 및 6.3 자란 조건 (기판, 매체, 추가 시 약 및 FBS 농도)는 그림 3에 설명 되어 있습니다.
  4. 관 형성 분석 결과
    1. 준비 하는 지하실 멤브레인 매트릭스 (예를 들어, 이제 매트릭스 라고 Matrigel) 접시.
      1. 밤새 4 ° C에서 매트릭스를 녹여.
      2. 코트와 얼음에 매트릭스의 100 µ L 96 잘 접시.
        참고: 행렬에서 모든 거품을 피하기 위해 중요 하다. 판은 매트릭스의 jellification을 피하기 위해 얼음에 코팅 해야 한다.
      3. 30 분 동안 37 ° C에서 접시를 유지 합니다.
    2. (단계 6.3.5 완료) 후 세포에서 매체를 발음, 부드럽게 따뜻한 (37 ° C) HBSS의 5 mL로 세포를 헹 구 고 트립 신-EDTA 셀 인큐베이터에서 5 분 그들을 치료. 트립 신 활동을 중지 하 고 15 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 매체 3를 추가 합니다.
    3. 470 x g 실시간 Aspirate는 상쾌한에 5 분 동안에 세포를 원심, 부드럽게 매체 3 및 피펫으로 1 mL를 추가 합니다.
    4. 35 µ m 셀 스 트레이너와 셀 필터링 하 여 셀을 집계 하는 경우.
    5. 셀을 계산 하 고 2 x 103 4 x 103 셀에 각 매트릭스-잘 코팅 매체 3의 100 µ L 씨. 16 h에 대 한 셀 인큐베이터에서 37 ° C에서 접시를 유지.
    6. 2 배 확대에 밝은 분야 현미경 사진을 가져가 라.
      참고: 불완전 한 trypsinization 경우 7-8 분의 최대 트립 신-EDTA에 노출 시간을 연장 됩니다.

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결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

마우스 SP-클릭 당 절연:

이 연구에서 우리는 마우스 Cpc 반면 쥐 Cpc에서 결과 수정 및 권한 (그림 8)33와 이전 보고서에서 추가 SP 형에 따라 격리를 사용 합니다.

다른 혈 청 농도 높고 낮은 세포 밀도에서 세포 증식:

우리의 이전 연구가 보여주었다 심장 혈통 마커 mRNA 표현 단계를 경작 하는 첫 번째 24 시간에서 변경. 세포 외 매트릭스 내 피 분화35를 포함 한 세포 운명 결정에 영향을 미치는 알려져...

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토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜의 장점:

이 프로토콜에는 Cpc의 내 피 분화 기술을 제공합니다. 우리는 낮은 혈 청 농도 낮은 세포 밀도 내 피 분화, 그것에 의하여 LN 판명 FN이이 조건 하에서 보다 더 적합 한 기판의 효율을 높일 수 발견. 우리가 사용 하는 Cpc의 두 가지 유형: 쥐 Cpc, 셀 라인 같은 방식으로, 및 마우스 SP Cpc에 사용 했다, 분리 하 고 확장 했다. 특히, 프로토콜 모두에 적용 되는 Cpc. 현재의 기술을 분리 하 고 확장 기본 Cpc 유전자 변형된 마우스 및 전 임상 질병 모델에서 뿐만 아니라 인간28,36에서 과학자를 허용. 이 프로토콜을 사용 하 여 격리 된 Cpc에 뿐만 아니라 질병 메커니즘의 수사 뿐만 아니라 소설 치료 대상의 탐험에 도움이 수 있습니다.

Cpc는 현재 임상 테스트 대 한 세포 치료

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 없다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 실험 및 생물의 약 학과 (DBM), 대학 및 대학 병원 바젤 Flow Cytometry 시설에서 직원 도움이 그녀의 지원에 대 한 베라 로렌스를 감사합니다. 이 작품은 숙박에 트랙 프로그램에 바젤의 대학에서 (Michika 모치즈키) 지원 되었다. 가브리엘라 M. Kuster 스위스 국립 과학 재단 (보조금 번호 310030_156953)에서 교부 금에 의해 지원 됩니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Culture 배지
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)ThermoFisher#12440
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 HamMerck#D8437
Penicillin-Streptomycin (P/S)ThermoFisher#15140122
Fetal Bovine 혈청 (FBS)Hyclone#SH300713.5 % (혈통 유도 0.1 %)
L- 글루타민 ThermoFisher#25030최종 농도 2 mM
글루타티온Merck#G6013
재조합 인간 표피 성장 인자 (EGF)Peprotech#AF-100-15
재조합 염기성 섬유아세포 성장 인자 (FGF)Peprotech#AF-100-18B
B27 보충제ThermoFisher#17504044
심장 자극 호르몬 1 Peprotech#250-25
ThrombinDiagontech AG, Switzerland#100-125
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-)ThermoFisher#14170
0.05 % Trypsin-EDTAThermoFisher#25300
T75 FlaskSarstedt#83.3911
Endothelial differentiation   
Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKitLonza#CC-3162
Ham's F-12K (Kaighn's) MediumThermoFisher#21127
Laminin 머크#L2020
피브로넥틴 Merck#F4759ddH2O
6웰 플레이트Falcon#353046
포름알데히드 용액Merck#F1635Diluite 1:10 in PBS (3.7% 최종 농도)Triton
X-100Merck#93420ddH2O
Normal Goat Serum (10%)ThermoFisher#50062Z
Anti-von Willebrand Factor 항체Abcam#ab699410% 염소 혈청
염소 항 토끼 IgG, Alexa Fluor 546ThermoFisher#A110101:500 10% 염소 혈청
4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI)ThermoFisher#622471:500 ddH2O 
SlowFade Antifade KitThermoFisher#S2828
BX63 광시야 현미경Olympus
Tube formation
96 Well PlateFalcon#353072
5 ml Round Bottom Tube with Strainer CapFalcon#352235
Matrigel Growth Factor ReducedCorning#354230
IX50 광시야 현미경Olympus
Sca-1+/CD31- 심장 측 인구 격리34 
시약
Pentobarbital Natrium 50 mg/ml ad usum 수의사.사내 병원 약국#9077862작업 솔루션: 200 mg/kg
인산염 완충 식염수 (PBS) CaCl2(-), MgCl2(-)ThermoFisher#20012
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-), 페놀 레드 (-)ThermoFisher#14175Collagenase B 활성을 담금질하기 위해 HBSS 500 mL + 2% FBS  준비 
Dulbecco의 Modified Eagle's Medium (DMEM) 1g/L의 D-글루코스, L-글루타민, 피루브산ThermoFisher#331885DMEM + 10% FBS를 준비합니다  + 25 mM HEPES+ P/S를 Hoechst stanining
Penicillin-Streptomycin에 사용합니다. (P/초)ThermoFisher#15140122
HEPES 1 MThermoFisher#15630080최종 농도 25 mM
소 태아 혈청(FBS)Hyclone#SH30071
RBC LysisBuffer(10X)BioLegend#420301/100mLddH2O에서 1X로 희석하고 0.2 µ를 통해 여과합니다. m 필터
Collagenase BMerck#11088807001HBSS에서 최종 농도 1mg/mL, 0.2 µ를 통해 여과; m 필터
bisBenzimide H33342 Trihydrochloride (Hoechst)Merck#B2261에 1 mg/mL를 준비하십시오
.Merck#V4629최종 농도 83.3 &마이크로; 남 
APC 쥐 안티 마우스 CD31BD Biosciences#5512620.25 µ g/107cells
FITC 쥐 안티 마우스 Ly-6A/E (Sca-1)BD Biosciences#5574050.6 µ g/107cells
7-Aminoactinomycin D (7-ADD)ThermoFisher#A13100.15 &마이크로; g/106cells
APC 쥐 IgG2a k 동종 제어BD Biosciences#5539320.25 &마이크로; g/107cells
FITC 쥐 IgG2a k 동형 대조군BD Biosciences#5546880.6 µ g/107cells
Material
Needles 27GTerumo#NN-2719R
바늘 18GTerumo#NN-1838S
일회용 주사기 1 mL sterileCODAN#62.1640
Transferpipette 3.5 mLSarstedt#86.1171.001
Cell 스트레이너 40 & 마이크로; m 블루BD 바이오사이언스 #352340
세포 여과기 100 &마이크로; m yellowBD Biosciences#352360
Lumox Dish 50Sarstedt#94.6077.305
Culture Dishes P100Corning#353003
Culture Dishes P60Corning#353004
Mouse
Line>Age번식
C57BL/6NRj / 수컷12주사내
제품명Company카탈로그 번호
Reagents
Iscove의 Modified Dulbecco's Medium (IMDM)ThermoFisher#12440
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/영양 혼합물 F12 HamMerck#D8437
Penicillin-Streptomycin  (P/초)ThermoFisher#15140122
Fetal Bovine Serum (FBS)Hyclone#SH30071
L-Glutamine ThermoFisher#25030
글루타티온Merck#G6013
B27 보충제ThermoFisher#17504044
재조합 인간 표피 성장 인자 (EGF)Peprotech#AF-100-15
재조합 기본 섬유아세포 성장 인자 (FGF)Peprotech#AF-100-18B
심장 영양 호르몬 1 Peprotech#250-25
ThrombinDiagontech AG, 스위스 #100-125
내피 세포 성장 배지(EGM)-2 BulletKitLonza#CC-3162
배지 조성물 개요. 이 정보 중 일부는 위에 제공된 것과 동일하지만 미디어 1-3의 구성에 따라 정렬됩니다.
제품 이름Medium 18Medium 2Medium 3
ReagentsCultureLineage inductionEndothelial diff.
Iscove의 변형된 Dulbecco's Medium (IMDM)35%35%
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/영양 혼합물 F12 햄65%65%
페니실린-스트렙토마이신  (P/초)1%1%
태아 소 세럼 (FBS)3.5%≤ 0.1%
L-글루타민 2 mM2 mM
글루타티온0.2 nM0.2 nM
B27 보충제1.3%
재조합 인간 표피 성장 인자 (EGF)6.5 ng/mL
재조합 기본 섬유아세포 성장 인자 (FGF)13 ng/mL
심장 영양 1 0.65ng/mL
트롬빈0.0005 U/mL키트에 포함된 모든 필수 구성 요소
EGM(Endothelial Cell Growth Medium)-2 BulletKit키트에 포함된 모든 필수 구성 요소
에 희석 중 0.1% ddH2O Verapamil-hydrochloride 

참고문헌

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