신호 분석 및 바이오 마커 발견 하는 단일 셀에 대 한 형광 셀 바코드와 인 Cytometry

Summary

여기, 세포 수준에서 단백질 인 산화 이벤트의 중간-높은 처리량 분석을 위한 프로토콜 제공 됩니다. 인 cytometry 신호 차 특성, 식별 바이오 마커, 유효성을 검사 하 고 pharmacodynamics를 평가 하는 강력한 접근 이다.

Abstract

벗어난 셀 신호 암 개발 및 진행에 중심 역할을 하고있다. 가장 새로운 표적으로 한 치료는 실제로 단백질 및 단백질 기능에서 감독과 셀 신호 착오 따라서 맞춤된 치료 옵션을 나타내는 생체 역할 수 있습니다. DNA와 RNA 분석, 반대로 변화 단백질 활동에 보다 효율적으로 기본 약물 감도 및 저항 메커니즘을 평가할 수 있다. 인 cytometry 단백질 인 산화 이벤트는 세포 수준에서 다른 항 체 기반 접근에서이 메서드를 구별 하는 중요 한 기능을 측정 하는 강력한 기술입니다. 메서드는 여러 신호 전달 단백질의 동시 분석에 대 한 수 있습니다. 형광 세포 바코드와 함께, 짧은 시간에 표준 cytometer 하드웨어에 의해 더 큰 매체-높은 처리량 데이터 집합을 취득 수 있습니다. 인 cytometry 응용 프로그램 기본 생물학의 연구와 임상 연구에서, 신호 분석, 바이오 마커 발견과 pharmacodynamics의 평가 포함 하 여 있다. 여기, 자세한 실험 프로토콜의 예를 들어 만성 림프모구 백혈병 세포를 사용 하 여 순화 된 말 초 혈액 단 세포 인 흐름 분석을 위해 제공 됩니다.

Introduction

인 cytometry는 단일 셀 해상도 단백질 인 산화 수준을 분석 하는 데 사용 됩니다. 방법의 전반적인 목표는 지정 된 조건에서 세포 신호 패턴을 지도. Cytometry multiparameter 용량을 이용 하 여 여러 신호 전달 경로 말 초 혈액 등 다른 유형의 세포 인구의 다른 하위 집합에 동시에 분석할 수 있습니다. 이러한 특성에는 다른 항 체 기반 기술 immunohistochemistry, 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA), 단백질 배열 등 역 위상 단백질 배열 (RPPA)¹에 비해 이점을 제공합니다. 인 cytometry 형광 세포 바코드 (FCB)를 함께 혼합, 스테인드 하 수 단일 샘플²분석 개별 셀 샘플 형광 염료의 독특한 서명으로 표시 됩니다 즉 결합 될 수 있다. 이 항 체 소비 감소, 제어 및 치료 샘플의 조합을 통해 데이터 안정성을 증가 하 고 수집의 속도 향상 시킵니다. 결합 된 FCB 인구 다음 작은 샘플을 나누어 하 고 최대 35 가지 인 특정 항 체, 시작 물자의 양에 따라 물 들일 수 있습니다. 대형 프로 파일링 실험, 표준 cytometer 하드웨어로 실행할 수 있습니다. 인 cytometry 만성 림프모구 백혈병 (CLL)^3,,45, 급성 골수성 백혈병 (AML)을 포함 한 여러 혈액 암에서 환자 샘플에서 통로 신호 하는 프로 파일에 적용 된 ⁶ 과 비 Hodgkin 림프 종⁷. 인 cytometry 따라서 신호 차 특성, 식별 및 바이오 마커, 유효성 평가 하 pharmacodynamics 강력한 접근 이다.

여기, 인 cytometry에 의해 CLL 환자 샘플의 분석을 위해 최적화 된 프로토콜 (그림 1A) 제공 됩니다. 기저 신호 특성화, 안티-IgM/B 세포 수용 체 자극 및 약 섭 동 예 표시 됩니다. FCB 매트릭스에 대 한 자세한 설명이 제공 됩니다. 프로토콜은 쉽게 다른 현 탁 액 셀 형식에 적용할 수 있습니다.

Protocol

혈액 샘플은 모든 기증자 로부터 서 면된 동의 따라 접수 됐다. 연구는 의료 및 건강 연구 윤리의 남쪽-동쪽 노르웨이 지역 위원회에 의해 승인 되었다 하 고 인간의 피에 대 한 연구⁸헬싱키 선언 따라 실시 됐다.

참고: 1-3 단계 조직 문화 후드에서 무 균 조건 하에서 수행 되어야 합니다.

1. 절연 CLL 환자 혈액 샘플에서 주변 혈액 단 셀 (PBMCs)

주의: 인간의 피는 Biosafety 수준 2에 대 한 규정에 따라 처리 되어야 합니다.

1. 혈액 인산 염 버퍼 식 염 수와 1:1 희석 (PBS: 136.9 m NaCl, 2.7 m m KCl, 10.1 m m 나₂HPO₄ x 2 H₂O, 1.8 m m KH₂포₄, pH 7.4 m) 및 50 mL 튜브 (30 mL/튜브)에 전송.
2. 신중 하 게 10 mL 피 펫을 사용 하 여 튜브의 하단에 10 mL 밀도 그라데이션 매체 (예, Lymphoprep)의 레이어.
3. 4 ° c.에 20 분 동안 800 x g에서 원심 분리기 PBMCs는 지금 밀도 그라데이션 중간 계층의 위에 볼 수 있습니다.
4. 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 두 개의 새로운 50 mL 튜브에 세포를 전송. PBS (튜브를 채우기) 두 번 씻어.
5. 350 x g 15 분 삭제는 상쾌한에 centrifuge 고 3 ml PBS의 resuspend.
6. 선호 하는 방법을 사용 하 여 셀을 계산 합니다.
7. 350 x g 5 분 삭제에 대 한에 셀은 상쾌한 원심. 참고: 1.8 3.2 단계는 선택적입니다. 3.3 단계에 직접 진행이 가능 하다.
8. Resuspend 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 10% 디 메 틸 sulfoxide (DMSO) 보충에 있는 세포 및 곳을 알아내는 튜브를 사용 하 여 적합 한 aliquots에 아래로 동결.
   참고: DMSO는 세포에 독성이 있다. 셀 FBS/DMSO와 혼합 되어 한번에 빨리 작동. 셀 액체 질소에 긴 기간 저장된 될 수 있습니다.

2. 셀의 해빙

1. 신속 하 게 녹여 37 ° C 물 욕조에 셀.
   참고: DMSO는 세포에 독성이 있다. 빨리 DMSO에 노출을 제한 하는 작업.
2. 셀 (RPMI 1640 추가 GlutaMAX 참조 테이블의 자료) 차가운 로스웰 파크 기념 연구소 매체의 10 mL을 한번 씻어.
3. 5 분에 대 한 300 x g에서 원심 분리기는 상쾌한을 삭제 합니다.
4. Resuspend 나트륨 pyruvate, MEM 비필수 아미노산 및 페니실린/스 (지시에 따라 1 x 희석에 추가)와 10% 보충 RPMI 1640 매체에 셀 FBS. 작은 세포 배양 플라스 크에 세포를 전송 하 고 5% CO₂, 보정 셀 수 있도록 1 시간 동안 37 ° C 배양 기에서 두고.

3입니다. 셀의 준비

1. 선호 하는 방법을 사용 하 여 가능한 셀을 계산 합니다.
2. 50 mL 튜브에 세포를 전송 및 5 분에 대 한 300 x g에서 원심 분리기는 상쾌한 삭제.
3. 1% 보충 RPMI 1640 매체 (단계 2.2)에 셀 resuspend 더 이상 50 x 10⁶ 셀/ml FBS.
4. 96 잘 V 하단 플레이트에 웰 스에 세포 현 탁 액의 필요한 금액을 전송 합니다.
   참고: 우물의 수 테스트 조건의 수에 해당 합니다. 자극 시간 코스에 대 한 샘플에서 단일 잘 그려집니다. 시간-포인트 + 죽은 볼륨의 50 µ L 당 50 µ L 샘플을 계산 합니다. (한 흠 없는 샘플 + 바코드 염료 당 하나의 샘플) 보상 컨트롤에 대 한 샘플을 저장 합니다.
5. 37 ° C를 미리가 열된 물 욕조에 96 잘 접시를 전송. 10 분에 대 한 셀을 휴식.

4. 자극과 셀의 고정

참고: (즉, 하지 무 균) 실험실 벤치에 4-8 단계를 수행 합니다.

주의: 수정 버퍼의 주요 성분입니다 독성 paraformaldehyde (흡입 및 피부 접촉). 관심을가지고 처리 합니다.

1. 고정 버퍼의 60 µ L 96 잘 V 하단 플레이트를 준비 나 잘 샘플 당 당. 37 ° C 물 목욕에 남겨 주세요.
   참고: 셀: 수정 버퍼 1:1 이어야 한다. 37 ° C에 증발을 허용 하기 위하여 수정 버퍼는 처음에 풍부 하 게.
2. 필요에 따라 셀 자극 하기 전에 마약을 취급 합니다.
3. 50 µ L 컨트롤 샘플 수정 접시에 전송 합니다. 아래로 pipetting으로 혼합.
4. 필요에 따라 셀에 10 µ g/mL 안티-IgM를 추가 하 여 자극 시간 과정을 시작 합니다. 아래로 pipetting으로 혼합.
5. 각 시간 점에서 50 µ L 샘플 수정 접시에 전송. 아래로 pipetting으로 혼합.
   참고: 안티-IgM 유도 일반적으로 일찍 시작 신호 (분).
6. 마지막 샘플 추가 된 후 10 분 동안 37 ° C에서 수정 접시를 남겨 주세요.

5. 형광 셀 바코드 (FCB)

참고: 바코드 시 약의 목록은 표 1 을 참조 하십시오.

1. 고정된 셀 3 워시 x PBS (우물을 채우기).
2. 5 분에 대 한 500 x g에서 원심 분리기는 상쾌한을 삭제 합니다.
3. 시 약 바코드와 96 잘 V-아래 접시를 준비 합니다. 피펫으로 5 µ L 조합 얼룩 얼룩 매트릭스, 예를 들어, 그림 1B에서 다음 모든 샘플 하는 데 필요한 수에 잘 당 각 바코드 시 약의. 각 샘플은 다른 바코드 농도의 독특한 조합이 있을 것 이다.
4. PBS 및 바코드 접시에 전송의 190 µ L 셀 resuspend 철저 하 게 혼합.
   참고: 각 바코드 시 약 사용 높은 최종 농도와 하나의 보상 샘플을 얼룩 그리고 한 흠 없는 샘플 저장.
5. 어둠 속에서 실 온에서 20 분에 대 한 셀을 둡니다.
6. 씻으십시오 스테인드 셀 2 흐름 세척 (PBS, 1 %FBS, 0.09% 나트륨 아 지 드)와 x (우물 채워).
7. 5 분에 대 한 500 x g에서 원심 분리기는 상쾌한을 삭제 합니다.
8. 셀에 흐름 세척의 190 µ L을 추가 하 고 결합 한 15 mL 튜브에 바코드 샘플. 별도 1.7 mL 튜브 각 보상 제어 전송.
9. 5 분에 대 한 500 x g에서 원심 분리기는 상쾌한을 삭제 합니다.

6. 세포내 항 원 얼룩에 대 한 Permeabilization 셀

주의: 페름 버퍼 III의 주요 성분이 이다 메탄올 독성 (흡입 및 피부 접촉)과 연. 관심을가지고 처리 합니다.

1. 15 mL 튜브에 파 마 버퍼 III의 2 개 mL를 전송. 그래서 사용 시 얼음은-20 ° C에 둡니다.
   참고: 페름 버퍼 실험의 시작에서-20 ° C에서 남아 있을 수 있습니다.
2. 바코드 셀 인구 (15 mL 튜브)에 얼음 처럼 차가운 페름 버퍼의 1.5 mL 및 100 µ L를 추가할 각 보상 컨트롤 (1.7 mL 튜브) drop-wise 세포 덩어리 같이 피하려고 vortexing 동안.
3. 셀-80 ° c.에 직접 전송 최소 30 분 동안 둡니다.
   참고: 그것은 시점에서 실험을 일시 중지 하는 자연입니다. 셀 파 마 버퍼에 저장 된 장기-80 ° c.에 수 있습니다.

7. 항 체 얼룩이 지기

참고: 보고 인 특정 항 체의 목록 테이블의 자료 를 참조 하십시오.

1. -80 ° C에서 얼음의 상자 셀을 전송.
2. 씻어 3 배 흐름 세척.
   참고: 참조 셀 펠 릿을 초과에서 흐름 세척을 추가 하는 것이 중요 하다, 예를 들어, 각 보상 제어 흐름 세척 바코드 세포 인구를 1 mL의 3 개 mL를 추가.
3. 4 ° c.에서 5 분 동안 500 x g에서 원심 분리기 폐기는 상쾌한.
4. 인 항 체 얼룩 당 세포 현 탁 액의 25 µ L를 수 있는 흐름 세척의 볼륨에 바코드 셀 인구 resuspend. 보상 제어 흐름 세척의 200 µ L에서 resuspend.
5. 96 잘 V 하단 플레이트에 얼룩에 대 한 항 체를 준비 합니다. 마지막 볼륨 50 µ L/잘 될 것입니다. 잘, 당 10 µ L, 표면 표식 15 µ L, 그리고 세포 현 탁 액의 25 µ L의 최종 볼륨을 흐름을 세척에 희석의 최종 볼륨을 흐름을 세척에 희석 인 특정 항 체를 추가 합니다.
   참고: 항 체 희석 실험 전에 적정 한다. Isotype 컨트롤을 포함 합니다.
6. 어둠 속에서 실 온에서 30 분에 대 한 셀을 둡니다.
7. 씻으십시오 스테인드 셀 2 x 흐름 세척 (우물을 채우기).
8. 5 분에 대 한 500 x g에서 원심 분리기는 상쾌한을 삭제 합니다.
9. 셀의 흐름 워시 150 µ L에 resuspend

8입니다. 보상 컨트롤의 준비

1. 항 체 활용 된 형광 항 체 염색 법 병행에서에 대 한 보상 컨트롤을 준비 합니다. 공급 업체의 지침에 따라 보상 구슬을 사용 합니다.

9. 교류 Cytometry 분석

참고: 실험은 교류 cytometer는 높은 처리량 샘플러 (HTS)와 함께 실행할 수 있습니다.

1. 광 전 증폭 관 관 (PMT) 전압 흠 없는 컨트롤을 최적화 합니다.
2. 보상 제어를 실행 하 고 보상 매트릭스를 계산 합니다.
3. 샘플을 실행 합니다. 이벤트 비율이 악기 사양에 따라 해야 합니다.

10. 게이팅 전략 및 데이터 분석

1. FlowJo 또는 Cytobank (https://cellmass.cytobank.org) 같은 흐름 cytometry 분석 소프트웨어에 실험에서 FCS 파일을 가져옵니다.
2. 제어 전략
   1. SSC-A 대 그려서 림프 톨을 선택 밀도 점 플롯에 FSC-A.
   2. 세포를 표시 하 고 SSC-A 대 FSC-W. 그려서는 singlets를 선택
   3. 단일 셀과 게이트 SSC-A 대 표면 마커 그려서 입력 하는 셀을 표시 합니다.
   4. SSC A 밀도 음모 대 태평양 블루 셀 유형 인구를 표시 하 고 그들의 태평양 파랑 얼룩 강도에 따라 다른 FCB 인구 선택 ( 그림 1A참조).
   5. 인 항 체 채널 또는 있는 heatmap FCB 채널에 대 한 플롯 ( 그림 1A)를 참조 인 산화 이벤트 표시.
3. 인-신호 인 신호 대 isotype 컨트롤의 MFI (중간 형광 강도)의 역 하이퍼볼릭 사인 (arcsinh)를 사용 하 여 계산 (기저 인 산화 수준 그림 1D참조), 또는 자극 대 의 unstimulated 세포 인구 ( 그림 1E참조).

Results

인 흐름 cytometry 프로토콜의 주요 단계는 그림 1A에 설명 됩니다. 제시 예에서 CLL 세포 4 희석에 바코드 시 약 태평양 블루와 스테인드 했다. 3 차원 바코드 그림 1B에서 볼 수 있듯이 3 barcoding 염료를 결합 하 여 수행할 수 있습니다. 개별 샘플은 다음 후속 게이팅 각 바코드 시 약 대 SSC-A (그림 1C)에 의해 deconvoluted. 바코드 시 약에 대 한 자세한 정보는 표 1에 나열 됩니다.

여기에 설명 된 절차에 따라 인 단백질 레벨 B 세포 CLL 환자와 다양 한 조건³일반 ...

Discussion

인 cytometry 단 세포에 있는 단백질 인 산화 수준을 측정 하는 강력한 기술입니다. 때문에 항 체와 얼룩에 의존 하는 방법, 인 cytometry 항 체 여부에 의해 제한 됩니다. 또한, 신뢰할 수 있는 결과 얻으려면, 모든 항 체 적정와 있어야 사용 하기 전에 확인 합니다. 인 특정 항 체의 적정에 대 한 자세한 프로토콜 되었습니다¹²설명 되어. 패널 디자인, 신호 대 잡음 비율의 배려가 중요 합니다. 제시 등 모든 인 항 체 알 렉 사 Fluor 647을 활용 했다. 이 fluorophore 종종 낮은 대 와 사이 최적의 미분 인 단백질의 높은 수준을 제공합니다. 또한, 인 단백질에 대 한 단 하나의 색상을 사용 하 여 다른 채널 것입니다 남아 있을 무료 FCB 및 표면 마커 얼룩. 이 패널 디자인 인 채널에 다른 일을 줄일 수 있습니다. 모든 인-항 체 같은 fluorophore를 활용 함으로써 데이터 분석 간소화 됩니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640 GlutaMAX	ThermoFisher Scientific	61870-010	세포 배양 배지
소 태아 혈청	ThermoFisher Scientific	10270169	세포 배양 배지에 첨가
피루브산 나트륨	ThermoFisher Scientific	11360-039	세포 배양 배지
MEM 비필수 아미노산	ThermoFisher Scientific	11140-035	세포 배양 배지에 첨가제
Lymphoprep	Alere Technologies AS	1114547	밀도 구배 매체
Anti-IgM	Southern Biotech	2022-01	B 세포 수용체 BD
Phosflow Fix Buffer I	BD	557870	고정 완충액
BD Phosflow Perm Buffer III	BD	558050	Permeabilization buffer
Alexa Fluor 488 5-TFP	ThermoFisher Scientific	A30005	바코드 시약
퍼시픽 블루 숙시니미딜 에스테르	ThermoFisher Scientific	P10163	바코드 시약
퍼시픽 오렌지 숙시니미딜 에스테르, 트리에틸암모늄 염	ThermoFisher Scientific	P30253	바코드 시약
보상 비드	사용자에 의해 정의됨		올바른 종 반응성
Falcon tubes	user
Eppendorf tubes
96 well V-bottom plates	Defined by user		flow Cytometer
Centrifuges	Defined by user		Eppendorf tubes, Falcon tubes and plates용
수조	사용자에 의해 정의됨		온도 조절
유세포 분석기	사용자에 의해 정의됨		HTS(High Throughput Sampler) 포함
Name	Company<	strong>카탈로그 번호	Comments
< strong>Antigen
AKT (pS473)	Cell Signaling Technologies	4075	Clone: D9E Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 Skå nland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9
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SAPK/JNK (pT183/Y185)	Cell Signaling Technologies	9257	Clone: G9 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothellip;, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
SLP76 (pY128)	Beckton Dickinson Pharmingen	558438	Clone: J141-668.36.58  참조: Skå nland et al., 2014, CD2 및 CD28을 통한 T-세포 공동 자극;, Biochem J, 460(3):399-410
STAT1 (pY701)	Beckton Dickinson Pharmingen	612597	Clone: 4a  Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770
STAT3 (pY705)	Beckton Dickinson Pharmingen	557815	Clone: 4/P-STAT3 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
STAT4 (pY693)	Zymed/ThermoFisher Scientific	71-7900	Clone: Polyclonal Reference: Uzel et al., 2001, 유세포 분석에 의한 세포 내 인산화 STAT-4 검출, Clin Immunol, 100(3): 270-6
STAT5 (pY694)	Beckton Dickinson Pharmingen	612599	Clone: 47/Stat5(pY694) Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skå nland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770
STAT6 (pY641)	Beckton Dickinson Pharmingen	612601	Clone: 18/P-Stat6 참고문헌: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
SYK (pY525/Y526)	Cell Signaling Technologies	12081	Clone: C87C1 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, 비장 티로신 키나아제 억제제 감소…, Haematologica, 101(2):e59-62
ZAP70/SYK (pY319/Y352)	Beckton Dickinson Pharmingen	557817	Clone: 17A/P-ZAP70 Reference: Skå nland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, 피, 129(6): 759-770