자세한 프로토콜 6-마커 멀티플렉스 면역 형광 패널 최적화 수행 위한 더 일관 된 결과를 짧은 절차 시간 자동된 염색기를 사용. 이 방법은 종양 면역 연구에 대 한 모든 실험실에 의해 직접 적응 될 수 있다.
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이 논문에서
요약
초록
종양 면역에서에서 지속적인된 개발 암 면역학의 메커니즘의 증가 이해를 필요합니다. 포 르 말린 조정의 파라핀 끼워 넣어진 (FFPE) 생 검에서 조직 샘플의 immunoprofiling 분석 종양 면역학의 복잡성을 이해 하 고 암 immunotherapy에 대 한 소설 예측 바이오 마커의 발견을 위한 주요 도구가 되고있다. Immunoprofiling 분석 조직 등 염증 성 세포 모집단 면역 검사, 종양 microenvironment에 결합 된 마커의 평가 필요 합니다. 소설 멀티플렉스 immunohistochemical 방법의 출현 보다 표준 수염 immunohistochemistry (IHC) 단일 조직 단면도의 더 효율적인 multiparametric 분석에 대 한 수 있습니다. 한 상용 멀티플렉스 면역 형광 (경우) 메서드는 tyramide 신호 증폭에 따라, multispectral 현미경 분석, 결합 조직에서 다양 한 마커의 더 나은 신호 분리에 대 한 수 있습니다. 이 방법론 표준 IHC FFPE 조직 샘플에 대 한 최적화 된 결합형된 기본 항 체의 사용과 호환 됩니다. 여기 우리가 자세하게에서 설명 멀티플렉스 수 있는 자동화 프로토콜 6-마커 다중 항 체 패널 구성 된 PD-L1, 암 조직 샘플의 라벨 경우 PD-1, CD68, CD8, 기-67, 및 4와 AE1/AE3 cytokeratins 6-diamidino-2-phenylindole 로 핵 셀 counterstain. 멀티플렉스 패널 프로토콜 착 시간을 수동 프로토콜의 보다 짧은 수 있습니다 직접 적용 고 인간의 FFPE 조직 샘플에 대 한 면역-종양학 연구에 대 한 모든 실험실 조사에 의해 적응에 대 한 자동된 IHC 염색기에 최적화 되어 있습니다. 또한 몇몇 컨트롤 및 도구, 새로운 다중 경우 패널의 좋은 품질 관리에 대 한 드롭-제어 방법을 포함 하 여 최적화 및 검증 기법에 대 한 유용한 있다.
서론
FFPE 종양 조직 샘플의 Immunoprofiling 분석 특히 발견 및 암 immunotherapy 임상 시험1의 맥락에 대 한 소설 예측 바이오 마커의 유효성 검사에 대 한 면역-종양학 연구의 필수 요소가 되고있다 ,2. 발 IHC, diaminobenzidine, 등 화학 chromogens를 사용 하 여 진단 병리학 생 검 조직의3의 immunolabeling에 대 한 표준 기술에 남아 있다. 표준 IHC 암 조직 immunoprofiling, 종양 관련 된 림프 톨의 부분 모집단 그리고 프로그램 된 세포 죽음 ligand 1 등 면역 검사점의 식 수준 평가 (PD-L1)4의 정량 등도 사용할 수 있습니다. ,5. 그러나 표준 IHC 제한 됩니다,, 그 하나의 항 원 조직 섹션 당 표시 될 수 있습니다. Immunoprofiling 연구는 일반적으로 여러 마커의 결합된 식의 분석 필요, 표준 IHC 사용 여러 조직 단면도의 얼룩이 지기 요구, 각 하나의 표식으로 물 될 것 이다, 실질적으로 중 핵 바늘 생 검 같은 작은 조직 샘플....
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프로토콜
참고: 여기에 제시 된 프로토콜 6 항 체에 대 한 TSA를 사용 하 여 mIF 패널의 immunoprofiling를 수행 하는 방법에 설명 합니다 (CD68, ki67, PD-L1, PD-1, CD8, 및 AE1/AE3) 자동된 염색기에 ( 재료의 표참조). 프로토콜에는 새 mIF 패널의 품질 관리에 대 한 드롭 컨트롤을 수행 하는 방법을 설명 합니다 ( 보충 자료참조). 이 프로토콜을 얼룩이 지 인간의 편도 선 (긍정적인 제어)에서 8 개의 흠 없는 FFPE 슬라이드와 8 개의 흠 없는 슬라이드 인간 폐 선 암에서 수행 됩니다. 첫 번째 슬라이드 전체 멀티플렉스 모든 6 개의 마커, isotype 컨트롤에 없는 기본 항 체는 활용 하 고, 두 번째 슬라이드와 드롭 컨트롤 ( 보충 자료참조)에 대 한 나머지 6 슬라이드 얼룩에 사용 됩니다. 조직 autofluorescence에 대 한 추가 제어 좋습니다 및 멀티플렉스에 항상 포함 되어야 연구 ( 보충 자료참조). 그러나, 조사는 다른 종양 유형 및 그들의 자신의 프로젝트의 목표에 따라 컨트롤을 고용 수 있습니다. MIF TSA 메서드와 multispectral 스캐너 기술 이전 경험 없이 ....
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결과
여기에 설명 된 프로토콜은 그림 2에 표시 된 것과 같은 결과 제공할 것입니다. 편도 선 컨트롤, 표면 편평 세포 상피로 시작에 얼룩의 평가로 시작 합니다. 편도 선 샘플의 조직학 병리학 자, H & E 슬라이드를 참조 하 여 함께 검토할 수 있습니다. 비 IHC 섹션을 동일한 조직 블록에 동일한 표식으로 수행 하 고, 다음이 사용할 수 있습니다 밀도 및 mIF 슬라이드에 각 마커의 유통 확인 하. 그림 2A같이 편도 선 조직 명확 하 게 정의 된 AE1/AE3 cytokeratin 편도 선 표면 편평 상피에 얼룩을 제공 해야 한다 (그림 2A; 빨간 모조 색상으로 표시), 림프는에 배경 없이 조직입니다. 얼룩 세포질 막 음의 억양 법와 때때로 .......
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토론
지속적인 암 immunotherapy 혁명은 오프닝 소설과 유망 암 환자13에 대 한 치료 옵션. 면역-종양학 분야에서 발전 새로운 예측 생체를 찾을 뿐만 아니라 발암에 관여 하는 면역 메커니즘의 생물학을 이해 하는 것 뿐만 아니라 염증 성 종양 microenvironment의 증가 지식 필요 합니다. immunotherapy 기반 치료1,2. 때문에 암 면역학의 복잡 한 생물학, 종양 조직 샘플의 심문 일반적으로 하는 데 필요한 면역 표식, 서로 상호 작용 하 고 자주 조직1에에서 다양 한 세포 인구에 의해 coexpressed의 성장 목록을 개발합니다 ,,25. 임상 시험 일반적으로 작은 biopsies 코어 바.......
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공개 사항
이 작품은 MedImmune, 글로벌 biologics R & D 팔 아 스 트 라의에 의해 지원 되었다. C.W., K.R., 및 C.C.H.는 Perkin Elmer (TSA kit) 시 약을 생산 하 고이 작품에 사용 했던 multispectral 스캐너의 직원이 있습니다. 석사, K.D., 아, W.Z., C. Bagnall, C. 브라운, J.C., 앨 러 배 마, 캔사스, M.R., 및 J.R.C.는 주식 소유권 및 재고 관심사 또는 아 스 트 라 옵션 MedImmune의 직원.
감사의 글
편집 지원 MedImmune의 데보라 Shuman에 의해 제공 했다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 스펙트럼 불혼합 및 이미지 분석을 위한 "InForm 2.4.2" 소프트웨어 | PerkinElmer | CLS151066 | 텍스트에서 "스펙트럼 불혼합 소프트웨어"라고 함 |
| "Phenochart 1.0.9" MSI 선택 및 전체 슬라이드 스캔 보기를 위한 QPTIFF 소프트웨어 | PerkinElmer | CLS151067 | 에서 "QPTIFF 소프트웨어"라고 함 |
| Coverslips, | Sigma Aldrich | 2975246 | |
| 200 프루프 에탄올 | Koptec | V1001 | |
| 20x Tris-Buffered Saline | VWR | J640-4L | |
| 항체 희석제 | DAKO | S2203 | |
| Anti-CD68 마우스 단클론 | DAKO | M087601-2 | 클론 PG-M1 |
| Anti-CD8 Rabbit 단클론 | 벤타나 | M5392 | 클론 SP239 |
| Anti-CK 마우스 모노클로날 | DAKO | M351501-2 | 클론 AE1/AE3 |
| Anti-ki67 마우스 단클론 | DAKO | M724001-2 | 클론 MIB-1 |
| Anti-PD-1 토끼 단클론 | 세포 신호 | #86163 | 클론 D4W2J |
| Anti-PD-L1 토끼 단클론 | Ventana | 790-4905 | 클론 SP263 |
| 본드 듀왁스 용액 | Leica | AR9222 | 텍스트에서 "왁스 용액"이라고 함 |
| 본드 에피토프 회수 용액 1 | Leica | AR9961 | 텍스트: "ER1" |
| 본드 에피토프 회수 용액 2 | Leica | AR9640 | 텍스트: "ER2", |
| Bond Open Containers, 30 mL | Leica | OP309700 | "30 mL open containers" |
| 7 mL | Leica | OP79193 | "7 mL open containers"라고 함" 텍스트: |
| Bond Polymer Refine Detection | Leica | DS9800 | 텍스트: "발색 검출 키트" |
| Bond Research Detection Kit | Leica | DS9455 | 텍스트에서 "연구 검출 키트"라고 함 |
| Bond Titration Kit | Leica | OPT9049 | 텍스트: "적정 키트"라고 함 |
| Bond Universal Covertile Novocastra | Leica | S21.2001 | 텍스트에서 "covertiles"라고 부름 |
| Bond Wash Solution 10X Concentrate | Leica | AR9590 | 텍스트에서 "10x 세척 솔루션"이라고 부름 |
| BondRX Autostainer | Leica | 텍스트에서 "자동 염색기"라고 부름 | |
| BondRX 소프트웨어 버전 5.2.1.204 | Leica | 텍스트에서 "자동 염색기 소프트웨어"라고 부름 | |
| Opal 7-Color Automation IHC Kit | PerkinElmer | NEL801001KT | 텍스트에서 "멀티 스펙트럼 염색 키트"라고 함 |
| Peroxidase Block | Leica | RE7101 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo | P36965 | 텍스트에서 "슬라이드 장착"이라고 함 |
| Starfrost Slides | Fisher | 15-183-51 | |
| 다중 스펙트럼 현미경 제어를 위한 "Vectra 3.0.5" 소프트웨어가 있는 Vectra Polaris 다중 스펙트럼 현미경 | PerkinElmer | CLS143455 | 텍스트에서 "현미경 제어 소프트웨어"라고 합니다 |
참고문헌
- Bethmann, D., Feng, Z., Fox, B. A. Immunoprofiling as a predictor of patient's response to cancer therapy-promises and challenges. Current Opinion in Immunology. 45, 60-72 (2017).
- Taube, J. M., et al. Implications....
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