방법 논문

포 르 말린 고정 암 조직 표본에 면역-종양학 연구를 위한 자동화 된 다중 면역 형광 패널

DOI:

10.3791/58390

⸱

2019년 1월 21일

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1Laboratory of Pathology, MedImmune, 2Laboratory of Pathology, MedImmune, 3Akoya Biosciences Inc., 4Department of Translational Molecular Pathology, University of Texas - MD Anderson Cancer Center

이 논문에서

요약

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자세한 프로토콜 6-마커 멀티플렉스 면역 형광 패널 최적화 수행 위한 더 일관 된 결과를 짧은 절차 시간 자동된 염색기를 사용. 이 방법은 종양 면역 연구에 대 한 모든 실험실에 의해 직접 적응 될 수 있다.

초록

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종양 면역에서에서 지속적인된 개발 암 면역학의 메커니즘의 증가 이해를 필요합니다. 포 르 말린 조정의 파라핀 끼워 넣어진 (FFPE) 생 검에서 조직 샘플의 immunoprofiling 분석 종양 면역학의 복잡성을 이해 하 고 암 immunotherapy에 대 한 소설 예측 바이오 마커의 발견을 위한 주요 도구가 되고있다. Immunoprofiling 분석 조직 등 염증 성 세포 모집단 면역 검사, 종양 microenvironment에 결합 된 마커의 평가 필요 합니다. 소설 멀티플렉스 immunohistochemical 방법의 출현 보다 표준 수염 immunohistochemistry (IHC) 단일 조직 단면도의 더 효율적인 multiparametric 분석에 대 한 수 있습니다. 한 상용 멀티플렉스 면역 형광 (경우) 메서드는 tyramide 신호 증폭에 따라, multispectral 현미경 분석, 결합 조직에서 다양 한 마커의 더 나은 신호 분리에 대 한 수 있습니다. 이 방법론 표준 IHC FFPE 조직 샘플에 대 한 최적화 된 결합형된 기본 항 체의 사용과 호환 됩니다. 여기 우리가 자세하게에서 설명 멀티플렉스 수 있는 자동화 프로토콜 6-마커 다중 항 체 패널 구성 된 PD-L1, 암 조직 샘플의 라벨 경우 PD-1, CD68, CD8, 기-67, 및 4와 AE1/AE3 cytokeratins 6-diamidino-2-phenylindole 로 핵 셀 counterstain. 멀티플렉스 패널 프로토콜 착 시간을 수동 프로토콜의 보다 짧은 수 있습니다 직접 적용 고 인간의 FFPE 조직 샘플에 대 한 면역-종양학 연구에 대 한 모든 실험실 조사에 의해 적응에 대 한 자동된 IHC 염색기에 최적화 되어 있습니다. 또한 몇몇 컨트롤 및 도구, 새로운 다중 경우 패널의 좋은 품질 관리에 대 한 드롭-제어 방법을 포함 하 여 최적화 및 검증 기법에 대 한 유용한 있다.

서론

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FFPE 종양 조직 샘플의 Immunoprofiling 분석 특히 발견 및 암 immunotherapy 임상 시험1의 맥락에 대 한 소설 예측 바이오 마커의 유효성 검사에 대 한 면역-종양학 연구의 필수 요소가 되고있다 ,2. 발 IHC, diaminobenzidine, 등 화학 chromogens를 사용 하 여 진단 병리학 생 검 조직의3의 immunolabeling에 대 한 표준 기술에 남아 있다. 표준 IHC 암 조직 immunoprofiling, 종양 관련 된 림프 톨의 부분 모집단 그리고 프로그램 된 세포 죽음 ligand 1 등 면역 검사점의 식 수준 평가 (PD-L1)4의 정량 등도 사용할 수 있습니다. ,5. 그러나 표준 IHC 제한 됩니다,, 그 하나의 항 원 조직 섹션 당 표시 될 수 있습니다. Immunoprofiling 연구는 일반적으로 여러 마커의 결합된 식의 분석 필요, 표준 IHC 사용 여러 조직 단면도의 얼룩이 지기 요구, 각 하나의 표식으로 물 될 것 이다, 실질적으로 중 핵 바늘 생 검 같은 작은 조직 샘플의 분석에 대 한 제한. 표준 IHC 방법 다양 한 세포 인구, PD L1, 종양 관련 된 대 식 세포와 암 세포에 의해 표현 된다와 같은 면역 검사점 마커로 일반적인 coexpressed 마커의 평가 대 한 제한도 있습니다. 이 제한에, 표준 수염 IHC의 사용 예를 들어, 다양 한 세포 유형6표현 IHC 마커의 정량 분석에 대 한 병리학 자에 의해 보고 되었습니다. 멀티플렉스 발 IHC 기술 채용 같은 조직 섹션 나타냅니다에 다양 한 컬러 chromogens 전진 표준 IHC 수염 방법,7 에 그들은 남아 있지만 개발의 불과 immunolabeling에 의해 제한 마커 또한 동일한 세포 인구의 동일한 subcellular 구획에서 표현 하는 마커의 적절 한 평가 위한 중요 한 기술 과제를 제시.

멀티플렉스 발 IHC 기법의 제한 뿐만 아니라 임상 샘플에서 조직 여부에 관한 상기 주의 에겐 있다 면역-종양학 연구 기반 향상 된 다중 방법을 개발 하는 필요 형광 라벨 결합 이미징 시스템을 효과적으로 동일한 슬라이드에서 여러 fluorophores의 신호를 분리할 수 있습니다. 1 개의 그런 기술은 tyramide 신호 증폭 (TSA) 효율적인 색상 분리8multispectral 현미경 이미징 결합을 기반으로 합니다. TSA 기반 상용 키트 사용 fluorophores multispectral 이미징8 최적화 ( 재료의 표참조). 이 시스템의 중요 한 이점은 이미 검증 되 고 표준 발 IHC9,,1011에 최적화 된 동일한 레이블 없는 기본 항 체와의 호환성 이다. 이 새로운 목표를 통합 최적화 및 패널 수정에서 빠른 최적화 뿐만 아니라 유연성 수 있습니다. 또한, 다중 면역 형광 검사 (mIF) TSA 메서드 수염에서 간단한 전송에 대 한 수 있도록 자동화 된 상용 IHC 염색기 시스템, 최적화 될 수 있습니다 비 IHC mIF.

여기 선물이 프로토콜 기반 면역-종양학 연구 mIF 패널 mIF TSA 얼룩 자동 고 이미징 multispectral 스캐너를 사용 하 여. 이 프로토콜 적응 고 설명된 계측 및 시 약에 대 한 액세스 있는 실험실 사용자에 의해 수정 될 수 있습니다. Carcinomas의 immunoprofiling에 대 한 6 주 항 체의 패널을 포함 하는 프로토콜: PD-L1, PD-1, CD68 (마커로 팬-대 식 세포), CD8 (세포 독성 T 세포), 기-67, 및 AE1/AE3 (팬 cytokeratin, 신분의 상피 표식으로 사용 암 세포)입니다. 최근 연구는 멀티 플렉스12얼룩을 확인 하기 위해 표준 참조로 발 IHC를 사용 하 여 수동 TSA mIF 프로토콜의 최적화를 설명 합니다. 여기에 제시 된 업데이트 메서드는 자동된 염색기, 크게는 착 시간 단축 3-5 일에서 14 h, 또한은 얼룩의 일관성을 향상 시키는 동시에 최적화 된 상용, 일곱 색 TSA 키트를 사용 하 여 개발 되었습니다. 여기에 제시 된 세부 주요 프로토콜 뿐만 아니라 보충 자료 섹션 포함 하는 "드롭-제어" 방법, 새 mIF 패널 뿐만 아니라, 최적화에 대 한 기술 노트를 평가 하는 추가적인 품질 관리 프로세스 문제 해결, 그리고 설정 하 고 사용자 정의 mIF 패널의 mIF TSA 방법 최적화 실험실 사용자 있도록 새로운 다중 패널의 개발.

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프로토콜

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참고: 여기에 제시 된 프로토콜 6 항 체에 대 한 TSA를 사용 하 여 mIF 패널의 immunoprofiling를 수행 하는 방법에 설명 합니다 (CD68, ki67, PD-L1, PD-1, CD8, 및 AE1/AE3) 자동된 염색기에 ( 재료의 표참조). 프로토콜에는 새 mIF 패널의 품질 관리에 대 한 드롭 컨트롤을 수행 하는 방법을 설명 합니다 ( 보충 자료참조). 이 프로토콜을 얼룩이 지 인간의 편도 선 (긍정적인 제어)에서 8 개의 흠 없는 FFPE 슬라이드와 8 개의 흠 없는 슬라이드 인간 폐 선 암에서 수행 됩니다. 첫 번째 슬라이드 전체 멀티플렉스 모든 6 개의 마커, isotype 컨트롤에 없는 기본 항 체는 활용 하 고, 두 번째 슬라이드와 드롭 컨트롤 ( 보충 자료참조)에 대 한 나머지 6 슬라이드 얼룩에 사용 됩니다. 조직 autofluorescence에 대 한 추가 제어 좋습니다 및 멀티플렉스에 항상 포함 되어야 연구 ( 보충 자료참조). 그러나, 조사는 다른 종양 유형 및 그들의 자신의 프로젝트의 목표에 따라 컨트롤을 고용 수 있습니다. MIF TSA 메서드와 multispectral 스캐너 기술 이전 경험 없이 실험실 사용자 다중 IHC 개발 가이드를 읽어야 한다 (사용 가능한 온라인 http://info.perkinelmer.com/2016-lp-Opalassaydevelopmentguide-lp에). 이 가이드에서는 수동 프로토콜에 설명 합니다, 하지만 그것은 또한 방법 얼룩 mIF에 대 한 좋은 소개를 제공 합니다. 이 프로토콜에서 고용 하는 모든 조직 단면도 익명 그리고 헬싱키 선언에 따라 승인.

1. 조직 샘플

  1. 림프 증식 긍정적인 제어 및 PD L1 알려져 FFPE 인간 폐 선 암 샘플으로 사용을 포함 하는 FFPE 인간의 편도 선 샘플 선택 긍정적인. 종양의 존재를 확인 하기 위해 선택 된 폐 암 블록의 hematoxylin과 오신 (H & E) 슬라이드를 검토 합니다. 이 일반적인 배경 얼룩을 증가 수 있습니다 종양 괴 사의 풍부한 영역을 피하기 위해 중요 하다.
    참고: 이 최적화에 대 한 10 년 이상 저장 된 파라핀 블록을 사용 하지 마십시오와 조직을 파라핀 블록 (조직학 기술자와 상담)에 말린 모습.
  2. 톰을 사용 하 여, 각 블록에서 10 연속 직렬 섹션, 4 µ m 두께 절단. IHC, 슬라이드 당 한 부분에 사용 되는 충전 된 유리 슬라이드에 섹션을 탑재 합니다.
    참고: 으로 주름 얼룩 아티팩트를 생성할 수 있습니다, 주름 없이 완벽 하 게 평평 섹션을 탑재 해야 합니다. 번호 1에서 10 직렬 부분의 슬라이드.
  3. 첫 번째 섹션에 새로운 H & E 슬라이드를 준비 합니다. 블록에 남아 있는 편도 선 조직 또는 폐 종양의 존재를 확인 하는 병리학의 도움으로 H & E 슬라이드를 검토 합니다.
    참고: 이 H & E 슬라이드 multispectral 분석 및 형질에 대 한 관심 영역의 선택과 함께, 나중에, 도울 수 있다.
  4. 최대 3 개월까지 4 ° C에서 플라스틱 슬라이드 상자에 흠 없는 섹션을 저장 합니다.

2. 자동 염색기에 얼룩 프로그램 새 mIF의 창조: 등록 된 시 약의

참고: 프로토콜에 사용 하기 위해 사용할 수 있습니다 전에 시 약 시 약 목록 자동된 염색기 소프트웨어에 추가 되어야 합니다. 자동된 염색기 모델 및 소프트웨어 버전에 정보에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오.

  1. 자동된 염색기 소프트웨어 내의 시 약 탭을 클릭 하십시오. 새로운 시를 지정 하려면 추가 클릭 합니다. 이름 (예: "520 TSA 시 약") 및 최대 8 자는 주의 약식된 이름 (예: "520 TSA"), 입력 합니다. 보조 드롭-다운 메뉴에서 선택한 공급자를 설정 합니다. 변경 하지 마십시오 싱글/더블 얼룩 단일/순차 DS에서. 얼룩 프로토콜 프로토콜 F을 기본을 설정 합니다. ER120 기본 여기 프로토콜을 설정 합니다.
  2. 새로운 시 약 및 표 1에 나열 된 모든 시 약에 대 한 반복 단계 2.1 저장 합니다.

3. 자동된 염색기: 컨테이너의 등록

  1. 각 컨테이너의 측에 사용 될 시 약의 이름을 작성 합니다. 측면에 바코드를 스캔. 팝업 창에서 목록에서 올바른 시 약을 선택 합니다. 만료 날짜를 선택 하 고 저장 합니다.
  2. 표 1에 나열 된 모든 시 약에 대 한 3.1 단계에서 절차를 반복 합니다.
  3. 등록 오픈 연구 키트. 키트 측면 모두 바코드를 스캔 하 고 따라는 화면에 나타나는 메시지. 이름을 키트 "멀티플렉스 연구 키트 1." 1 x tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris) 등록-이 키트 (표 1)의 일환으로 식 염 수를 버퍼.

4. 자동된 염색기: 창조는 mIF 프로토콜 프로그램의

  1. 기본 다중 프로토콜은 새로운 자동화 된 stainers (참조 자료의 테이블에에서는 모델 및 소프트웨어 버전)에 오 팔 7 다중 이름으로 사전 로드 된다. 프로토콜 화면에 "선호" 대신 "모든"에 대 한 필터링을 통해 프로토콜을 찾습니다. 없으면 기본 프로토콜, 다음 제조 업체의 도움으로 자동된 염색기 소프트웨어를 업데이트 합니다.
  2. 모든 수정 내용이 원래 프로토콜의 복사본에서 실시 한다. 를 변경 하기 전에 원래 저장 하 고 프로토콜 탭을 클릭, 다음 오 팔 7 다중 프로토콜을 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 복사를 선택 하 여 복사본을 만듭니다.
  3. 7 다중 프로토콜 1 새 창에서 이름을 변경 하 고 올바른 장치 (전시품 또는 벤치탑)와 관련 된 탭을 선택 합니다. 추가 테이블 s 1에서 프로토콜을 일치 합니다. 추가 시 약 10 분 과산화 효소 억제 단계 (표준 프로토콜의 일부가 아닌)을 추가 하 고 시 약으로 과산화 효소 억제제를 선택을 클릭 합니다.
  4. 블로킹 단계 PKI 블로킹 버퍼 활용을 확인 합니다. 각 1 차 항 체는 것 적절 한 시 약, 이차 항 체 단계는 HRP 폴리머를 활용 하 고 그 스펙트럼 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) multispectral 자동화 키트와 함께 제공 되는 사용 확인 하십시오. 프로토콜 화면에 드롭 다운 메뉴에서 각 각 단계에 대 한 지정 된 시 약을 선택 하 여 모든 선택 항목을 확인 합니다.

5. 자동된 염색기: 추가 드롭 컨트롤과 Isotype 제어 프로토콜

  1. 이름 7 다중 프로토콜 1 복사 하 고 1 CD68 드롭 7 다중 프로토콜변경 합니다. 마우스 IgG 를 시 약 CD68 항 체 를 변경 하 고 저장 프로토콜.
  2. 같은 방식으로 6 개의 새로운 프로토콜, 각 드롭 컨트롤 및 완전 한 isotype 컨트롤 (적절 한 isotypes 모든 항 체 변경)을 만듭니다.

6. 자동된 염색기: 슬라이드 준비 프로토콜

  1. Prestaining 프로토콜을 복사 * 빵과 Dewax Multispectral 구워 및 Dewax 2 h이이 프로토콜 이름을 바꿉니다.
  2. 표 2에 표시 된 시 약에 맞게 프로토콜을 조정 합니다. 60 ° c.에 2 h에 대 한 슬라이드를 구워 30 dewax 72 ° c.에 s

7. 자동된 염색기: 준비는 시 약의

  1. 한 연구 탐지 키트를 준비 합니다. 채우기 30 mL 오픈 컨테이너 1 x TBS 1 x Tris 버퍼 염 분 (TBS)에 대 한 표시 및 연구 탐지 키트 지정 다중 연구 키트 (핸들)에서 멀리 위치 1에서에서이 찾을 그래서 한 시 약이이 키트와 함께 영구적으로 연결 되어야 합니다. 1. 시이 약이 영구적으로이 연구 장비와 연결 되며 나중에 사용할 위치를 변경 하면 안.
  2. 두 개의 30 mL 오픈 컨테이너 Multispectral 블록 및 Multispectral 보조라벨. 블로킹 버퍼/희석제 multispectral 얼룩 키트에서 항 체의 30 mL로 Multispectral 블록 컨테이너를 채우십시오. Multispectral 얼룩 키트에서 안티 mouse/안티 rabbit 이차 항 체 폴리머의 30 mL로 Multispectral 보조 용기를 채우십시오.
  3. 10 7 mL 오픈 컨테이너를 준비 합니다. Microliters에 필요한 볼륨은 600 + (150 x [슬라이드 번호]). 각 항 체 (6 편도 선 및 6 폐)이이 경우에 12 슬라이드에 적용 됩니다. 라벨 및 모든 컨테이너에 대 한 볼륨은 표 3에 표시 됩니다.
  4. 각 항 체 튜브에 대 한 항 체를 추가 먼저 희석제, 뒤에 볼륨에 집중된 1 차 항 체는 표 3에 표시 된. 부드러운 pipetting으로 혼합.
  5. 7 mL 오픈 컨테이너 DAPI, DAPI 집중 이중 증 류 물;의 밀리 리터 당 4 개의 방울을 사용 하 여에 대 한 준비 16의 총 DAPI로 물 들일 것 이다 (600 + [150 x 16] = 3000 µ L). 컨테이너에 두 번 증 류 물의 3 mL 플러스 스펙트럼 DAPI 12 방울을 추가 합니다. 각 실행에 대 한 신선한 DAPI를 준비 합니다.
  6. 과산화 효소 억제제에 대 한 7 mL 오픈 컨테이너를 준비 합니다. 모든 16 슬라이드 과산화 효소 억제 물으로 취급 됩니다 (600 + [150 x 16] = 3000 µ L). 컨테이너에 과산화 효소 블록의 3 mL를 추가 합니다.
  7. Fluors의 작업 농도 준비 하기 전에 각 fluor 튜브 제조 업체에 의해 제공에 디 메 틸 sulfoxide의 75 µ L을 추가 하 여 동결 건조 된 모든 fluors를 resuspend. Pipetting으로 혼합. 이것은 TSA fluor 주식 이다. 4 ° c.에 게
  8. 각 형 석 한 6 적정 용기를 준비 합니다. Microliters에 필요한 볼륨은 350 + (150 x [슬라이드 번호]). 각 형 석 16 슬라이드 (8 편도 선 및 8 개의 폐)이이 경우에 적용 됩니다. 라벨 및 모든 컨테이너에 대 한 볼륨은 표 4에 표시 됩니다.
  9. 모든 시 약 등록 되어 있고 준비를 하는 경우 각 컨테이너 선반에 어떤 위치에 놓고 자동된 염색기에 모든 시 약을 로드 합니다. 프로브는 각 시의 볼륨을 확인 합니다.

8. 자동된 염색기: 샘플 설치 및 Multispectral 얼룩

  1. 자동된 염색기 소프트웨어에서 화면 위쪽에 슬라이드 설치를 클릭 합니다. 추가 연구를 클릭 합니다. 연구 ID, 연구 이름 및 코멘트와 함께 팝업 창을 채웁니다.
    1. 드롭-다운 목록에서 얼룩 실행을 수행 하는 연구원의 이름을 선택 합니다. 150 µ L에서 디스 펜스 볼륨을 둡니다. 선택 Multispectral Dewax 준비 프로토콜에 대 한. 확인 및 추가 슬라이드를 클릭 합니다. 의견, 입력 "1 폐 123ABC 멀티플렉스할." 표시 된 대로 다음 필드를 입력: 조직 유형 = 테스트 조직; 디스 펜스 볼륨 = 150 µ L; 얼룩 모드 = 단일, 일상적인; 표식 = 네거티브; 얼룩이 = 입력 "7 다중 프로토콜 1"; 준비 Multispectral 빵 = 2 h; Dewax 여기 = 여기 ER1와 20 분.
  2. 추가 슬라이드 를 클릭 하 고 의견 및 드롭 컨트롤 슬라이드와 isotype 제어 슬라이드를 추가 하려면 프로토콜 변경. 연구에 모든 슬라이드를 추가한 경우 추가 슬라이드 창을 닫고 레이블을 인쇄 합니다. 레이블을 적절 한 레이블 영역 각 슬라이드에 적용 됩니다.
  3. 랙 슬라이드 로드, 올바른 방향에서 표지 타일을 적용 자동된 염색기에 선반을 삽입 하 고 트레이 낮은. 장치는 슬라이드 레이블 검색 합니다.
  4. 때 모든 슬라이드와 시 약 검색 하 고 되었습니다 측정. (►) 실행된 버튼은 활성화 될 것입니다. autostainer 부족 시 볼륨, 같은 모든 오류를 감지 하는 경우 영향을 받는 트레이으로 노란색 주의 기호 표시 됩니다. 오류가 발생 하는 경우 주의 기호를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭 하 고 오류 해결.
  5. 얼룩 즉시 시작 하거나 일정 지연된 시작 합니다. 프로토콜 기간에 약 14 h입니다. 참고: 확인 프로토콜 때 슬라이드 제거할 수 있습니다 즉시 exess 세척 얼룩 결과 영향을 수 시간에 완료 됩니다.

9입니다. Multispectral 슬라이드 Coverslipping

  1. 자동된 염색기에서 슬라이드를 제거 하 고 랙 1에 빠져들에 저장할 tbs. x
  2. No. 1.5 coverslips와 ( 재료의 표참조)는 설치 미디어의 15 µ L 샘플을 탑재 합니다. 피 펫 팁 coverslip에 부드럽게 눌러 모든 거품을 제거 합니다.
  3. 실험실 벤치에 실 온에서 하룻밤 치료를 슬라이드 수 있습니다. Uncured 슬라이드 주의 처리 즉시 검색할 수 있습니다.

10. multispectral 스캐너

  1. Multispectral 스캐너와 컴퓨터에 전원 (모델 및 소프트웨어 정보에 대 한 재료의 표 참조). 현미경 제어 소프트웨어를 시작 합니다. 장치의 전면에 터치 버튼을 누르면 multispectral 스캐너의 앞 도어를 엽니다. 각 스프링 캐리어 스캐너에는 4 개의 슬라이드를 보유 하고있다. 캐리어로 모든 슬라이드를 로드 하 고 장치에 반송파를 로드 하기 전에 순서를 기록 합니다.
  2. 편집 프로토콜 을 선택 하 고 뉴...; 그런 다음, 다중 패널 1과 드롭 컨트롤프로토콜 이름을 만듭니다. 멀티플렉스 패널 개발연구 이름 만들려면 프로토콜을 클릭 만들고 입력 개요 검색 필터 DAPI; 그런 다음 전체 슬라이드 스캔 및 픽셀 해상도 0.50 µ m (20 X)를선택 합니다. 모든 필터와 밴드를 대표 한다. 아니라면, 밴드 필터 편집을 클릭, 모든 5 개의 필터 (DAPI, FITC, CY3, 텍사스 레드와 CY5), 선택한 다음 노출 편집을 클릭 합니다.
  3. 폐 선 암의 전체 멀티플렉스와 캐리어를 선택 하 여 캐리어를 로드 합니다. 그래픽 사용자 인터페이스를 사용 하 여 올바른 슬라이드를 선택 합니다. 수동으로 또는 자동 초점을 사용 하 여 조직 초점. 허용 DAPI 얼룩과 어떤 영역으로 이동 하 고 자동 노출 노출 밀리초 단위로 설정 하려면 클릭 합니다 (0-2000 ms).
  4. 전체 검사와 MSI 지역 열에 모든 5 개의 필터 집합에 대해 동일한 절차를 반복 합니다. 수락 가능한 얼룩과 영역으로 이동 하 고 각 필터와 확대 수준에 대 한 노출을 설정 하기 전에 현미경을 촛점을 해야 합니다. 전체 스캔 x 20와 multispectral 이미징 (MSI) multispectral 지역 x 20에 모든 5 개의 필터에 대 한 자동 노출. 0.50 μ m (20 배)의 픽셀 해상도 선택 합니다. 프로토콜 저장 하 고 다시 Vectra 소프트웨어;의 홈 화면으로 돌아가려면 클릭 합니다 다음, 슬라이드 스캔을 클릭 합니다.
  5. 각 슬라이드에 대 한 인터페이스를 열고 스캔 작업 을 설정 합니다. 멀티플렉스 패널 개발에 연구 를 설정합니다, 그리고 다중 패널 1 및 드롭 다운 컨트롤, 프로토콜 을 설정합니다 하 고 다중 폐 ABC123, 멀티플렉스 CD68 드롭 폐 ABC123, 등 슬라이드 ID 설정 . 모든 슬라이드 표시 된 작업은 설정 하는 경우 검색을 클릭 합니다. 자동된 multispectral 스캐너는 모든 5 개의 필터를 사용 하 여 모든 슬라이드의 전체 슬라이드 스캔을 수행 합니다.

11. multispectral 스캐너: Multispectral 이미징

  1. 스캔 완료 되 면 QPTIFF 소프트웨어 ("Phenochart")을 왼쪽 상단에 로드 슬라이드 를 클릭 합니다. 이 5-필터 전체 슬라이드 스캔 QPTIFF, 열 것 이다. 각 레이어 정보가 둘 이상의 fluor에서 유틸리티는 제한 된, 하지만 조직 구조와 광범위 한 식 패턴 명백한 고 MSI에 대 한 영역을 선택 하는 데 사용 될 수 있습니다.
  2. 이동 하 고 왼쪽에 드롭-다운 트리를 사용 하 여 연구에서 정확한 슬라이드를 엽니다. (오른쪽 위)에 사용자의 이니셜이 로그인.
  3. 화면 상단에서 도장 도구 사용 하 여 MSI에 대 한 5 개 영역을 선택 합니다. 사용 가능한 경우는 병리학을 참조 하십시오. 선택, 선택 수집; 필드에는 크기, 선택 1 x 1; 그리고 필드 제한에서 0.5 µ m (20 x)를선택 합니다. Cytokeratin (CK) (주로 Cy5)에 착 색에 따라 달라 집니다, 여러 지역 종양 (CK +)와 기질 (CK-) 전반적인 검색에서 이미지를 선택 합니다. 각 슬라이드에 대해이 절차를 반복 합니다.
  4. 일단 모든 Msi를 선택 Phenochart 소프트웨어 닫고 Vectra 소프트웨어를 반환 합니다. 각 슬라이드에 대 한 MSI 작업 스캔 에서 변경 그리고, 다음 MSI 컬렉션을 수행 하기 위해 다시 검사 를 클릭 합니다.

12. 스펙트럼 Unmixing

참고: 스펙트럼 unmixing 단계는 채널 분리 및 슬라이드의 이미지 분석에 대 한 필요 합니다. 정보 소프트웨어에서 스펙트럼 unmixing을 수행 하기 전에 스펙트럼 라이브러리로 얼룩진 각 fluor와 DAPI 혼자 혼자 폐 선 암 슬라이드를 사용 하 여 건설 한다. 이 절차는 상기 다중 IHC 분석 결과 개발 가이드에도 설명 되어 있습니다.

  1. MSI 인수 완료 되 면 스펙트럼 unmixing (이 하 "정보") 소프트웨어를 사용 하 여 MSI 폴더에 있는 파일을 열려면. 이러한 파일은.im3 파일 형식 확장명에 끝.
  2. 이미지 형식에서 선택 Multispectral; 샘플 서식에서 선택 형광; 스펙트럼 라이브러리 소스에서 정보를 선택 하 고.
  3. Fluors를 선택 하려면 선택 하 고 내장 폐 선 암 도서관 슬라이드 라이브러리에서 모든 6 개의 fluors와 DAPI를 로드 합니다. 모든 준비 (왼쪽 아래)를 클릭 합니다. 스펙트럼 unmixing 소프트웨어 제공된 스펙트럼 프로필을 사용 하 여 모든 오픈 이미지에 스펙트럼 unmixing 수행 합니다.
  4. 병리학 자와 같은 조직의 순차적 슬라이드에 동일한 대상의 비 단일 얼룩에 대 한 얼룩 패턴을 평가 합니다.

13. 형광 강도 및 신호 감쇄의 평가

참고: 으로 나타나는 작은 갈색 상자와 화살표, 카운트 도구 다중 최적화를 위한 가장 중요 한 도구 이며 자주 사용 한다 ( 보충 자료참조). 계산 도구를 사용 하 여 스펙트럼 unmixing 소프트웨어에, 평가 최소 10:1 (문제 해결 및 드롭 컨트롤과 얼룩 멀티플렉스의 평가 대 한 보충 자료 참조)를 초과 한다 신호 대 잡음 비율.

  1. 13.1. 이미지 스펙트럼 unmixing 소프트웨어에 오픈, 카운트 도구 교전을 각 채널의 형광 강도 평가 하기 위해 이미지를 조사. 폐 조직에 대상 강도 10 및 20 정규화 된 수 사이입니다. 정규화 된 계산 도구는 그림 1에 표시 됩니다.
  2. Autofluorescence 및 오프 대상 얼룩 정통 신호와 경쟁 하지 않습니다 있도록 최대 신호 카운트의 모든 표식에 대 한 미만 5 미만 10 또는 정상적인 신호 지역의 슬라이드를 제외 합니다.
  3. 최대 제외 슬라이드 30 스펙트럼 출혈 또는 비효율적인 스펙트럼 unmixing 방지 하려면 어떤 채널에 대 한 보다 큰 계산 합니다.
  4. TSA 농도 조정 하 여 높은 또는 낮은 정규화 된 카운트를 주소.

14. multispectral 이미지 분석

  1. 하나 이상의 MSI를 스펙트럼 unmixing 소프트웨어 에서 열고 unmixing을 위한 유일한 선택 fluors 하나 이상의 오픈 이미지에 표시 됩니다. 모든 준비 unmix 괴기 하 게 순수한 이미지를 모든 현재 열린된 컬러 이미지를 클릭 합니다.
  2. 관심의 영역 위로 이동 하 여 각 이미지에 걸쳐 건의 조사를 조사 도구를 선택 합니다.
  3. 눈 아이콘 보기 편집기를 열려면 선택 합니다. 선택 하 고 각 채널의 디스플레이 강도 조정 합니다.
  4. 구성 조직 세분화, 셀 분할, 형질, 및 득점 모듈을 열려면 선택 합니다. 이러한 도구 비 단일 얼룩에 얼룩이 멀티플렉스의 객관적인 유효성 검사에 필요한 고 양적 phenoptic 데이터 (그림 S1)를 생성 하기 위해 사용할 수 있습니다.
  5. 회색, 형광을 저장 하려면 내보내기 탭, pathview-스타일 비압축 TIFF 및 phenoptic 분석 모듈에서 데이터 파일을 사용 하 여 추가 분석, 보관 및 프레 젠 테이 션 (그림 S1)에 대 한.

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결과

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여기에 설명 된 프로토콜은 그림 2에 표시 된 것과 같은 결과 제공할 것입니다. 편도 선 컨트롤, 표면 편평 세포 상피로 시작에 얼룩의 평가로 시작 합니다. 편도 선 샘플의 조직학 병리학 자, H & E 슬라이드를 참조 하 여 함께 검토할 수 있습니다. 비 IHC 섹션을 동일한 조직 블록에 동일한 표식으로 수행 하 고, 다음이 사용할 수 있습니다 밀도 및 mIF 슬라이드에 각 마커의 유통 확인 하. 그림 2A같이 편도 선 조직 명확 하 게 정의 된 AE1/AE3 cytokeratin 편도 선 표면 편평 상피에 얼룩을 제공 해야 한다 (그림 2A; 빨간 모조 색상으로 표시), 림프는에 배경 없이 조직입니다. 얼룩 세포질 막 음의 억양 법와 때때로 ...

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토론

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지속적인 암 immunotherapy 혁명은 오프닝 소설과 유망 암 환자13에 대 한 치료 옵션. 면역-종양학 분야에서 발전 새로운 예측 생체를 찾을 뿐만 아니라 발암에 관여 하는 면역 메커니즘의 생물학을 이해 하는 것 뿐만 아니라 염증 성 종양 microenvironment의 증가 지식 필요 합니다. immunotherapy 기반 치료1,2. 때문에 암 면역학의 복잡 한 생물학, 종양 조직 샘플의 심문 일반적으로 하는 데 필요한 면역 표식, 서로 상호 작용 하 고 자주 조직1에에서 다양 한 세포 인구에 의해 coexpressed의 성장 목록을 개발합니다 ,,25. 임상 시험 일반적으로 작은 biopsies 코어 바...

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공개 사항

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이 작품은 MedImmune, 글로벌 biologics R & D 팔 아 스 트 라의에 의해 지원 되었다. C.W., K.R., 및 C.C.H.는 Perkin Elmer (TSA kit) 시 약을 생산 하 고이 작품에 사용 했던 multispectral 스캐너의 직원이 있습니다. 석사, K.D., 아, W.Z., C. Bagnall, C. 브라운, J.C., 앨 러 배 마, 캔사스, M.R., 및 J.R.C.는 주식 소유권 및 재고 관심사 또는 아 스 트 라 옵션 MedImmune의 직원.

감사의 글

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편집 지원 MedImmune의 데보라 Shuman에 의해 제공 했다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
스펙트럼 불혼합 및 이미지 분석을 위한 "InForm 2.4.2" 소프트웨어PerkinElmerCLS151066텍스트에서 "스펙트럼 불혼합 소프트웨어"라고 함
"Phenochart 1.0.9" MSI 선택 및 전체 슬라이드 스캔 보기를 위한 QPTIFF 소프트웨어PerkinElmerCLS151067에서 "QPTIFF 소프트웨어"라고 함
Coverslips,Sigma Aldrich2975246
200 프루프 에탄올KoptecV1001
20x Tris-Buffered SalineVWRJ640-4L
항체 희석제DAKOS2203
Anti-CD68 마우스 단클론DAKOM087601-2클론 PG-M1
Anti-CD8 Rabbit 단클론벤타나M5392클론 SP239
Anti-CK 마우스 모노클로날DAKOM351501-2클론 AE1/AE3
Anti-ki67 마우스 단클론DAKOM724001-2클론 MIB-1
Anti-PD-1 토끼 단클론세포 신호#86163클론 D4W2J
Anti-PD-L1 토끼 단클론Ventana790-4905클론 SP263
본드 듀왁스 용액LeicaAR9222텍스트에서 "왁스 용액"이라고 함
본드 에피토프 회수 용액 1LeicaAR9961텍스트: "ER1"
본드 에피토프 회수 용액 2LeicaAR9640텍스트: "ER2",
Bond Open Containers, 30 mLLeicaOP309700"30 mL open containers"
7 mLLeicaOP79193"7 mL open containers"라고 함" 텍스트:
Bond Polymer Refine DetectionLeicaDS9800텍스트: "발색 검출 키트"
Bond Research Detection KitLeicaDS9455텍스트에서 "연구 검출 키트"라고 함
Bond Titration KitLeicaOPT9049텍스트: "적정 키트"라고 함
Bond Universal Covertile NovocastraLeicaS21.2001텍스트에서 "covertiles"라고 부름
Bond Wash Solution 10X ConcentrateLeicaAR9590텍스트에서 "10x 세척 솔루션"이라고 부름
BondRX AutostainerLeica텍스트에서 "자동 염색기"라고 부름
BondRX 소프트웨어 버전 5.2.1.204Leica텍스트에서 "자동 염색기 소프트웨어"라고 부름
Opal 7-Color Automation IHC KitPerkinElmerNEL801001KT텍스트에서 "멀티 스펙트럼 염색 키트"라고 함
Peroxidase BlockLeicaRE7101
ProLong Diamond Antifade MountantThermoP36965텍스트에서 "슬라이드 장착"이라고 함
Starfrost SlidesFisher15-183-51
다중 스펙트럼 현미경 제어를 위한 "Vectra 3.0.5" 소프트웨어가 있는 Vectra Polaris 다중 스펙트럼 현미경PerkinElmerCLS143455텍스트에서 "현미경 제어 소프트웨어"라고 합니다
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참고문헌

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