여기, 선물이 빠르게 다운스트림 대규모 병렬 RNA 시퀀싱 신선 또는 냉동 조직에서 높은-품질 핵을 분리 하는 프로토콜. 우리는 세제-기계 및 소형 기계 조직 장애 및 셀 세포 옵션을 둘 다 핵의 격리에 대 한 사용할 수 있습니다를 포함 합니다.
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정오 공지
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요약
초록
개별 셀의 유전자 발현 프로 빙 셀 유형과 셀 상태 식별 수 있습니다. 단일 셀 RNA 시퀀싱 transcriptional 프로필 셀, 특히 중추 신 경계와 같은 다른 유형의 조직에서에서의 공부에 대 한 강력한 도구로 떠오르고 있다. 그러나, 분리 방법 단일 셀 시퀀싱에 필요한 실험 변경 유전자 표현과 세포 죽음에 발생할 수 있습니다. 또한, 이러한 방법을 따라서 보관에 대 한 연구 및 바이오-은행 소재를 제한 하는 신선한 조직에 일반적으로 제한 됩니다. 단일 핵 RNA 시퀀싱 (snRNA-Seq)는 그것은 정확 하 게 세포 유형 식별, 냉동 또는 해리, 어려운 조직의 연구 주어진 transcriptional 연구에 대 한 매력적인 대안 이다 분리 유발 감소 전사입니다. 여기, 선물이 다운스트림 snRNA-이 대 한 핵의 신속한 격리에 대 한 높은 처리 프로토콜 이 메서드는 신선 또는 냉동 척수 샘플에서 핵의 분리를 가능 하 게 하 고 두 대규모 병렬 드롭릿 캡슐화 플랫폼 결합 될 수 있다.
서론
신 경계는 다양 한 형태학, 생화학, 및 electrophysiological 속성을 표시 하는 셀의 이기종 그룹의 구성 됩니다. 대량 RNA 시퀀싱은 다른 조건 하에서 유전자 발현에서 조직 전체의 변화를 결정 하는 데 유용한 동안, 단일 세포 수준에서 transcriptional 변화의 감지를 걸로 하겠습니다. 단일 셀 transcriptional 분석의 최근 발전 기능적인 그룹 분자 그들의 레 퍼 토리를 기반으로 이기종 세포의 분류를 가능 하 게 하 고 했다 최근에 활성화 된 뉴런의 집합을 검색 하는 데도 수 있습니다. 1 , 2 , 3 , 4 지난 10 년 동안, 단일 셀 RNA 시퀀싱 (scRNA-Seq)의 개발은 개별 셀, 셀 형 다양성으로 볼의 유전자 발현의 연구 활성화. 5
대규모 병렬 scRNA-Seq, 같은 확장 가능한 접근의 출현 순서 이질적인 조직, 중앙 신경 시스템의 많은 영역을 포함 한 플랫폼을 제공 하고있다. 6
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프로토콜
모든 동물 일 신경 성 질환의 국가 학회 및 치기 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 하는 프로토콜에 따라 수행 되었다. 샘플은 남성과 여성의 ICR/CD-1 야생-타입 마우스, 8 사이 균형 그리고 12 주 오래 된, 모든 실험을 위해 사용 되었다. 마우스 로컬 기관 동물 관리 및 사용 위원회 지침에 따라 처리 되어야 합니다.
1입니다. 준비 재료 및 버퍼의
- 모든 버퍼 사용의 날을 준비 하 고 미리 얼음에 진정 ( 표 1참조).
- 세제-기계 세포를 사용 하 여 세제 세포의 용 해 버퍼 (샘플 당 > 500 μ), 낮은 자당 버퍼 (> 6 mL 샘플 당), 자당 밀도 버퍼 (> 견본 당 12.5 mL), 및 물의 resuspension 솔루션 (> 1 mL)을 준비.
- 소형 기계 세포를 사용 하는 경우 준비 침투성 세포의 용 해 버퍼 (> 5 mL 샘플 당), 히 매체 (> 5 mL 샘플 당), 낮은 자당 버퍼 (> 3 mL 샘플 당), 자당 밀도 버퍼 (> 견본 당 12.5 mL), 및 물의 resuspension 솔루션 (> 1 mL).
- 그냥 프로토콜을 시작 하기 전에 dithiothreitol (DTT)의 25 μ 자당 밀도 그라데이션 ....
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결과
여기, 우리는 다운스트림 대규모 병렬 RNA 시퀀싱 성인 마우스 요 추 척수에서 핵의 격리를 수행합니다. 프로토콜 관련 세 가지 주요 구성 요소: 조직 장애 및 세포 세포의 용 해, 균질, 고 자당 밀도 원심 분리 (그림 1). 초 이내에, 세제 기계 세포 세포와 조직 파편 (그림 2A표 2) 핵의 많은 수와 원유 핵 준비 나왔고. 15 분 후, 소형 기계 세포 적은 파편, 하지만 또한 적은 핵 (그림 2B표 2) 원유 핵 준비 나왔고. 두 준비는 균질을 받았다 (그림 2C 및 D) 및 자당 농도 0.04 %BSA PBS에서 물의 resu.......
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토론
이 프로토콜의 궁극적인 목표는 다운스트림 transcriptional 분석에 대 한 높은-품질 RNA를 포함 하는 핵을 분리 하는. 우리는 모든 척수에서 세포 유형의 프로필 위해 snRNA-Seq 방법 적응. 처음에, 우리는 전형적인 세포 분리 방법 효과 없었다 단일 셀 RNA 시퀀싱, 척수 신경은 세포 죽음에 특히 취약 발견. 또한, 세포 분리 방법 hundred-fold 몇몇까지 여 다양 한 활동 및 스트레스 반응 유전자의 표정을 유도. 3 , 4 , 16 단일 셀 준비와 관련 된 단점을 감안할 때, 우리와 다른 사용 핵 대안입니다. 16 , 17 , 18 ,
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공개 사항
우리는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.
감사의 글
이 작품은 NINDS 교내 프로그램에 의해 지원 되었다 (1 지아 NS003153 02) 및 NIDCD (1 지아 DC000059 18). 우리는 L. 리 및 그들의 기술 지원 및 유용한 토론, C.I. Dobrott C. Kathe 원고를 검토 하기 위한 감사 합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 설탕 | Invitrogen | 15503-022 | |
| 1 M HEPES (pH = 8.0) | Gibco | 15630-080 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016-100G | |
| MgAc | Aldrich | M5661-50G | |
| 0.5 M EDTA (pH = 8.0) | Corning | MT-46034CI | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | 10197777001 | |
| Triton-X | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Nuclease-free water | Crystalgen | 221-238-10 | |
| 1 M Tris-HCl (pH = 7.4) | Sigma Aldrich | T2194 | |
| 5 M NaCl | Sigma Aldrich | 59222C | |
| 1 M MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028 | |
| Nonidet P40 | 시그마 Aldrich | 74385 | |
| 최대 절전 모드 -A | Gibco | A12475-01 | |
| Glutamax (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| B27 (50x) | Gibco | 17504-044 | |
| 1x PBS | Crystalgen | 221-133-10 | |
| 0.04% BSA | New England Biolabs | B9000S | |
| 0.2 U/ &뮤; L RNAse 억제제 | Lucigen | 30281-1 | |
| Oak Ridge 원심분리기 튜브 | Thermo Scientific | 3118-0050 | |
| 일회용 면 플러그 붕규산염-유리 파스퇴르 피펫 피셔 | 사이언티픽 | 13-678-8B | |
| 유리 티슈 Dounce (2mL) | Kimble | 885303-002 | |
| 유리 대형 클리어런스 유봉 | Kimble | 885301-0002 | |
| 유리 작은 클리어런스 유봉 | Kimble | 885302-002 | |
| T 10 Basic Ultra Turrax Homogenizer | IKA | 3737001 | |
| 분산 도구(S 10 N – 5G) | IKA | 3304000 | |
| Trypan Blue Stain(0.4%) | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| 40 μ m 세포 여과기 | Falcon | 352340 | |
| MACS SmartStrainers, 30 μ m | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| 원뿔형 튜브 | Denville Scientific | 1000799 | |
| Sorvall Legend XTR 원심분리기 | Thermo Fisher Scientific | 75004505 | |
| Fiberlite F15-6 x 100y 고정각 로터 | Thermo Fisher Scientific | 75003698 | |
| 스테로로지컬 피펫: 5 mL, 10 mL | Denville Scientific | P7127 | |
| 혈구계 | Daigger Scientific | EF16034F | |
| Chemgenes 바코드 비드 | Chemgenes | Macosko-2011-10 | |
| RNaseZap RNase 오염 제거 솔루션 | Invitrogen | AM9780 | |
| Falcon Test Tube with Cell Strainer Cap (35 μ m) | Corning | 352235 | |
| MoFlo Astrios 세포 분류기 | Beckman Coulter | B25982 | |
| 크롬 i7 멀티플렉스 키트, 96 rxns | 10X 유전체학 | 120262 | |
| 크롬 단일 세포 3' 라이브러리 및 겔 비드 키트 v2, 4 rxns | 10X 유전체학 | 120267 | |
| 크롬 단일 세포 A 칩 키트, 16 rxns | 10X 유전체학 | ||
| 조직 배양 접시(60mm x 15mm) | Corning | 353002 |
참고문헌
- Hrvatin, S., et al. Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).
- Hu, P., et al.
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재인쇄 및 허가
정오
Formal Correction: Erratum: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing
Posted by JoVE Editors on 11/20/2018. Citeable Link.
An erratum was issued for: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing. The Protocol section was updated.
Step 3.1 was updated from:
Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 mL pre-chilled detergent lysis buffer.
to:
Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 μL pre-chilled detergent lysis buffer.
Step 3.6 was updated from:
Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 mL of the lysis buffer.
to:
Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 μL of the lysis buffer.
Step 5.5 was updated from:
Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion.
NOTE: A residual volume (less than 400 mL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield
to:
Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion.
NOTE: A residual volume (less than 400 μL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield
Step 5.6 was updated from:
Using 100 mL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin ‘frown’ that remains with the detergent-based preparation.
to:
Using 100 μL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin ‘frown’ that remains with the detergent-based preparation.
Steps 6.1.1 - 6.1.4 were updated from:
- Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per mL.
- Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per mL.
- Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.
- Adjust the flow rates to 35 mL per min for beads, 35 mL per min for nuclei, and 200 mL per min for oil.
to:
- Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per μL.
- Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per μL.
- Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.
- Adjust the flow rates to 35 μL per min for beads, 35 μL per min for nuclei, and 200 μL per min for oil.
