Hippo 신호 Luciferase 기반 큰 종양 억제기 (라트) 바이오 센서를 사용 하 여 경로 활동 모니터링

요약

여기에 우리가 현재 큰 종양 억제기 (라트)의 키 니 아 제 활동을 계량 luciferase 기반 바이오 센서-Hippo 신호 전달 경로에 중앙 니. 이 바이오 센서는 다양 한 응용 프로그램 기본 및 변환 연구 마 통로 레 귤 레이 터에서 생체 외에서 그리고 vivo에서조사 목적에 있다.

초록

통로 신호 하는 마 장기 크기의 보존된 레 귤 레이 터 이며, 개발 및 암 생물학에 있는 중요 한 역할을 했다. 기술 과제 때문이 신호 통로의 활동을 평가 하 고 생물학 컨텍스트 내에서 해석 하기 어려운 남아 있다. 큰 종양 억제기 (라트)에 기존 문학 심사에 대 한 질적 고 수 없습니다 쉽게 수 수직 방법에 의존 합니다. 최근, 우리 마 키 니 아 제 폭포의 라트는 핵심 구성 요소의 키 니 아 제 활동을 모니터링 하는 생물 발광 기반 바이오 센서를 개발 했습니다. 여기, 우리 뚱 땡 통로 레 귤 레이 터 하이 라트를 바이오 센서 (라트-학사)을 사용 하는 방법을 위한 절차를 설명 합니다. 첫째, 우리 라트-학사를 사용 하 여 라트 활동에 조사는 overexpressed 단백질 후보 (예, VEGFR2)의 효과 대 한 자세한 프로토콜을 제공 합니다. 다음, 우리는 소규모 kinase 억제제 화면 라트-BS을 사용 하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜 feasibly 수직 의심할 여 지 없이 마 통로의 소설 레 귤 레이 터를 식별 것입니다 더 큰 화면을 수행할 수 있습니다.

서론

신호 통로 세포 성장 및 동물 크기^1,2의 소설 레 귤 레이 터로 초파리 에 처음 발견 되었다 하는 마 그것의 처음 발견부터 장착 증거 설득 나타났습니다 뚱 땡 통로 (예를 들어, 초기 미 발달 발달, 기관 크기 제어 및 3 차원 [3 차원] 형태학), 개발에 중요 한 역할을 재생 tumorigenesis ( 예를 들어, 종양 개발, 전이, 신생, 면역 회피, genomic 불안정성, 스트레스 반응, 그리고 약물 저항), 및 조직의 항상성 (예:줄기 세포 재생 및 분화, 부상 후 조직 재생) ^{3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10}. 자주....

프로토콜

1. 마 라트-학사를 사용 하 여 신호의 Putative 레 귤 레이 터의 조사

1. 도금 및 세포의 transfection
   1. 세포 배양의 준비
      1. 1 x PBS, 10 %FBS 1% 페니실린/스, 및 0.25 %trypsin-EDTA 약 30 분 동안 물 욕조에 37 ° C에 포함 된 DMEM 따뜻한.
      2. 철저 하 게 청소 70% 에탄올 biosafety 내각.
      3. 필요에 따라 조직 문화 후드에 조직 문화 요리, 파스퇴르 펫, 혈 청 학적인 펫, 그리고 피 펫 팁을 놓습니다.
      4. PBS, 미디어, 그리고 물 탕에서 트립 신-EDTA x 1을 꺼내, 70% 에탄올으로 그들을 청소와 후드에 그들을 배치.
   2. 유지 보수 및 transfection에 대 한 셀의 도금
      1. 실험에 대 한 높은 transfection 효율 (예를 들어, HEK293) 셀 라인을 선택 합니다. 서쪽 오 점 활성화 되어 Hippo 신호 다는 것을 확인 하 여이 셀 라인에서 마 경로 구성 요소 표현을 위한 확인 합니다.
      2. 37 ° C, 5% CO₂배양 기에서 10 cm 배양 접시에 DMEM HE....

결과

라트-학사 라트 활동 (그림 3)에 미치는 영향을 평가 하는 다른 유전자와 cotransfected 했다. 이 실험에서 Renilla 는 내부 제어로 사용 되었다. 야프-5SA의 일시적 표현, 얍, 제정 활성 형태의 설립된 피드백 통로²⁵통해 라트 키 니 아 제 활동에 야프 transcriptional 대상과 후속 증가의 레벨을 증가 하는 원인. MST, 뚱 땡 통로 (그림 1)에 라트의 업스트림 활성기는 또한 바이오 센서 신호 강도를 증가 시킵니다. 그러나, PI3K/MAPK 신호 트리거, VEGFR overexpression 라트를 억제 하 고 라트-BS의 신호 강도 감소.

두 번째 프로토콜 라트.......

토론

뚱 땡 통로 다양 한 생물학 과정에 중요 한 역할을 재생 하는 동안 뚱 땡 통로의 dysregulation 암⁶리드 어떻게 뚱 땡 통로 다양 한 자극에 대 한 응답에서 통제는 완전히 이해 되지. 또한, 코어 마 구성의 활동을 평가 하기 위해 아무 양적 및 실시간 시스템이 되었습니다. 최근, 우리 개발 하 고 검증 마 통로²⁴에 라트 키 니 아 제 활동을 측정 하기 위한 새로운 바이오 센서. 이 바이오 센서는 양적 고 정확 하 게 모니터링 신호 살아있는 세포에 활동 하는 마 뿐만 아니라 암 치료에 대 한 하 마 통로 대상으로 약물의 화면에 대 한 사용할 수 있습니다. 또한, 바이오 센서 기반 선별 소설 유전자 히포 통로의 규칙에 대 한 책임의 발견 될 수 있습니다. 마 암에 신호의 중요성을 감안할 때, 다른 유전자와 뚱 땡 통로 사이 중요 한 누화를 찾는 모든 암 생물학에 대 한 수행 중요 한 연구 될 것 이다. 따라서,이 바이오 센서는 현재 암.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
<강력한>트립신-EDTA	Life Technologies	2520056	0.25%
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma	F1051
DMEM	Sigma	D6429-500ml	DMEM은 고포도당
Penicillin Streptomycin	Life Technologies	15140122
PolyJet In Vitro DNA 트랜스펙션 시약	Signagen	SL100688.5
5x 수동 용해 버퍼	Promega	E194A	30 ml
Dual-Glo® Luciferase 분석 시스템	Promega	E2940	100 ml 키트
20/20 발광계	Turner Biosystems	998-2036	단일 튜브 리더 발광계
GloMax® 듀얼 인젝터가 있는 내비게이터	Promega	GM2010	96웰 플레이트 리더 광도계