Protoplasts를 사용 하 여 엽록체로 공부 단백질 가져오기

요약

여기는 못 중재 변환 메서드를 사용 하 여 protoplasts로 단백질을 표현 하는 프로토콜에 설명 합니다. 관심, 단백질 및 단백질 현지화 및 다양 한 실험 조건에 대 한 가져오기 프로세스의 효율적인 조사의 쉬운 표현 제공 합니다 vivo에서.

초록

엽록체는 식물, 광합성 등 많은 보조 metabolites의 지질 생산에에서 다양 한 세포질 과정을 담당 하는 필수적인 세포 기관이 이다. 엽록체는 이러한 다양 한 생리 적 과정에 대 한 단백질의 많은 수를 요구 한다. 이상의 엽록체 단백질의 95 %cytosolic 리보솜에서 번역 후 핵 인코딩되고는 cytosol에서 엽록체에 가져온 있습니다. 따라서, 적절 한 가져오기 또는 엽록체를이 핵 인코딩 엽록체 단백질의 엽록체 식물 세포의 적절 한 작동에 필수적입니다. 핵 인코딩 엽록체 단백질 포함 엽록체를 특정 대상에 대 한 신호 순서. 분자 기계는 엽록체 또는 cytosol로 이러한 신호를 인식 하 고 가져오기 프로세스를 수행. 단백질 가져오기 또는 vivo에서엽록체를 타겟팅의 메커니즘을 조사, 우리 신속 하 고 효율적인 원생 동물 기반 방법을 개발 애기의 엽록체로 단백질 수입 분석 하. 이 방법에서는, 우리 애기의 잎 조직에서 분리 된 protoplasts를 사용 합니다. 여기, 우리는 단백질 엽록체로 가져올 메커니즘을 조사 하기 위해 protoplasts를 사용 하 여 상세한 프로토콜을 제공 합니다.

서론

엽록체는 식물에서 가장 중요 한 세포 중 하나입니다. 엽록체의 주요 기능 중 하나는 광합성¹수행입니다. 엽록체는 또한 지방산, 아미노산, 뉴클레오티드, 및 수많은 이차 대사 산물^1,2의 생산에 대 한 많은 다른 생 화 확 적인 반응을 실시합니다. 모든이 반응은 엽록체 단백질의 다른 종류의 많은 수를 필요로합니다. 그러나, 엽록체 게놈에는 약 100만 유전자^3,4포함 되어 있습니다. 따라서, 엽록체는 cytosol에서 그들의 단백질의 대부분을 가져와야 합니다. 사실, 대부분의 엽록체 단백질 번역^4,,56후는 cytosol에서 가져올 수을 표시 했다. 식물 세포에는 엽록체에는 cytosol에서 단백질을 가져올 특정 메커니즘이 필요 합니다. 그러나, 이러한 단백질 가져오기 메커니즘 지난 몇 십년에 대 한 조사는, 비록 우리가 아직 이해 하지 않습니다 완전히 그들 분자 수준에서. 여기, 우리 protoplasts를 준비 하 고 protoplasts에 있는 유전자를 표현 하는 것에 대 한 자세한 방법을 제공 합니다. 이 메서드는 elucidating 자세히 엽록체로 단백질 가져오기 기본 분자 메커니즘에 대 한 중요 한 될 수 있습니다.

단백질 가져오기는 많은 다른 방법을 사용 하 여 공부 될 수 있다. 이러한 방법 중 하나는 생체 외에서 단백질 가져오기 시스템^7,8의 사용을 포함. 체 외에서이 방법을 사용 하 여-번역 된 단백질 선구자는 순화 된 엽록체에 생체 외에서인 큐베이 팅 및 단백질 가져오기 SDS 페이지 뒤에 서쪽 오 점 분석에 의해 분석 된다. 이 방법의 장점은 엽록체로 단백질의 각 단계 세부에서 공부 될 수 있다입니다. 따라서,이 방법은 널리 사용 되었습니다 단백질 가져오기 분자 기계 구성 요소를 정의 하 고 교통 펩 티 드에 대 한 시퀀스 정보 부. 더 최근에, 잎 조직에서 protoplasts의 사용을 포함 하는 또 다른 방법은 개발 되었다 고 단백질 가져오기 엽록체^9,10으로 공부를 널리 사용 되고있다. 이 방법의 장점은 그대로 세포의 생체 외에서 시스템 보다 가까이 세포 환경을 제공 하는 protoplasts. 따라서, 원생 동물 시스템 관련된 cytosolic 이벤트 등 어떻게 신호를 표적으로 하기의 특이성 결정은이 과정의 많은 추가 측면을 해결 수 있습니다. 여기, 우리는 단백질 가져오기 엽록체로 공부 하는 protoplasts의 사용에 대 한 자세한 프로토콜 제시.

프로토콜

1입니다. 애기 식물의 성장

1. 1 L Gamborg B5 준비 (B5) 매체 B5 매체의 3.2 g를 추가 하 여 비타민, 자당의 20 g, 2-(N-morpholino) 탄 술 폰 산 (MES), 이온을 제거 된 물 약 800 mL의 0.5 g과 수산화 칼륨 (KOH)와 5.7에 pH를 조정. 추가 더 이온된 물 phytoagar 고압 121 ° c.에 15 분의 1 나 추가 8 g 총 볼륨을가지고
2. 55 ° C까지 냉각 및 깨끗 한 벤치에 페 트리 접시 (지름에서 9 c m, 높이 1.5 c m) B5 매체의 20-25 mL를 붓고 매체를 허용 합니다. 2-3 일 건조 접시, 깨끗 한 포장으로 그들을 포장 하 고 사용까지 냉장고에 보관.
3. 애기 thaliana 소독 씨앗 지속적으로 2-3 분 동안 흔들어 하 여 원심 분리기 튜브 (e-튜브)에서 70% (v/v) 에탄올의 1 mL는 상쾌한 제거, 1% (v/v) 염소 용액 1 mL를 추가 및 2-3 분 위해 지속적으로 흔들 준비 100 -페 트리 접시 당 150 씨앗입니다.
   1. supernatants 제거 하 고 증류수의 1 mL와 함께 씨앗을 씻어. 4 배속이이 단계를 반복 합니다. 씨앗 발 아 동기화를 3 일 동안 4 ° C에서 소독된 씨앗을 놓습니다.
4. 100-150는 micropipette를 사용 하 여 b 5 판에 씨앗을 뿌리 다을 외과 테이프와 접시를 봉인.
5. 2 주 동안 100 µmol·m^-2·s^-1 빛의 강도, 70% 상대습도 20 ° C 온도에 16 h/8 h 명암 주기 성장 방에 식물을 성장 한다.

2입니다. 플라스 미드의 준비

참고: 고 순도 플라스 변환; 사용 해야 상용 플라스 미드 정화 키트를 사용 하 여 것이 좋습니다.

1. 플라스 미드 정화 (Rbc-nt:GFP) DNA 분리 kit를 사용 하 여. DNA를 집중, 1.5 mL 튜브에 에탄올 강수량을 수행 하 고 증류수의 100 µ L에서 DNA 펠 릿을 분해. 260에는 분 광 광도 계를 사용 하 여 플라스 미드의 농도 결정 nm. 희석의 최종 농도에 플라스 미드 ~ 2 µ g / µ L.까지 사용-20 ° C에서 유지 플라스 미드.

3입니다. Protoplasts의 격리

1. 다음과 같은 솔루션을 준비 합니다.
   1. 0.25% (w/v) macerozyme, 1.0% (w/v) cellulase, 400 m m D-마 니 톨, 8 m m 칼슘 염화 물 (CaCl₂), 0.1% (w/v) 소 혈 청 알 부 민 (BSA), 포함 효소 솔루션을 준비 하 고 5mm MES. 5.6 코와 pH를 조정 합니다.
      1. 효소 솔루션 0.45 μ m 기 공 크기와 셀 루 로스 아세테이트 필터 단위를 사용 하 여 필터링 합니다. -20 ° c.에 계속 50 mL 원뿔 튜브에 효소 솔루션의 aliquot 25 mL 효소 솔루션 (RT) 실 온에서 해 동 하 고 사용 직전에 잘 섞는다.
   2. 솔루션 이온된 물과 압력솥의 100 mL에 자당의 21 g을 용 해 하 여 21% (w/v) 자당 솔루션을 준비 합니다.
   3. W5 154 m m 염화 나트륨 (NaCl), 125 mM CaCl₂, 5mm 염화 칼륨 (KCl), 5 mM 포도 당, 및 1.5 m m MES 솔루션을 준비 합니다. 코와 고압 솔루션 5.6 pH를 조정 합니다.
   4. MaMg 솔루션 포함 400 m m D-마 니 톨, 15 m m 염화 마그네슘 (MgCl₂), 준비 및 5mm MES. 코와 고압 솔루션 5.6 pH를 조정 합니다.
   5. 1 M D-마 니 톨 및 1 M 칼슘 질산염 재고 솔루션을 페그 솔루션을 준비 합니다. 압력솥이이 솔루션.
2. 그대로 잎 조직에서 2 주 오래 된 식물에서 수확 ~ 수술 칼과 장소를 사용 하 여 1-2 B5 판 50 mL 원뿔형으로 수확된 잎 관 효소 솔루션의 포함 25 mL. 어둠 속에서 부드러운 동요와 함께 회전 통에 가로로 효소 솔루션와 잎 조직을 포함 하는 원뿔 튜브를 놓습니다. 그것은 8-12 h 잎 조직의 전체 소화 걸립니다.
3. 부 화 후 8-12 h, 메시 140 µ m 기 공 크기를 통해 신선한 배양 접시에 (잎 조직에서 발표 하는 protoplasts를 포함 하는) 효소 솔루션을 붓는 다. 신중 하 게 21% (w/v) 자당 솔루션의 15 mL 위에 포함 하는 원생 동물 효소 솔루션을 레이어 하 고 낮은 가속 및 감속 설정 진동 물통 회전자에 10 분 동안 98 x g에서 원심.
4. 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 신중 하 게는 protoplasts 맨 위 레이어 (효소 솔루션)와 인터페이스에서 사이 전송 효소 솔루션 및 자당 솔루션 W5 솔루션의 30 mL를 포함 하는 50 mL 원뿔 튜브에. 51 x g 6 분에이 튜브 원심 이 단계에서 protoplasts 펠 릿 원뿔 튜브의 하단에 있을 것입니다.
5. Protoplasts 펠 렛을 방해 하지 않고 한 피 펫을 사용 하 여 신중 하 게 상쾌한을 삭제 합니다. W5 솔루션의 25 mL를 추가 하 고 부드럽게는 protoplasts resuspend. 원생 동물 솔루션 안정화를 위해 적어도 1 시간 동안 4 ℃ 냉장고에서 품 어.

4. 폴 리 에틸렌 글리콜을 사용 하 여 원생 동물 전이

1. 준비 하는 40 %50 mL 원뿔 튜브로 던지다 8000의 4 g, 1 M 마 니 톨 솔루션의 4 mL, 1 mL의 1 M Ca (₃)₂, 및 1.8 mL 증류수를 추가 하 여 솔루션을 던지다 하 고 잘 섞으십시오. PEG 40 %20-30 미 장소는 전자 레인지에서가 열 하 여 분해 냉각을 위한 RT에서 못 솔루션.
   참고: 40% 못 솔루션을 신선 하 게 준비 되어야 한다 모든 시간. Protoplasts는 하지 수송과 완전히 냉장고에 4 ° C 인큐베이션 기간 동안, 만약 원심 2 분 46 x g에 소재.
2. 신중 하 게 하지만 완전히는 상쾌한을 제거 하 고 추가 MaMg 솔루션 5 x 10⁶/mL의 농도를 원생 동물 펠 릿.
   참고: 원생 동물의 수는 현미경으로 본 hemocytometer에 의해 확인할 수 있습니다.
3. 각 빈 13 mL 플라스 미드 DNA의 장소 10 µ g 라운드-하단 튜브와는 피 펫을 사용 하 여 원생 동물 솔루션의 300 µ L를 추가 합니다.
   참고: 피 펫 팁의 끝 잘라 되어야 합니다. Protoplasts 샘플링 됩니다 때마다 원생 동물을 포함 하는 솔루션 protoplasts의 동일한 수 각 관에 추가 되도록 pipetting 앞 resuspended 한다.
4. 부드럽게 튜브를 회전 하 여 protoplasts와 플라스 미드 DNA를 혼합 하 고 즉시 추가 40%의 300 µ L를 피 펫을 사용 하 여 못 솔루션. 튜브를 회전 하 여 부드럽게 하지만 완전히 혼합 하 고 실내 온도;에 30 분 동안 품 어 튜브를 거의 수평으로 기울기와 여러 번 회전.
5. W5 솔루션의 1 mL을 추가 하 고 비슷한 방식으로 손으로 튜브를 회전 하 여 부드럽게 하지만 완전히 혼합. 실 온에서 10 분에 대 한 샘플을 품 어.
6. 두 번 더 사용 하 여 1.5 mL 그리고 W5 솔루션의 2 mL 각각이 단계를 반복 합니다. W5 솔루션의 최종 추가 후 30 분 동안 품 어.
7. 4 분 삭제는 상쾌한 46 x g에서 centrifuge 고 W5 솔루션의 2 개 mL를 추가 합니다. 부드럽게 하지만 완전히 혼합. 어두운 약 실에 있는 22 ° C에서 품 어.

5. 엽록체에는 단백질의 분석

참고: protoplasts의 페그 중재 변환 후 보육 시간 범위 8에서 24 시간.

1. 형광 현미경 검사 법
   1. 손질 팁 그리고 신중 하 게 피 펫을 사용 하 여 슬라이드 유리에 원생 동물 솔루션의 장소 10 µ L는 protoplasts의 손상을 방지 하려면 coverslip 커버.
   2. 장소 여기/방출 필터 장착 형광 현미경의 스테이지의 슬라이드는 녹색 형광 단백질 (GFP)와 엽록소 자동 형광 관찰에 대 한 설정 합니다.
   3. 냉각된 전 하 결합 소자 (CCD) 카메라 및 프로세스 이미지 의사 컬러 이미지를 생산 하는 이미지 편집 소프트웨어를 사용 하 여 이미지를 캡처하십시오.
2. 총 단백질 추출 및 Immunoblotting
   1. 2.5% (w/v) 나트륨 dodecylsulfate (SDS), 그리고 2% (v/v) 2-mercaptoethanol을 포함 하는 변성 버퍼를 준비 합니다.
      참고: 엽록체로 단백질 가져오기 교통 펩 티 드 immunoblot 분석 통해 안티-GFP 항 체를 사용 하 여 처리의 정도 측정 하 여 측정할 수 있습니다.
   2. 원심 분리기 튜브 및 4 분 46 x g에서 원심 분리기로 protoplasts를 전송 합니다.
   3. 제거는 상쾌한 고 변성 버퍼의 80 µ L를 추가 합니다. 5에 대 한 적극적으로 소용돌이의 SDS 샘플 버퍼 (250 mM Tris-Cl (pH 6.8), 0.5 M DTT, 10% (w/v) SDS, 0.05% (w/v) Bromophenol 파랑 및 50% (v/v) 글리세롤) x 5를 추가 하 고. 잘 혼합 하 고 10 분 동안 삶아.
   4. 이 단백질 샘플 표준 SDS 페이지를 안티-GFP 항 체와 immunoblotting 주제.

결과

엽록체에 단백질의 수입 두 가지 방법을 사용 하 여 시험 될 수 있다: SDS 페이지 중재 분리 후 형광 현미경 검사 법 및 immunoblot 분석. 여기, 우리는 Rbc 사용-nt:GFP, 융합 건설 Rbc GFP 융합 교통 펩 티 드를 포함 하는 79 N 맨끝 아미노산 잔류물을 인코딩. 대상 단백질 Rbc에서에서 녹색 형광 신호 단백질은 엽록체로 가져오면-형광 현미경 검사 법 (그림 1)에 의해 검사 nt:GFP 엽록소 자동-형광에서 빨간 형광 신호와 병합 해야 합니다. 2 개의 신호의 가까운 중복 단백질 가져오기를 엽록체로 나타냅니다. 종종 GFP 신호는 엽록체에 걸쳐 확산 또는 개별 단백질에 따라 엽록체를 통해 약하게 확산 신호와 엽록체의 센터에서 집중 된다. 단백질의 가져오기 immunoblot 분석 GFP 항 체를 사용 하 여 확인할 수 있습니다. 총 단백질 protoplasts에서 준비 하 고 SDS 페...

토론

우리는 엽록체에 단백질 가져오기 공부 애기 의 protoplasts의 사용에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 이 메서드는 강력한 단백질 가져오기 프로세스를 조사. 이 간단 하 고 다재 다능 한 기술은 엽록체를 의도 화물 단백질을 대상으로 조사 하기 위한 유용 합니다. 이 메서드를 사용 하 여, protoplasts는 매우 일찍 완전히 성숙한 잎에서 배열 하는 많은 다른 성장 단계에서 식물에서 얻을 수 있는 애기^11,12 의 잎 조직에서 준비 된다. 그러나, 해야 합니다 주의 원생 동물 준비를 위해 사용 되는 식물을 성장 하는 때. 하나로 protoplasts 건강 한 식물에서 준비 못 중재 변환에 관련 된 많은 단계를 견딜 수 있는 매우 건강 한 식물을 사용 해야 합니다. 또 다른 중요 한 경고는 신선한 솔루션을 사용 하는 이다. 크게 솔루션의 농도에서 약간의 변화는 약하고 매우 삼투성...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
비타민을 포함한 GAMBORG B5 매체	Duchefa Biochemie	G0210.0050
SUCROSE	Duchefa Biochemie	S0809.5000
MES MONOHYDRATE	Duchefa Biochemie	M1503.0250
한천, 분말	JUNSEI	24440S1201
미세 기공 수술 테이프	3M	1530-0
수술 블레이드 스테인리스 No.10	FEATHER	사용할 수 없는
원추형 튜브, 50ml	SPL 생명 과학	50050
Macerozyme R-10	YAKULT PHARMACEUTICAL IND.	사용할 수 없는
셀룰라아제 ONOZUKA R-10	야쿠르트 제약 공업	사용할 수 없음
ALBUMIN, BOVINE (BSA)	VWR	0332-100G
D-Mannitol	SIGMA	M1902-1KG
CALCIUM CHLORIDE, DIHYDRATE	MP BIOMEDICALS	0219463505-5KG
Twister	VISION SCIENTIFIC	VS-96TW
CD-1 용 스크린 컵	SIGMA	S1145
스크린	SIGMA	S3895
페트리 접시	SPL LIFE SCIENCES	10090
파스퇴르 피펫	HILGENBERG	3150102
실험실용 원심분리기 / 벤치탑	비전 Scientific	VS-5500N
염화나트륨	JUNSEI	19015S0350
염화칼	SIGMA	P3911-1KG
D-GLUCOSE, ANHYDROUS	BIO BASIC	GB0219
수산화칼륨	DUKSAN	40
질산칼슘 사수화물	SIGMA	C2786-500G
폴리(에틸렌 글리콜)	SIGMA	P2139-2KG
염화마그네슘 육수화물	SIGMA	M2393-500G
튜브 13ml, 100x16mm, PP	SARSTEDT	55.515
현미경 슬라이드	MARIENFELD	1000412
현미경 커버 안경	MARIENFELD	101030
계수 챔버	MARIENFELD	650030
Axioplan 2 이미징 현미경	Carl Zeiss	사용할 수 없음
마이크로 튜브 1.5ml	SARSTEDT	72.690.001
2- 메르캅토에탄올	SIGMA	M3148-250ML
소듐 도데실 설페이트(SDS), 프로테믹스 등급	VWR	M107-500G
TRIS, 초순수 등급	VWR	0497-5KG
DTT (DL-디티오트레이톨), 생명공학 등급	VWR	0281-25G
브로모페놀 블루 나트륨 염 ACS	VWR	0312-50G
글리세롤	JUNSEI	27210S0350
Living Colors A.V. 단클론 항체 (JL-8)	TAKARA	632381