전자 상자성 공명 (EPR) 분광학은 자유 래 디 칼을 측정 하는 명확한 방법입니다. 선택적 스핀 프로브를 사용 하 여 다른 세포질 격실에서 자유 래 디 칼의 검출에 대 한 수 있습니다. 우리는 치료, 저장 및 전송 EPR 측정용 샘플을 용이 하 게 하는 생물 학적 샘플을 수집 하는 실용적이 고 효율적인 방법을 제시.
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이 논문에서
요약
초록
다른 세포와 조직 구획에서 반응성 산소 종 (선생님)의 정확 하 고 구체적인 검색 생물 설정에서 신호 redox 규제의 연구에 필수적 이다. 전자 상자성 공명 분광학 (EPR) 자유 래 디 칼을 명확 하 게 평가 하는 유일한 직접적인 방법입니다. 그것의 장점은 특정 종의 생리 수준 높은 특이성을 감지 하지만 전문된 기술, 주의 샘플 준비, 그리고 적절 한 컨트롤 데이터의 정확한 해석을 보장 하기 위해 필요. 주기적 hydroxylamine 스핀 프로브 superoxide 또는 EPR 분광학에 의해 양이 정해질 수 있다 nitroxide 신호를 생성 하기 위해 다른 래 디 칼과 선택적으로 반응 합니다. 세포 투과성 스핀 프로브와 스핀 프로브는 미토 콘 드리 아에서 급속 하 게 축적 하도록 설계 된 다른 세포질 격실에서 초과 농도의 결정에 대 한 수 있습니다.
배양된 세포, 세포 투과성 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH)와 함께 고 셀 불 침투성 superoxide dismutase (잔디) 전처리 없이 사용 또는 세포 침투성 페그-잔디의 사용에 대 한 수는 cytosolic superoxide에서 세포 외의 차별화입니다. 미토 콘 드리 아 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethyl-piperidine,1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido] piperidinium dichloride (미토-템포-H) 측정 가능 미토 콘 드리 아 데 선생님 (주로 초과)
스핀 프로브 및 EPR 분광학 vivo에서 모델에 적용할 수 있습니다. Superoxide는 extracellular 체액 혈액과 치경 유체 등 폐 조직 같은 조직에서 검색할 수 있습니다. 여러 가지 방법은 처리 및 저장 EPR 측정에 대 한 조직 정 맥 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CPH) 스핀 프로브 비보를 전달 하 되 게 됩니다. 실 온에서 측정을 수행할 수 있습니다, 하는 동안 생체 외에서 그리고 vivo에서 모델에서 얻은 샘플 또한-80 ° C에 저장 고 수 77 공화국에서 EPR에 의해 분석 샘플 특수 튜브 안정-80 ° c에 저장 고 실용적, 효율적 있도록 77 K 및 저장 및 전송 샘플을 용이 하 게 재현할 수 방법에서 실행 될 수 있습니다.
서론
모든 기관 시스템 산화 스트레스와 반응성 산소 종의 다양 한 질병의 연구에 중요 한 동안, 반응성 산소 종 (선생님)의 검출 짧은 반감기와 높은 반응성 도전 이다. 전자 상자성 공명 (EPR) 기법 자유 래 디 칼을 탐지 하기 위한 가장 명확한 방법입니다. 스핀 프로브는 더 일반적으로 사용 되는 형광 프로브 이점이 있다. 형광 프로브는 상대적으로 저렴 하 고 쉽게 사용 하 고 선생님의 빠른, 민감한 감지를 제공, 비록 그들은 artifactual 신호, 선생님 농도, 그리고 특이성1의 일반적인 부족을 계산 하는 무 능력 때문에 심각한 제한을 하지 않아도 .
생물 학적 연구에 대 한 EPR의 사용을 촉진 하기 위하여 다양 한 생물학 관련 자유 래 디 칼 종으로 포2, pH, 그리고 산화의 범위를 측정할 수 있는 프로브 합성 된 스핀 상태2,3, 4,5,,6
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프로토콜
모든 동물 연구 대학 콜로라도 덴버 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 되었다.
1입니다. 시 약의 준비
-
Diethylenetriaminepentaacetic 산 (DTPA) 주식 (150 mM)
- DTPA의 2.95 g를 추가 (393.35 g/mol)의 이온된 수 10 ml.
- DTPA 해산 dropwise 1 M NaOH 추가 7.0의 pH.
- 150 m m의 최종 DTPA 농도 대 한 물 50 mL에 볼륨을 가져오고 4 ° c.에 저장
-
인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) (50 m m, pH 7.4)
- 염화 나트륨 (NaCl) (58.44 g/mol; 29.22 g/100 mL)의 5 M를 준비 합니다.
- 칼륨 인산 염 염기 홍콩2포4 (174.18 g/mol; 17.42 g/100 mL)의 1m 준비
- 칼륨 인산 이수소 KH2포4 (136.1 g/mol; 13.61 g/100 mL)의 1m를 준비 합니다. 인산 이수소 4.2....
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결과
초과 검출 CMH을 사용 하 여 X를 사용 하 여 확인 했다 / XO superoxide catalase 했다 영향을 주지 않습니다 (그림 1A) nitroxide (.CM) 신호 잔디에 의해 저해 완벽 하 게 했다을 설명 하기 위해 시스템 생성. 총, extracellular superoxide 다음 잔디 전처리 + 세포 투과성 CMH 스핀 프로브 RAW 264.7 세포 배양 세포에 의해 평가 되었습니다. Nitroxide 농도 세포 현 탁 액 및 버퍼를 두 가지 샘플 유형에서 값 투과 특성 및 스핀 프로브 (그림 1B)의 빠른 평형 유사 했다 시연에서 측정 했다. Nitroxide 급진적인 신호 제어 셀에 비해 PMA RAW 264.7 세포 자극된에 증가. 이 신호는 크게 셀 셀 스며들 지 않는 잔디 (그.......
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토론
생물 학적 설정에서 자유 래 디 칼 생산의 평가 이해 redox 규제 건강과 질병, 신호에 중요 하지만 이러한 종류의 측정은 매우 자유 래 디 칼의 짧은 반감기 때문에 도전적이 고 기술 일반적으로 사용 되는 방법으로 제한입니다. 그것은 자유 래 디 칼을 탐지 하기 위한 유일한 명백한 방법으로 EPR는 산화 환 원 생물학, 귀중 한 하 고 강력한 도구입니다. 이 프로젝트에서 실험을 디자인 하 고 선생님 스핀을 사용 하 여 체 외에 다른 세포질 구획 및 다른 조직 구획에 프로브를 감지 하는 샘플을 준비 하는 실용적인 EPR 방법을 설명 vivo에서. 우리는 또한 생물 학적 샘플을 처리 하 고 효율성을 개선 하기 위해 샘플을 저장 하는 실용적인 방법을 제공 합니다.
스핀 프로브 선생님과 효율적으로 반응 하 고 안정적인 nitroxide 급진적인 EPR로 검출 될 수 있는 생산. 스핀 프로브 (주기적 hydroxylamine)의 여러 파생 그들을 다른 세.......
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
이 작품은 의학 학장의 전략적 연구 인프라 상, R01 HL086680-09 1R35HL139726-01, E.N.G. 및 UCD CFReT 화목 상 (그)의 콜로라도 대학 학교에 의해 지원 되었다. 저자는 박사 산드라 이튼 박사가 레 스 이튼 (덴버 대학교), 박사 제럴드 로젠 박사 조셉 P. Kao (메릴랜드 대학), 그리고 박사 Sujatha Venkataraman (대학의 콜로라도 덴버) 유용한 토론, 그리고 조 앤 Maltzahn, 애슐리 감사 합니다. Trumpie와 기술 지원에 대 한 아이비 맥 더 못 (덴버 콜로라도의 대학).
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| DMEM | LifeTech | 10566-016 | 세포 배양 매체 |
| 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA) | Sigma Aldrich | D6518-5G | |
| 염화나트륨 (NaCl) | 피셔 사이언티픽 | BP358-212 | 50 mM 인산 식염수 완충액을 준비하는 데 사용됩니다 Sigma aldrish에 따르면 |
| 인산칼륨 이염기성 (HK2PO4 ) | Fisher Scientific | BP363-500 | 50 mM 인산염 식염수 완충액을 준비하는 데 사용됩니다 Sigma aldrish에 따르면 |
| 인산칼륨 일염기성 (KH2PO4 ) | Sigma Aldrich | P-5379 | 는 50 mM 인산염 식염수 완충액을 준비하는 데 사용됩니다. |
| 크렙스-헨셀레이트 완충액 (KHB) | (Alfa Aesar, Hill) | J67820 | |
| 소 적혈구 과산화물 디스뮤타아제(SOD) | 시그마 알드리치 | S7571-30KU | |
| Phorbol 12-미리스테이트 13-아세테이트 (PMA) | 시그마 알드리치 | P1585-1MG | DMSO |
| 안티마이신 A (AA) | 시그마 알드리치 | A8674-25MG | 에탄올에 용해 유리 바이알에 보관 (사용 된 MW는 4 개 로트의 평균 분자량) |
| 1- 하이드 록시 -3- 메 톡시 카르 보닐 -2,2,5,5- 테트라 메틸 피롤 리딘. HCl (CMH) | 엔조 생명 과학 | ALX-430-117-M050 | |
| 1-하이드록시-3-카르복시-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘. 엔 | 조 생명 과학 | ALX-430-078-M250 | |
| 1-하이드록시-4-[2-트리페닐포스포니오)-아세타미도]-2,2,6,6-테트라메틸피페리딘, 1-하이드록시-2,2,6,6-테트라메틸-4-[2-(트리페닐포스포니오)아세타미도]피페리디늄 디클로라이드 (미토-TEMPO-H) | 엔조 생명 과학 | ALX-430-171-M005 | |
| 1-하이드록시-2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일-트리메틸암모늄 클로라이드. HCl (CAT1H) | Enzo Life Sciences | ALX-430-131-M250 | |
| 헤파린 | Sagent 제약 | NDC 25021-400-10 | |
| 디페닐리오도늄 클로라이드 | Sigma Aldrich | 43088 | |
| Deferoxamin 메실레이트 소금 | Sigma Aldrich | D9533-1G | |
| Critoseal | Leica | 39215003 | |
| 브랜드 일회용 BLAUBRAND 마이크로피펫, intraMark | Sigma Aldrich | 708733 | Capillaries |
| PTFE 프랙셔널 플루오로폴리머 튜빙 3/16" 외경 x 1/8 " ID | NORELL | 1598774A | 테프론 튜빙 |
| NMR 샘플 튜브용 실리콘 고무 마개 OD가 4mm-5mm (3.2mm에서 4.2mm ID)인 얇은 벽 튜브용 TS-4-5-SR | NORELL | 94987 | |
| EMXnano 벤치탑 EPR 분광계 | Bruker BioSpin GmbH | E7004002 | |
| EMX 나노 티슈 셀 | Bruker BioSpin GmbH | E7004542 |
참고문헌
- Kalyanaraman, B., et al. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations. Free Radical Biology and Medicine. 52 (1), 1-6 (2012).
- Bobko, A. A., et al.
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