방법 논문

사용 주위 온도 77 K에서 생물학 견본에서 전자 상자성 공명

DOI:

10.3791/58461

⸱

2019년 1월 11일

 ,  ,  ,  , 
1Cardiovascular Pulmonary Research Laboratories and Pediatric Critical Care Medicine, Department of Pediatrics, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 2Bruker BioSpin Corp, 3Department of Medicine, Division of Clinical Pharmacology, Vanderbilt University Medical Center

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

전자 상자성 공명 (EPR) 분광학은 자유 래 디 칼을 측정 하는 명확한 방법입니다. 선택적 스핀 프로브를 사용 하 여 다른 세포질 격실에서 자유 래 디 칼의 검출에 대 한 수 있습니다. 우리는 치료, 저장 및 전송 EPR 측정용 샘플을 용이 하 게 하는 생물 학적 샘플을 수집 하는 실용적이 고 효율적인 방법을 제시.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

다른 세포와 조직 구획에서 반응성 산소 종 (선생님)의 정확 하 고 구체적인 검색 생물 설정에서 신호 redox 규제의 연구에 필수적 이다. 전자 상자성 공명 분광학 (EPR) 자유 래 디 칼을 명확 하 게 평가 하는 유일한 직접적인 방법입니다. 그것의 장점은 특정 종의 생리 수준 높은 특이성을 감지 하지만 전문된 기술, 주의 샘플 준비, 그리고 적절 한 컨트롤 데이터의 정확한 해석을 보장 하기 위해 필요. 주기적 hydroxylamine 스핀 프로브 superoxide 또는 EPR 분광학에 의해 양이 정해질 수 있다 nitroxide 신호를 생성 하기 위해 다른 래 디 칼과 선택적으로 반응 합니다. 세포 투과성 스핀 프로브와 스핀 프로브는 미토 콘 드리 아에서 급속 하 게 축적 하도록 설계 된 다른 세포질 격실에서 초과 농도의 결정에 대 한 수 있습니다.

배양된 세포, 세포 투과성 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH)와 함께 고 셀 불 침투성 superoxide dismutase (잔디) 전처리 없이 사용 또는 세포 침투성 페그-잔디의 사용에 대 한 수는 cytosolic superoxide에서 세포 외의 차별화입니다. 미토 콘 드리 아 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethyl-piperidine,1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido] piperidinium dichloride (미토-템포-H) 측정 가능 미토 콘 드리 아 데 선생님 (주로 초과)

스핀 프로브 및 EPR 분광학 vivo에서 모델에 적용할 수 있습니다. Superoxide는 extracellular 체액 혈액과 치경 유체 등 폐 조직 같은 조직에서 검색할 수 있습니다. 여러 가지 방법은 처리 및 저장 EPR 측정에 대 한 조직 정 맥 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CPH) 스핀 프로브 비보를 전달 하 되 게 됩니다. 실 온에서 측정을 수행할 수 있습니다, 하는 동안 생체 외에서 그리고 vivo에서 모델에서 얻은 샘플 또한-80 ° C에 저장 고 수 77 공화국에서 EPR에 의해 분석 샘플 특수 튜브 안정-80 ° c에 저장 고 실용적, 효율적 있도록 77 K 및 저장 및 전송 샘플을 용이 하 게 재현할 수 방법에서 실행 될 수 있습니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

모든 기관 시스템 산화 스트레스와 반응성 산소 종의 다양 한 질병의 연구에 중요 한 동안, 반응성 산소 종 (선생님)의 검출 짧은 반감기와 높은 반응성 도전 이다. 전자 상자성 공명 (EPR) 기법 자유 래 디 칼을 탐지 하기 위한 가장 명확한 방법입니다. 스핀 프로브는 더 일반적으로 사용 되는 형광 프로브 이점이 있다. 형광 프로브는 상대적으로 저렴 하 고 쉽게 사용 하 고 선생님의 빠른, 민감한 감지를 제공, 비록 그들은 artifactual 신호, 선생님 농도, 그리고 특이성1의 일반적인 부족을 계산 하는 무 능력 때문에 심각한 제한을 하지 않아도 .

생물 학적 연구에 대 한 EPR의 사용을 촉진 하기 위하여 다양 한 생물학 관련 자유 래 디 칼 종으로 포2, pH, 그리고 산화의 범위를 측정할 수 있는 프로브 합성 된 스핀 상태2,3, 4,5,,67. 스핀 트랩 또한 단명 래 디 칼을 잡으려고 개발 되었습니다 그리고 양식을 오래-생활 adducts, EPR8탐지를 용이 하 게. (스핀 프로브와 스핀 트랩) 두 클래스는 장점과 제한 사항이 있습니다. 스핀 프로브에의 한 일반적으로 사용 되 클래스는 EPR 침묵 되 고 안정적인 nitroxide를 짧은 기 반응 순환 hydroxylamines. 순환 hydroxylamines 반응 초과 100 배 빠른 스핀 트랩, 세포질 산화 방지 제와 경쟁 하기 위해 그들을 활성화 보다 하지만 그들은 특이성 부족 하 고 적절 한 컨트롤 및 과격 한 종 또는 소스를 식별 하는 억제제의 사용을 필요로 nitroxide 신호를 담당 합니다. 스핀 트랩 전시 특이성, 하는 동안 함께 독특한 패턴 갇혀 종에 따라, 그들은 있다 느린 속도 초과 트랩을 회전 하 고 급진적인의 생 분해 하는 경향이 있다 스펙트럼 adducts. 스핀 트랩 응용 프로그램은 생물 의학 연구9,,1011,,1213에 문서화 되었습니다.

이 프로젝트의 목표는 실험 설계를 위한 실용적인 EPR 방법을 설명 하 고 다른 세포질 격실 생체 외 에서 그리고 다른 조직 구획에서 vivo에서프로브 superoxide 스핀을 사용 하 여 검색 하는 샘플을 준비. 몇몇 원고는 출판 프로토콜 마우스 모델에서 분석을 위한 대상 다른 세포질 구획 시험관 및 프로세스 조직 세포 투과성, 세포-스며들 지 않는, 미토 콘 드 리아 타겟된 스핀 프로브를 사용 하 여 이러한 목표에 관련 된 14 , 15. 우리 문학이 몸 시 정확한 보장 하기 위해 체 외에 다른 세포질 격실에서 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) 스핀 프로브를 사용 하는 superoxide를 측정 하는 방법을 확인 하 여 구축 측량, 결과 왜곡 수 있는 잠재적인 기술 문제를 강조. 우리는 또한 혈액, bronchoalveolar 게 액체, 및 폐 조직 CMH 스핀 프로브를 사용 하 여 EPR 측정을 수행 하는 메서드를 제공 합니다. 이러한 연구는 조직 처리 조직 수확 전에 마우스 다른 스핀 프로브, CPH, 주입 하는 방법을 제시 하는 다른 메서드를 비교 합니다. 마지막으로, 우리는 저장 및 77 공화국에서 EPR 측정 하기 전에 샘플의 전송에 대 한 있도록 소계 (PTFE) 튜브에서 샘플을 저장 하는 실용적인 방법을 개발합니다

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프로토콜

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모든 동물 연구 대학 콜로라도 덴버 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 되었다.

1입니다. 시 약의 준비

  1. Diethylenetriaminepentaacetic 산 (DTPA) 주식 (150 mM)
    1. DTPA의 2.95 g를 추가 (393.35 g/mol)의 이온된 수 10 ml.
    2. DTPA 해산 dropwise 1 M NaOH 추가 7.0의 pH.
    3. 150 m m의 최종 DTPA 농도 대 한 물 50 mL에 볼륨을 가져오고 4 ° c.에 저장
  2. 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) (50 m m, pH 7.4)
    1. 염화 나트륨 (NaCl) (58.44 g/mol; 29.22 g/100 mL)의 5 M를 준비 합니다.
    2. 칼륨 인산 염 염기 홍콩2포4 (174.18 g/mol; 17.42 g/100 mL)의 1m 준비
    3. 칼륨 인산 이수소 KH2포4 (136.1 g/mol; 13.61 g/100 mL)의 1m를 준비 합니다. 인산 이수소 4.24 mL의 1 M 칼륨 인산 염 염기와 1 M 칼륨의 0.760 mL 5 M NaCl의 3 mL을 믹스. PH를 확인 하십시오.
    4. 이온을 제거 된 물 100 mL에 볼륨을 가져와.
    5. 단기 (일)에 대 한 상 온 (RT) 및 장기 (주) 스토리지에 대 한 4 ° C에서 저장 합니다.
  3. Krebs Henseleit 버퍼 (KHB) 100 µ M DTPA를 포함 하
    1. 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에서 150mm DTPA 재고 솔루션의 33.3 µ L를 추가 합니다.
    2. Krebs Henseleit 버퍼 (KHB) 50 mL 볼륨을가지고.
    3. DTPA와 신선한 버퍼 매일 준비 하 고 실시간에 그것을 유지합니다
  4. 자당을 포함 하는 트리 스-EDTA 버퍼
    1. 0.5 M Tris 재고 준비: 15.14 g 150ml의 이온을 제거 된 물에서 트리 스 자료 (121.14 g/mol)의 해산. HCl을 사용 하 여, 7.8에 pH를 조정 하 고 250 mL의 최종 볼륨을.
    2. 자당의 21.4 g 해산 (342.29 g/mol; 최종 농도 = 0.25 m m) 이온 물 150ml에.
    3. 자당 10 mM 최종 트리 스 농도 달성 하기 위해 트리 스 증권의 5 mL를 추가 합니다.
    4. 트리 스-자당 1 mM 최종 농도 달성 하기 위해 0.5 M EDTA 재고의 0.5 mL를 추가 합니다.
    5. 산도 확인 하 고 7.4에 조정.
    6. 이온을 제거 된 물 250 mL의 최종 볼륨을 가져오고 4 ° c.에 저장
  5. 소 적혈구 Cu/Zn superoxide dismutase (잔디) 주식 (30000 U/mL)
    1. 1 mL의 PBS (약 5.7 m g, 잔디의 활동에 따라)에 잔디의 30000 U reconstitute
    2. 음, 약 수, 혼합 하 고 단기 (6-12 개월) 동안-20 ° C에서 및 장기 저장을 위한-80 ° C에서 저장.
  6. 잔디 작업 솔루션 (1000 U/mL)
    1. 살 균 PBS의 870 µ L에 30000 U/mL 잔디 주식의 30 µ L 약 수를 전송 합니다.
    2. 얼음, 솔루션을 유지 하 고 신선한 사용.
  7. Phorbol myristate 12 13-아세테이트 (PMA) 주식 (5 mM)
    1. PMA의 1 마그네슘을 해산 (616.83 g/mol) DMSO의 325 µ L에서 (최종 농도 = 5 mM).
    2. 약 5mm PMA 솔루션 수-20 ° c.에 그것을 저장 하 고
  8. PMA 작업 솔루션 (125 µ M)
    1. 5mm PMA 주식의 10 µ L 약 수 살 균 PBS의 390 µ L로 희석.
    2. 얼음에 솔루션을 유지 하 고 신선한 사용.
    3. PMA에 대 한 차량 제어에 대 한 PBS의 390 µ L에서 DMSO의 10 µ L을 사용 합니다.
  9. Diphenyliodonium 염화 (DIP) (2.5 m m)
    1. 3.2 밀리 그램의 분해를 2.5 m m 재고 4 ml (316.57 g/mol)를 찍어.
    2. 솔루션을 준비 하 고 신선한 사용.
  10. Deferoxamine mesylate 소금 (DFO) (20mm)
    1. 돌연 사 했을까의 4.5 mg 해산 (656.79 g / mol) 20 m m 재고를 340 µ L에서.
    2. 솔루션을 준비 하 고 신선한 사용.
  11. Antimycin A (AA) 주식 (5 mM)의 준비
    1. AA의 5.4 mg 해산 (532 g/mol) 에탄올의 2 ml에서 (최종 농도 = 5 mM).
    2. 약 유리 튜브에-20 ° c.에 게 주식 수
  12. 스핀 프로브의 준비
    1. 버퍼에서 용 존된 산소를 제거 하 50 m m 인산 염 버퍼 포함 100 µ M DTPA 30 분에 대 한 질소와 거품.
    2. -20 ° C 냉동 고에서 스핀 프로브를 제거 하 고 RT (10-15 분)에 서 컨테이너를 허용.
    3. 2.4 mg 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine·의 밖으로 무게 HCl (CMH) (237.8 g/mol)
    4. 10 m m의 최종 농도 deoxygenated 인산 염 버퍼의 1 mL에 CMH를 분해.
    5. 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethylpiperidine,1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido]piperidinium dichloride (미토-템포-H) (529.1 g/mol)의 5 밀리 그램을 무게.
    6. 9.5 m m의 최종 농도 deoxygenated 인산 염 버퍼의 1 mL에 미토-템포-H를 해산.
    7. 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine·의 4.9 m g으로 무게 HCl (CPH) (223.7 g/mol).
    8. CPH 22 m m의 최종 농도 deoxygenated 인산 염 버퍼의 1 mL에 녹.
    9. 약 수 및 저장소-80 ° c (동결-해 동 권장 하지 않음).

2. 초과 체 외 의 탐지

  1. RT에서 PMA 자극 RAW 264.7 세포에서 세포 외, 총 및 세포내 초과 검출
    1. 다음 적절 한 무 균 기술을, RAW 264.7 세포를 해 동 하 고 10 %FBS (낮은 내 무료)와 암 피 실린 1 %antimycotic / CO2 배양 기에서 37 ° C에서 보충 DMEM 미디어에서 그들을 통과.
    2. 1 x 106 셀/잘 6 잘 플레이트 한 전날 치료에 씨앗 RAW 264.7 세포.
    3. 부드럽게 미디어를 제거 하 고 셀 KHB 버퍼의 1 mL을 한 번 씻어.
    4. KHB 100 µ M DTPA 각 음에 포함 된 추가 하 고 다음으로 500 µ L의 총 볼륨에서 치료.
    5. 웰 스, 잔디와 청소용된 추가 15 µ L/잘 떼 작업 솔루션의 (1000 U/mL; 잔디의 최종 농도 = 30 U/mL)와 CMH와 PMA의 추가 전에 37 ° C에서 10 분 동안 품 어.
    6. 12.5 µ L/10 m m CMH 주식 잘 추가 (최종 농도 = 0.25 m m).
    7. 40 µ L/잘 125 µ M PMA 작업 솔루션의 추가 (최종 농도 = 10 µ M) 또는 40 µ L 차량 (주식 10 µ L DMSO의 PBS의 390 µ L에서).
    8. CO2 배양 기에서 37 ° C에서 50 분 동안 품 어.
    9. 인큐베이터에서 플레이트를 제거 하 고 즉시 얼음에 그들을 배치.
    10. 튜브를 표시 하는 별도, 1.5 mL에 각 우물에서 버퍼를 수집 합니다. 전체 얼음에 계속.
    11. 100 µ M DTPA를 포함 하는 신선한 KHB 버퍼의 100 µ L 추가, 부드럽게 긁어 셀, 하 고 몇 번 위아래로 pipetting으로 resuspend. 셀 물의 resuspension 내내 얼음에 계속.
    12. 부하는 샘플 수집 단계 2.1.10 2.1.11 (50 µ L)에서 모 세관 튜브의 각. 양쪽 끝을 밀봉 하 고는 EPR를 실행 합니다.
      참고: 항상 테스트 튜브 또는 잘 (셀) 하지 않고 버퍼에 프로브를 포함 된 (같은 농도 = 0.25 m m), 조사의 배경 강도 이므로 온도-제어로 셀 (동일한 보육 시간 및 온도)로 서 동일한 조건 하에서 치료 그리고 시간에 따라 다릅니다.
    13. 다음에 EPR 수집 매개 변수를 설정: 마이크로파 주파수 = 9.65 g h z; 센터 필드 = 3432 G; 진폭 변조 = 2.0 G; 청소 폭 = 80 G; 전력 전자 레인지 = 19.9 mW; 검사의 총 수 = 10; 청소 시간 = 12.11 s; 그리고 시간 상수 = 20.48 석사.
  2. RAW 264.7 세포에서 미토 콘 드리 아 초과 검출
    1. 단계 2.1.1, 2.1.2 씨앗 RAW 264.7 세포 실험에 앞서 1 일.
    2. 미디어를 제거 하 고 셀 KHB 버퍼의 1 mL을 한 번 씻어.
    3. 100 µ M DTPA 각 우물에 포함 된 KHB의 200 µ L를 추가 합니다.
    4. 5.3 µ L/9.5 m m 미토-템포-H 주식의 잘 추가 (최종 농도 = 0.25 m m)
    5. 실시간에서 10 분 동안 품 어
    6. Antimycin A (AA), 에탄올에 5 m m 재고 솔루션의 1 µ L/잘 추가 (최종 농도 = 25 µ M).
    7. CO2 배양 기에서 37 ° C에서 50 분 동안 품 어.
    8. 인큐베이터에서 플레이트를 제거 하 고 즉시 얼음에 그들을 배치.
    9. 부드럽게 긁어 셀과 아래로 pipetting으로 resuspend. 얼음에 계속.
    10. 모 세관 튜브에서 샘플을 로드 합니다. 양쪽 끝을 밀봉 하십시오.
    11. EPR 설정에 대 한 이전 섹션을 참조.
  3. 77 K에서 RAW 264.7 세포에서 초과 검출
    1. 1.1.10 사전 준비 PTFE 튜브 길이 (3/16"x 1/8" ID OD)에 1-2 인치에에서 단계에서 수집 된 버퍼를 놓습니다. PTFE 튜브는 바로 그래서 그것은 쉽게 삽입 될 수 있습니다 및 손가락에서 제거 되었는지 확인 dewar. PTFE 튜브의 한쪽 끝, 닫고, PTFE 튜빙에 버퍼 또는 세포 현 탁 액 (100 ~ 150 µ L) 플라스틱 두 번째 스 토퍼와 배관 밀봉 고무 마 개를 사용 합니다.
    2. 플래시 동결 액체 질소에 샘플입니다. 샘플-80 ° C에서 스토리지에 대 한 레이블이 cryopreservation 튜브로 전송 하거나 즉시 실행 될 수 있습니다.
    3. 손가락을 채우기 액체 질소와 삽입 손가락으로 샘플을 포함 하는 PTFE 튜빙 dewar dewar. 샘플 공의 활성 공간에서 중심 이며 77 K. EPR 실행 있는지 확인
      참고: 당신의 분석기에 질소 가스 흐름을 시작 15-30 분을 측정 하기 전에 측정 공에 물 응축을 방지 하 고 전체이 흐름을 계속 하 고.
    4. 다음에 EPR 수집 매개 변수를 설정: 마이크로파 주파수 = 9.65 g h z; 센터 필드 = 3438 G; 진폭 변조 = 4.0 G; 청소 폭 = 150 G; 전력 전자 레인지 = 0.316 mW; 검사의 총 수 = 10; 청소 시간 = 60 s; 그리고 시간 상수 = 1.28 석사.

3. EPR 측정 유체에

  1. 전 혈
    1. 마우스 (8-12 주 이전) PBS 또는 앞에서 설명한16,17로 혼자 PBS에 녹아 있는 intratracheal bleomycin (Bleo; 1 U/mL에서 100 µ L)의 단 하나의 복용량으로 취급 합니다.
    2. Exsanguination 및 자 궁 경부 전위 흡입된 isoflurane (1.5-4%)을 투여 하 여 쥐를 안락사. 우 심 실을 통해 혈액으로 헤 파 린 (USP/1000ml) 100 µ M DTPA 및 1.5 mL 튜브에 들어 있는 주사기로 발음.
    3. 별도 1.5 mL 튜브에 100 µ M DTPA를 포함 하는 PBS의 15 µ L을 추가 하 고 150 µ L의 총 볼륨 및 0.2 m m의 최종 CMH 농도 대 한 혈액의 132 µ L CMH (10 m m)의 3 µ L.
    4. 물 욕조에 37 ° C에서 10 분에 대 한 혈액을 품 어.
    5. 물 탕에서 튜브를 제거 합니다.
    6. 모 세관 튜브에 혈액을 로드 하 여 한 약 수를가지고 고 RT에 다음 EPR 인수 매개 변수와 함께 실행 하는 EPR: 마이크로파 주파수 = 9.65 g h z; 센터 필드 = 3432 G; 진폭 변조 = 1.0 G; 청소 폭 = 80 G; 전력 전자 레인지 = 19.9 mW; 검사의 총 수 = 3; 청소 시간 = 12.11 s; 그리고 시간 상수 = 20.48 양 또는 샘플에 설명 된 단계 2.3 냉동 플래시 수 있습니다 측정 77 K. EPR 인수 매개 변수는 다음: 전자 레인지 주파수 = 9.65 g h z; 센터 필드 = 3438 G; 진폭 변조 = 4.0 G; 청소 폭 = 150 G; 전력 전자 레인지 = 0.316 mW; 검사의 총 수 = 2; 청소 시간 = 60 s; 그리고 시간 상수 = 1.28 석사.
  2. Bronchoalveolar 게 액체 (BALF)
    1. 안락사 후 (단계 3.1.2 참조) 천천히 주입 하 고 철수 1 mL의 PBS는 주사기를 통해 기도에 정 위치에 3 번 100 µ M DTPA를 포함 하 여 BALF 수집.
    2. 1.5 mL 튜브에 0.2 m m의 최종 농도를 CMH (10 m m)의 4 µ L로 BALF의 200 µ L를 취급 합니다.
    3. 물 욕조에 37 ° C에서 50 분 BALF를 품 어.
    4. 물 탕에서 튜브를가지고 고 얼음에 그들을 배치.
    5. 동일한 EPR 설정으로 모 세관 튜브와 RT에 실행된 EPR BALF 부하에 사용 단계 1.1.13, 또는 플래시 동결 액체 질소에 2.3 단계에서 설명한 대로.
  3. 77 K에서 혈액과 BALF EPR 측정
    1. 혈액 수집 위의 프로토콜에 따라 (3.1.1 단계. 3.1.4에) 및 BALF (3.2.1 3.2.4 단계).
    2. 치료 혈액 또는 PTFE (1-2에서) 튜브에 BALF 장소 150 µ L. 고무 마 개를 사용 하 여 샘플 및 튜브를 봉인 하기 위해 다른 스 토퍼 추가 이전 PTFE 튜빙의 한쪽 끝을.
    3. 플래시 동결 액체 질소에 샘플입니다.
    4. PTFE 튜빙 dewar 77 K. 실행 냉동 CMH에서 일주일에 혈액 샘플을 처리 하는 손가락을 사용 하 여 냉동된 샘플에 EPR를 실행에 대 한 자세한 내용은 섹션 2.3를 참조.

4. EPR 측정 폐 조직에

  1. 플래시 동결된 폐 조직
    1. 3.2.1 단계에서 BALF 수집 후 가슴 열리고 폐 플러시 차가운 PBS 를 통해 의 10 mL와 함께 혈액을 제거 하는 우 심 실. 플래시 동결 액체 질소에 폐 조직입니다. 냉동된 폐 조직-80 ° C에서 최대 6 개월 사용까지 EPR 측정 저장할 수 있습니다.
    2. 핀셋으로 드라이 아이스에 폐 조직 안정화와 폐 조직의 단일에 지 블레이드를 사용 하 여 여러 개의 작은 조각 (5-15 mg)를 잘라.
    3. 1.5 mL 튜브에 조직 무게, 튜브 규모와 규모, 포장용 다음 조직 조각 추가 놓고 무게를 기록 합니다.
    4. 1.5 mL 튜브에 조직에 KHB DTPA와 CMH (0.2 m m)의 4 µ L 200 µ L 총 볼륨을 달성 하기 위해 포함의 196 µ L를 추가 합니다.
    5. 물 욕조에 37 ° C에서 1 시간에 품 어.
    6. (몇 초간) 3,884 x g에서 microcentrifuge에 아래로 회전.
    7. 얼음에 및 PTFE 튜빙에는 상쾌한의 150 µ L 플라스틱 놓고 섹션 2.3에에서 설명 된 대로 77 K 측정에 대 한 동결 합니다.
      참고:이 방법에 대 한 상해의이 간주 해야 합니다. Bleomycin 유도 폐 상해에 대 한 매우 이질적인 부상, 그에 주어진이 좋습니다 각 마우스에서 폐의 다른 부분에서 여러 가지 조직 조각을 잘라. 또는 조직의 더 큰 조각은 KHB 버퍼 아래 설명 된 대로 1:6 볼륨에 무게 비율로 (mg / µ L) 100 µ M DTPA를 포함 하는 무 균 수 있습니다.
  2. 신선한 폐 조직 자당 버퍼에 보존
    1. Lavaged 폐 단계 3.1.2에서에서 다 혈액을 제거 하는 차가운 PBS 가진 플러시.
    2. 유리 또는 PTFE 유 봉 Dounce 조직 분쇄기를 사용 하 여 1:6 폐/버퍼 (mg / µ L) 비율 0.25 M 자당을 포함 하는 트리 스-EDTA 버퍼에 신선한 폐 조직 균질
    3. 100 µ M DTPA를 포함 KHB의 450 µ L를 폐 homogenate의 50 µ L를 추가 합니다.
    4. 1.5 mL 튜브 (에 100 µ L의 총 볼륨), KHB에 폐 homogenate의 98 µ L, 0.2 m m의 최종 농도를 10 m m 재고의 CMH의 2 µ L를 추가 합니다.
    5. 20 분 물 욕조에 37 ° C를 품 어.
    6. 얼음에 샘플을 놓고 모 세관 튜브에 그들을 로드 합니다. RT (2.1.13 단계에서 사용 되는 설정)에서 EPR를 실행 합니다.
    7. 특정 종 및 다른 억제제를 사용 하 여 소스의 기여를 테스트 하려면 미리 KHB 98 µ L의 최종 볼륨을 달성 하기 위해 조정 억제제 + 폐 homogenate의 88 µ L 처리 합니다. 이 실험에는 억제제 잔디의 10 µ L를 포함 (100 U/mL), deferoxamine의 4 µ L (돌연 사 했을까; 최종 농도 = 800 µ M), 또는 diphenyliodonium 염화의 4 µ L (DIP; 최종 농도 = 100 µ M). 물 욕조에 37 ° C에서 20 분 동안 품 어.
    8. CMH의 2 µ L을 추가 하 고 위에서 설명한 대로 EPR 측정 뒤 37 ° C에서 또 다른 20 분 동안 품 어. CMH KHB 자당 버퍼를 포함 하는 일회성 일치 빈 샘플 포함 됩니다. 또는, 나머지 폐 homogenates (단계 3.1.2) 미래 측정-80 ° C에서의 aliquots를 저장 합니다.
      참고: 필요에 따라 총 볼륨 확장할 수 있습니다.
  3. EPR 측정 스핀 프로브에서 vivo에서 (RT 조직 세포를 사용 하 여)에 주입 하는 쥐에서 폐 조직에
    1. 4.9의 밀리 그램 CPH 필터링 하 고 deoxygenated 50 m m 인산 염 버퍼의 1 mL에 용 해 하 여 CPH 재고 솔루션을 준비 합니다.
    2. 핀치를 발 끝까지 응답 될 때까지 20-30 초에 대 한 흡입된 isoflurane (1.5-4%)와 쥐를 anesthetize. CPH 스핀 프로브의 25 g 마우스 몸 무게에 대 한 100 µ L retroorbital 경로 통해 마우스 주입 (마지막 복용량 = 20 mg/kg), 프로브 retroorbital 주입 직후 1 헤에 대 한 순환, 추가할 0.5% proparacaine HCl 한 방울 눈에 띄지를 허용 nt 안구 통증 고 건조입니다. 1 시간에 대 한 마우스를 모니터 하 고 수확 하는 조직으로 진행.
    3. 위에서 설명한 대로 폐 조직 수확 및 플래시 동결 폐.
    4. 드라이 아이스에 냉동된 조직의 20-30 mg을 잘라내어 정확한 무게를 기록.
    5. 부드럽게 닦아 청소 어떤 표면에 물 흡수 하는 물티슈와 티슈.
    6. (액세서리 조직 샘플에 대 한 EPR 측정 가능) 조직 세포의 창 내에서 조직을 놓고 총 회전을 결정 하는 EPR를 실행 합니다. 데이터는 조직의 mg 당 총 스핀으로 표현할 수 있습니다.

5. 데이터 분석

  1. 벤치 탑 EMXnano EPR 계의 제 논 소프트웨어에 통합 하는 SpinFit 모듈을 사용 하 여 EPR 스펙트럼을 시뮬레이션 합니다. Nitroxide 농도 SpinCount 모듈에 의해 결정 합니다. 또는 4-hydroxy-템포 나 TEMPOL 같은 안정적인 nitroxide의 교정 곡선을 만들 수 있습니다, 고 농도의 샘플 및 표준 신호 강도 비교 하 여 얻을 수 있습니다.
  2. 77 K에서 수집 된 데이터에 대 한 이중 통합 뒤에 SpinCount를 사용 합니다.

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결과

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초과 검출 CMH을 사용 하 여 X를 사용 하 여 확인 했다 / XO superoxide catalase 했다 영향을 주지 않습니다 (그림 1A) nitroxide (.CM) 신호 잔디에 의해 저해 완벽 하 게 했다을 설명 하기 위해 시스템 생성. 총, extracellular superoxide 다음 잔디 전처리 + 세포 투과성 CMH 스핀 프로브 RAW 264.7 세포 배양 세포에 의해 평가 되었습니다. Nitroxide 농도 세포 현 탁 액 및 버퍼를 두 가지 샘플 유형에서 값 투과 특성 및 스핀 프로브 (그림 1B)의 빠른 평형 유사 했다 시연에서 측정 했다. Nitroxide 급진적인 신호 제어 셀에 비해 PMA RAW 264.7 세포 자극된에 증가. 이 신호는 크게 셀 셀 스며들 지 않는 잔디 (그...

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토론

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생물 학적 설정에서 자유 래 디 칼 생산의 평가 이해 redox 규제 건강과 질병, 신호에 중요 하지만 이러한 종류의 측정은 매우 자유 래 디 칼의 짧은 반감기 때문에 도전적이 고 기술 일반적으로 사용 되는 방법으로 제한입니다. 그것은 자유 래 디 칼을 탐지 하기 위한 유일한 명백한 방법으로 EPR는 산화 환 원 생물학, 귀중 한 하 고 강력한 도구입니다. 이 프로젝트에서 실험을 디자인 하 고 선생님 스핀을 사용 하 여 체 외에 다른 세포질 구획 및 다른 조직 구획에 프로브를 감지 하는 샘플을 준비 하는 실용적인 EPR 방법을 설명 vivo에서. 우리는 또한 생물 학적 샘플을 처리 하 고 효율성을 개선 하기 위해 샘플을 저장 하는 실용적인 방법을 제공 합니다.

스핀 프로브 선생님과 효율적으로 반응 하 고 안정적인 nitroxide 급진적인 EPR로 검출 될 수 있는 생산. 스핀 프로브 (주기적 hydroxylamine)의 여러 파생 그들을 다른 세...

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공개 사항

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저자는 공개 없다.

감사의 글

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이 작품은 의학 학장의 전략적 연구 인프라 상, R01 HL086680-09 1R35HL139726-01, E.N.G. 및 UCD CFReT 화목 상 (그)의 콜로라도 대학 학교에 의해 지원 되었다. 저자는 박사 산드라 이튼 박사가 레 스 이튼 (덴버 대학교), 박사 제럴드 로젠 박사 조셉 P. Kao (메릴랜드 대학), 그리고 박사 Sujatha Venkataraman (대학의 콜로라도 덴버) 유용한 토론, 그리고 조 앤 Maltzahn, 애슐리 감사 합니다. Trumpie와 기술 지원에 대 한 아이비 맥 더 못 (덴버 콜로라도의 대학).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
DMEMLifeTech10566-016세포 배양 매체
디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA)Sigma AldrichD6518-5G
염화나트륨 (NaCl) 피셔 사이언티픽   BP358-21250 mM 인산 식염수 완충액을 준비하는 데 사용됩니다  Sigma aldrish에 따르면   
인산칼륨 이염기성 (HK2PO4 )Fisher Scientific   BP363-50050 mM 인산염 식염수 완충액을 준비하는 데 사용됩니다  Sigma aldrish에 따르면   
인산칼륨 일염기성 (KH2PO4 )Sigma AldrichP-5379는 50 mM 인산염 식염수 완충액을 준비하는 데 사용됩니다.  
크렙스-헨셀레이트 완충액 (KHB) (Alfa Aesar, Hill)J67820
소 적혈구 과산화물 디스뮤타아제(SOD)시그마 알드리치  S7571-30KU
Phorbol 12-미리스테이트 13-아세테이트 (PMA) 시그마 알드리치P1585-1MGDMSO
안티마이신 A (AA)시그마 알드리치A8674-25MG에탄올에 용해 유리 바이알에 보관 (사용 된 MW는 4 개 로트의 평균 분자량)
1- 하이드 록시 -3- 메 톡시 카르 보닐 -2,2,5,5- 테트라 메틸 피롤 리딘. HCl (CMH)엔조 생명 과학ALX-430-117-M050
1-하이드록시-3-카르복시-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘. 엔조 생명 과학ALX-430-078-M250
1-하이드록시-4-[2-트리페닐포스포니오)-아세타미도]-2,2,6,6-테트라메틸피페리딘, 1-하이드록시-2,2,6,6-테트라메틸-4-[2-(트리페닐포스포니오)아세타미도]피페리디늄 디클로라이드 (미토-TEMPO-H)엔조 생명 과학ALX-430-171-M005
1-하이드록시-2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일-트리메틸암모늄 클로라이드. HCl (CAT1H)Enzo Life SciencesALX-430-131-M250
헤파린 Sagent 제약NDC 25021-400-10
디페닐리오도늄 클로라이드 Sigma Aldrich43088
Deferoxamin 메실레이트 소금Sigma AldrichD9533-1G
CritosealLeica39215003
브랜드 일회용 BLAUBRAND  마이크로피펫, intraMarkSigma Aldrich708733Capillaries
PTFE 프랙셔널 플루오로폴리머 튜빙
3/16" 외경 x 1/8 " ID		NORELL1598774A테프론 튜빙 
NMR 샘플 튜브용 실리콘 고무 마개  OD가 4mm-5mm (3.2mm에서 4.2mm ID)인 얇은 벽 튜브용 TS-4-5-SRNORELL94987
EMXnano 벤치탑 EPR 분광계 Bruker BioSpin GmbHE7004002
EMX 나노 티슈 셀Bruker BioSpin GmbHE7004542
는 은 에 용해

참고문헌

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