방법 논문

Alpacas (라마 pacos) 단백질 항 원 및 항 원 특정 단일 도메인 항 체의 생산의 면역

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DOI:

10.3791/58471

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2019년 1월 26일

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1Department of Molecular and Cellular Biochemistry, University of Kentucky, 2Division of Laboratory Animal Resources, University of Kentucky, 3River Hill Ranch

이 논문에서

요약

Alpacas에서 단일 도메인 항 체의 생산을 위한 방법, 예방 접종, 혈액, B-세포 절연 및 선택을 포함 한 설명 이다.

초록

이 원고에 알파 카의 예방접종 및 항 원 특정 단일 도메인 항 체를 생산 하는 분자 생물학 방법의 사용에 대 한 메서드는 설명 하 고 시연. Camelids, 라마, alpacas 등 되고있다 생물 의학 연구를 위한 귀중 한 자원 때문에 그들은 새로운 유형의 단일 도메인 항 체를 생산 하는 데 사용할 수 있는 무거운 체인 전용 항 체 생산. 면역 체계는 매우 유연 하기 때문에 단일 도메인 항 체 특이성의 매우 높은 학위를 가진 많은 다른 단백질 항 원, 항 원, 심지어 다른 conformations를 만들 수 있습니다. 이러한 기능을, 생물 의학 연구를 위한 귀중 한 도구 단일 도메인 항 체를 확인합니다. Alpacas에서 단일 도메인 항 체의 생산에 대 한 방법을 보고 됩니다. 예방 접종, 혈액 수집, 및 B-세포 격리 프로토콜 설명 되어 있습니다. B 세포 면역된 라이브러리, 패닝 통해 특정 단일 도메인 항 체의 선택에 사용 되는의 건설에 사용 됩니다. 풀-다운, 패닝 통해 얻은 putative 특정 단일 도메인 항 체 확인 ELISA, 또는 젤 교대 분석 실험. 결과 단일 도메인 항 체 직접 또는 설계 시 약의 일부로 사용할 수 있습니다. 단일 도메인 항 체와 단일 도메인 항 체 기반 regents의 사용 구조, 생화학, 세포, vivo에서, 및 치료 응용 프로그램을 포함합니다. 간결한 식 시스템에 있는 재조합 형 단백질 순화, 직접 사용 또는 특정 마커 또는 세포 연구 또는 기자로 사용할 수 있는 태그를 포함 하도록 설계 될 수 있다 단일 도메인 항 체 대량에서 생산 될 수 있습니다. 진단 프로그램입니다.

서론

Alpacas, 그리고 camelid 가족의 다른 일원 생물 의학 연구1,2,3에 대 한 항 체를 생성 하기 위한 인기 있는 소스 되 고 있습니다. 그들은 모두 정상적인 항 체로 높은 특이성 및 높은 선호도 유지 하면서 훨씬 더 작은 단일 도메인 항 체의 생산을 허용 하는 무거운 체인 유일한 항 체 생산에 Camelids 독특한 면역 체계가 있다. 따라서, camelid 항 체 다양 한 용도로 유용 하 게 다재 다능 한 시 약을 제공합니다. 알파 카 면역 단백질 항 원의 다양 한 단일 도메인 항 체를 생성 하는 방법 여기 설명 되어 있습니다. 이 항 체만 대상 단백질 (항 원)과 혈액 그리기4의 작은 주사를 통해 예방접종을 필요로 하는 비교적 간단한 과정을 통해 camelids에 생산 수 있습니다. 그 후, 도서관 건설, M13 살 균 소 전시5 , 재조합 형 항 원6 대 팬 분리 하 고 원하는 특성을 가진 단일 도메인 항 체를 생산 사용 됩니다. 프로세스 페이지 디스플레이 기술의 힘을 이용 하기 때문에, 5 개 이상의 항 원 동물 당 동시에 이용 될 수 있다, 사용 하 고 비용을 관련 된 동물의 수를 줄입니다.

전형적인 포유류 항 체 또는 면역 글로불린 체인 (2 무거운 사슬과 2 경 쇄), 이황화 결합을 통해 서로 연결 되어 있는 두 가지 유형의 구성 된 큰 분자 이다. 이러한 항 체는 비교적 큰 전시 ~ 140-190의 분자 무게 인간, 쥐, 염소, 토끼에서 더 풍부한 IgG 종 kDa. 그리고 때문에 그들의 여러 소 단위 구조, 높은 분자량, 이황화 결합, 면역 글로불린 대량, 높은 그들의 비용을 만들기에 오히려 도전 수 있습니다. 1990 년대에 camelids, 낙 타, 라마, alpacas를 포함 하 게, 전형적인 포유류 유형 면역 글로불린, 구조, 보유만 무거운 체인7에서 간단 하 게 면역 글로불린의 소설 형태 뿐만 아니라 발견 했다. 이러한 독특한 camelid 항 체 특히 높은 선호도와 외국 물질 바인딩할 같은 능력을 보유 하지만 이루어진 하나의 단백질 체인8. 또한, camelid 항 체도 작은 단위 VHH 조각, 단일 도메인 항 체9라고도 하 실험적으로 잘릴 수 있습니다. 그들의 작은 크기 때문에 단일 도메인 항 체 생물 의학 연구 응용 프로그램의 넓은 범위에 대 한 유용 하며 다양 한 학술 및 상업 소스1,10에서 사용할 수 있습니다. 예외 때문에 단일 도메인 항 체는 서쪽 오 점에 사용 되는 변성 조건에서 일반적으로 잃 었 나 란 종속 epitopes에 대 한 감독 더 자주 부 럽 것 처럼 보인다.

그들은 하나의 polypeptide 사슬 구성 되어, 이후 특정 단일 도메인 항 체 선정 고 쉽게 세균에 재조합 단백질 대량에서 생산 수 있습니다. 단일 도메인 항 체 특정 마커 또는 질병11진단에 대 한 "기자 그룹"으로 사용할 수 있는 태그를 포함 하도록 유전자 설계 수 있다 또한. 사용의 그들의 유연성과 함께 조작의이 용이성이 연구자와 다른 대학에 대 한 중요 한 자원을 단일 도메인 항 체 게.

건강의 국가 학회의 부분 코어 지원, 기존의 방법 alpacas3,4에서 단일 도메인 항 체 생산에 적응 되었습니다. Alpacas는 큰 camelid 가족 구성원 뿐만 아니라, 내게 필요한 옵션을 기준으로 처리의 두 용이성에 상당한 이점이 있다. Alpacas는 널리 섬유 및 고기 고 따라서에서 얻어질 수 있다 지역 로컬 알파 카 농부, 누가 자신의 웹사이트를 통해 또는 상태 종 축 협회를 통해 확인 될 수 있다. Alpacas의 두 유형이 사용할 수 있습니다, Huacaya 및 수리. Huacaya는 더 일반적이 고이 프로토콜에 대 한 사용 했다 하지만 프로토콜은 일반적으로 어느 품종에 적용 하 고 또한 더 널리 다른 camelids에 적용.

프로토콜

모든 절차는 alpacas는 켄터키의 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인 (2017-2627 및 2018-2925) 프로토콜에 따라 수행 했다.

1. 항 원 특정 알파 카 항 체의 생성

  1. 알파 카 처리 및 일반 고려 사항
    1. 적절 한 기관 및 규제 승인을 얻을.
    2. 성인 alpacas을 얻기는 시체와 함께 10 세 미만 조건 적어도 3.0 (규모 1-5)12의 점수. 그들은 무리 동물 이기 때문에, 최소한 함께 두 하지만 가급적 3에 해당 하는 동물의 집.
      참고: 남성 때문에, 일반적으로, 그들은 보다 더 기질이 되며 함께 작동 하도록 쉽게 권장 됩니다.
    3. 다이어트, 주택, 예방 접종 및 기생충 제어 프로그램13의 검토를 포함 하 여 동물 시험을 통해 동물의 건강 상태를 확인 하십시오. 동물 예방 접종 전문 수의 권장 사항에 따라 로컬 지역에 적합 한 최신 인지 확인 합니다. 기원과 특정 지역 조건13의 무리의 역사의 검토에 따라 수 의사와 상담에서 외의-및 endoparasite 제어 프로그램을 개발 합니다.
    4. 적어도 1 주일에 대 한 순응, 훈련 및 구속에 노출 고삐 등.
    5. 사전 예방 접종 제어로 사용 하기 위해 혈 청을 얻기 위해 4 mL 혈액 샘플을 수집 (단계 1.4 참조). 세라를 동결 하 고 0.5 mL aliquots에-20 ° C에서 저장 합니다.
      참고: 이 시점에서 동물의 초기 상태를 모니터링 하는 완벽 한 혈액 세포 (CBC) 분석에 대 한 추가 혈액을 취할 수 있습니다.
  2. 항 원 준비
    1. 순화 된 단백질 항 원에 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 또는 HEPES 버퍼링 염 분 (HBS)을 준비 하 고 ≥1 mg/mL에 집중. 단백질의 약 3 밀리 그램 예방접종, 패닝, 그리고 클론의 확인을 포함 하 여 완전 한 프로토콜에 대 한 필요 합니다.
      참고: Camelid 항 체는 높은 특이성 및 단백질 항 원에 대 한 선택도 표시 하지만 일반적으로 잘 적합 구조화 단백질 또는 펩 티 드 항 일반적으로 구조화 되지 않은.
    2. 항 원 순도, 순도 설정 > 원하는 90%. SDS 페이지 등 분석 메서드를 사용 합니다.
      주의: 다른 단백질 중요 한 오염 발생할 수 있습니다 문제는 선택 하는 동안 단일 도메인 항 체 보다는 대상 단백질 오염 물질을 고립 하 게 될 수 있다.
    3. 항 원의 100 µ g의 총을 포함 하는 항 원의 언된 aliquots를 준비 합니다. 2 mg/mL 준비의 50 µ L에 이상적입니다. 1 mg/mL의 100 µ L은 예방 접종에 대 한 적합 한 가장 희석 단백질 솔루션 이다. 또는, 항 동결/동결 해제를 받을 수 없는 경우 솔루션 긴 기간에 안정 되어 있는 것으로 알려져 있다, 그것은 저장할 수 있습니다 4 ° c.에
      참고: 항 동결/해 동 주기를 받을 수 있도록 항 원의 20 µ L 약 수에는 얇은 적절 해야 테스트 PCR 튜브 및 액체 질소에서 냉동 벽으로. 튜브를 녹여, 고속 원심 분리를 수행 하 고 UV/VIS 흡수 냉동 전후를 비교 하 여 또는 SDS 페이지 젤을 실행 하 여 양적 복구를 확인 합니다. 경우, 항 생물 학적 활동의 보존에 대 한 테스트도 해야 합니다. 냉동 해 동 주기 성공 하면 나머지 항은 스냅 100 µ L aliquots에서 냉동 고-80 ° c.에 저장 냉동/해 동 주기 문제가 있다면 프로토콜 최대 20%의 추가 함께 반복 될 수 있다 글리세롤.
  3. 예방 접종
    1. 최대 5 개의 항 원, 200 µ g을 각각 혼합 1000 300 µ L 사이 마지막 양의 보조 제와 함께. 보조 희석제로 물을 사용 하 여 최종 볼륨의 50 %를 구성 한다.
      참고: 버퍼가 필요한 경우 사용 HEPES, MOPS, 또는 글리신. 5와 6 사이 pH 자주 엄격 하 게 중립 보다 더 유리한 것을 입증 했다. 그들은 응고를 자극 수 있기 때문에 시트르산, 인산 염 등 다 원자가 이온을 하지 마십시오.
    2. 어깨에서 어깨 노출 활 림프절에 인접 한 지역에 그것의 목의 기초에 따라 초승달 패턴에서 전기 면도기와 알파 카의 머리를 잘라.
    3. 알파 카 목을 잡고 천천히 22 G 바늘을 사용 하 여 활 림프절 근처 목 기지 따라 피하 항 원 주사. 5 주사 (또는 그) ~ 200 µ L의 수행 ~ 5 cm 떨어져.
      참고: 동물 주사 하는 동안 두 번째 직원에 의해 제 지 되어야 한다. 이후 그들은, 하는 경향이 그냥 뒤에서 하지만 옆으로 주입 및 alpacas 출혈 주의 대 한 호출 합니다. 절차 동안 그룹에서 서로 가까운 동물 데 최적입니다. 주어는 무리 동물, 그들은 그룹에서 조용한 고 덜 강력한 구속 절차 동안 필요 하다.
    4. 알레르기의 징후에 대 한 ~ 20 분 포스트 주입을 위해 동물을 모니터링 (단계 1.6 참조). 권장 되는 보조 제를 사용 하 여 때 예상 하지는 매주 주사 사이트에서 지역화 된 염증에 대 한 모니터. 주사의 사이트에서 혈액 누출 과도 한 인지 확인 합니다.
    5. 5 후속 증폭 주사 주간 혼합물에서 각 항의 100 µ g를 사용 하 여 수행 합니다. 사출 사이트에 머리를 자르기는 시즌에 따라 매주 필요할 수 있습니다. 가 겨울에 동물의 머리는 빠르게 성장할 수 있다.
  4. 혈액을 그리기
    1. 클립 컬렉션 사이트 알코올 면봉으로 소독 하 고.
    2. 목 직 립 개최와 직선 동물 부드럽게 제 지.
      참고: 동물은 비디오 에서처럼 수동으로 제 지 될 수 있습니다. 가능한 경우, 출혈 하는 동안은 alpacas을 억제 하는 알파 카 슈트의 사용 하 고 주사 처리를 쉽게 할 수 있습니다. 알파 카 슈트를 사용 하려면 haltered alpacas는 낙하산에 이르렀고 목 바, 빠른 출시와 함께 스트랩와 절제 된. 알파 카 슈트의 버전 상업용 공급 업체에서 사용할 수 있습니다.
    3. 복 부 과정을 그냥 중간 압력을 적용 하 여 정 맥을 가리고 랜드마크로는 척추의 가로 프로세스의 복 부 투영을 사용 하 여.
      참고: 성인 알파에 없는 독특한 jugular 밭 고 랑이 있다. 경 정 맥은 척추는 가로 프로세스의 복 부 계획에 의해 보호 됩니다. (예를 들어, 1 ㎝ 두께 "파이팅 플레이트" 남성에 목의 중간 1/3 이상)이 두꺼운 피부와 목 근육 어려운 시각화 또는 자체는 경 정 맥을 만져. 그 후, 척추 랜드마크의 사용은 jugular 위치에 대 한 가장 유용한 지표 이다.
    4. 약간 중간 45 ° 각도로 바늘을 삽입 (~ 손가락 폭) 목의 중심 방향으로 투영. 혈액 흐름까지 바늘을 조작 합니다.
      참고: 경 정 맥 및 경 동맥 서로 가까이 있습니다. 정 맥 혈액 꽤 색상에 붉은 수 있지만 여전히 동맥 혈 보다 더. 컬렉션에 따라 압력은 0.5-1에 대 한 사이트에 적용 되어야 합니다 분 (또는 더 긴 경우는 경 동맥에 액세스) hemostasis 안심 될 때까지.
    5. 분석 목적을 위한 4-10 mL의 혈액을 그립니다. 적절 한 크기의 주사기 또는 혈액 컬렉션 튜브 1.5 인치, 일반적으로에 20 G 바늘을 사용 합니다. 세포를 정화 하는 때 전체 혈액을 수집 하기 위해 라벤더 K2EDTA 튜브를 사용 합니다. 혈 청 생산을 위한 혈액 수집 하는 때 금 최고 혈 청 분리 관 (BD)을 활용 합니다.
    6. 50-100 mL의 생산 목적에 대 한 혈액을 그립니다. 19-20 G 날개 "나비" 주입 세트로 설정 추가 12 인치 주입 확장을 사용 합니다.
      참고: 확장 설정된 구성 컬렉션 바늘 안정화에 초점을 venipuncturist 수 있도록 여러 혈액 컬렉션 튜브를 채우기 위해 보조 수 있습니다. 주입 세트의 추가 (3-5 분 절차) 동물의 잠재적인 움직임을 수용 하 고 연산자에 대 한 편안한 작업 거리를 제공 합니다.
  5. 면역 감시
    1. 3회 와 5회 주사 후 3 ~ 4 일 테스트 세라를 각 동물에서 작은 테스트 화상 물림 재단을 수행 합니다. 동결 하 고 0.5 mL aliquots에는 세라를 저장 합니다. 위에서 설명한 대로 동물의 상태를 모니터링 하는 동시에 추가 혈액 샘플을 얻을.
    2. ELISA 미리 면역, 3 주 및 5 주 시간 지점에서 테스트 물림에서 얻은 혈 청을 사용 하 여 항 원 특정 항 체의 존재를 확인 합니다. 그것은 항 체 titer 여전히 증가 하는 동안 마지막 화상 물림 재단을 최고의입니다.
    3. 항 원 선호도 접시 표면 처리 96 잘 접시를 사용 하 여 생성 합니다. 100 m m 탄산 나트륨 버퍼, pH 9.0에서에서 항 원의 0.1 µ g을 희석. 각 잘을 솔루션의 100 µ L을 추가 하 고 하룻밤 4 ° c.에 품 어 각 항의 10 희석 복제본에서 테스트 합니다. 빈 컨트롤 잘만 탄산 버퍼 코팅 준비가 되어 있습니다.
    4. 야간 보육, 후 반전 우물의 내용을 제거 하 여 PBS, 0.1%의 0.1 mL로 세 번 세척 접시 트윈 20 (PBS-T).
    5. PBS-T에서 BSA (5 mg/mL)의 0.1 mL를 추가 하 고 실 온에서 1 h에 대 한 접시를 배양 하 여 우물을 차단.
    6. 세척 솔루션 우물에 pipetting 다음 접시의 반전에 의해 세척 솔루션을 제거 하 여 세 번 PBS-T와 접시를 씻어.
    7. 1/100, 및 최대 시작 희석을 사용 하 여 PBS T 버퍼에 미리 면역과 면역 세라의 각 두 배 직렬 희석 0.3 mL의 준비 1/102, 400.
    8. 우물에 각 희석의 100 µ L을 추가 하 고 실 온에서 2 h에 대 한 알을 품을 수 있도록.
    9. 각 우물에서 혈 청을 제거 하 고 0.2 mL PBS-T의 세 번 씻어.
    10. 품 어 각 1 시간에 대 한 1:20,000의 희석에 HRP 활용 된 염소 항 라마 IgG 항 체의 0.1 mL와 잘.
      참고: 측정 하는 면역 반응 모두 기존의 무거운 체인 유일한 항 체, 순환3,14에서 대략 동등한 비율에 있는 뿐만 아니라 포함 됩니다.
    11. 항 체 솔루션을 제거 하 고 씻어 각각 0.2 mL PBS-T의 세 번 잘.
    12. 잘 발 과산화 효소 기판의 100 µ L을 추가 하 고 두 높은 농도 포인트의 강도 될 포화, 일반적으로 5-10 분을 소요 때까지 실 온에서 품 어.
    13. 각 잘 반응을 중지를 0.1 m M 황산의 100 µ L를 추가 합니다.
    14. 각 450에서의 흡 광도 측정 nm 플레이트 리더를 사용 하 여.
    15. 함수 농도 흡수도 플롯 합니다.
  6. 알파 카 모니터링 하 고 잠재적인 합병증
    1. 확인 절차를 통해 모니터링 하는 적절 한 알파 카.
      참고: 절차 없는 상당한 부작용을 일으키는 것으로 예상 된다. 동물 복지 및 건강 모니터링 해야 합니다 수 매일 축산 및 연구 인력에 의해 먹이 물을 동안. Unalleviated 실험적으로 유도, 또는 자발적인 자연 사망률에 대 한 어떤 동물 든 지 해야 참조 될 평가 대 한 수의 서비스에서 적절 하 고, 자비 롭 안락사까지 제공 하는 여야와 필요한 경우.
      잠재적인 불리 한 결과 정와 관련 된 출혈, 멍이, 및 혈 종 있습니다. 동물 20 분 게시물 혈액 무승부 출혈의 징후에 대 한 보고 모니터링 해야 합니다. 사이트에 추가 압력을 사용 한다. 출혈이 멈추지 않으면, 수 의사 연락을 한다.
      다른 잠재적인 불리 한 결과 출혈 하 고 주사와 관련 된 육아 종 형성 및 염증 포함 됩니다. 육아 종 형성 되지 및 켄터키의 대학에서 관찰 되지 않는. 사출 사이트 염증 (빨갛게 또는 붓기) 발생할 수 있는 고 수 의사의 관심을 끌게 한다. 생산 출혈, 혈액의 중요 한 볼륨을 나타냅니다 그리고 동물 들은 안정적이 고 적극적인 혈액 컬렉션 후 보장을 모니터링 해야 합니다.
      알레르기 및 화성 응답 두 개의 가장 가능성이 심각한 불리 한 결과, 하지만 매우 드물게 관찰 된다. 그것은 발생 했다, 알레르기 항 원 주사 직후 발생 하 고 직장 온도, 약점, 구 토, 호흡 곤란, 또는 설사의 증가 의해 각 성. 직장 온도 체온에 있는 증가 감지 하 각 주입 후 모니터링할 수 있습니다. 이 인식, 상담에 대 한 즉시 수 의사를 게 알립니다. 또한,는 비상 "충돌 키트" (예를 들어, 피 네 프 린, 코르 티 코 스테로이드, 그리고 항히스타민제) 수 의사와 상담에 불리 한 반응을의 의심 하는 동물 치료를 사용할 수 있어야.

2. 단일 도메인 항 체 도서관 건축을 위한 세포 정화

  1. 혈액의 50 mL (단계 1.4 참조) 마지막 주사 후 3 ~ 5 일을 수집 합니다.
    참고: 혈액의 신속한 처리 및 RNA의 격리 얻을 적당 한 라이브러리 크기15,3, 패닝의 성공을 위해 매우 중요 하다 중요 하다.
  2. PBS의 5 mL와 함께 수집 된 혈액의 15 mL를 희석.
  3. 림프 구 분리 튜브 제조 제안에 따라 밀도 그라데이션 원심 분리에 의해 주변 혈액 림프 톨 (PBLs)을 활용 합니다.
    주의: 제조업체의 지침에 따라 혈액의 25 mL까지 사용할 수 있습니다, 하지만이 시스템을 포화 수 있으며 깨끗 한 림프 구 준비 취득 방지를 나타냅니다.
  4. PBL 4 ° C에 prechilled PBS의 5 mL를 추가 합니다.
  5. 4 ° c.에 800 x g 20 분에 대 한 회전
  6. PBL 4 ° c.에 800 x g 에서 20 분 동안 원심 분리 뒤에 4 ° C에 prechilled PBS의 5 mL을 추가 하 여 두 번 씻어
  7. 제조업체의 지침에 따라 스핀-열 기반 시스템을 사용 하 여 총 RNA 격리. Vertexing 적절 한 버퍼에 biopolymer 분쇄 시스템에 적용 하 여 셀을 균질. 미니 또는 맥시-열 입력 셀에 따라 적절 한 수를 사용 합니다.
  8. CDNA 결합 하 여 RNA의 10 µ g 올리고 (dT)의 0.1 µ g의 혼합 12 18 뇌관 역전사를 사용 하 여 음성 합성.
  9. 살 균 소 도서관 설립된 방법4를 사용 하 여 생성 합니다. 살 균 소 디스플레이 벡터 pMES4 융합 유전자 III 페이지 솔루션의 생산을 위한 filamentous 페이지의 삽입 식으로 뒤에 금지 효소로 복제 해야 합니다.

3. 단일 도메인 항 체 이동

  1. 항 원 선호도 접시 표면 처리 96 잘 접시를 사용 하 여 생성 합니다. 100 m m 탄산 나트륨 버퍼, pH 9.0에서에서 항 원의 0.25 µ g을 희석. 각 잘에이 솔루션의 100 µ L을 추가 하 고 하룻밤 4 ° c.에 품 어 항 원 당 두 웰 스 코트. 빈 컨트롤 잘 탄산 버퍼만 코팅을 준비 합니다.
    참고: 플레이트 생산 고 선택의 여러 라운드를 수행 됩니다 경우 4 ° C에서 최대 1 주일까지 저장 될 수 있습니다. 또한,이 메서드는 다른 방법 사용 biotinylation 또는 전략 라벨의 라벨을 필요 하지 않는 직접 흡수를 활용 합니다.
  2. 접시를 밤새 품 어. 우물의 내용을 제거 하 고 씻어 세 번 0.1 mL PBS-t를 반전합니다
  3. PBS에서 BSA (20 mg/mL)의 0.1 mL를 추가 하 고 실 온에서 2 h에 대 한 접시를 배양 하 여 우물을 차단.
  4. PBS-T 뒤에 세 번 PBS를 가진 접시 세 번 씻어. 항 수 또한 covalently 표시 되며 캡처 시스템, 예를 들어 streptavidin/biotin 시스템에에서 사용.
  5. 전 40 mg/mL의 BSA PBS에서 30 분 동안 실내 온도에 진동 플랫폼에서 100 µ L로 살 균 소 솔루션 (100 µ L)를 취급 합니다.
  6. 항 원에 살 균 소 솔루션 웰 스 코팅 및 실 온에서 2 h에 대 한 부드러운 교 반으로 품 어 추가 합니다. 여러 개의 우물을 사용 하 여 각 항 원에 대 한 1011 페이지의 총 수 있도록.
  7. 반전 하 여 언바운드 페이지를 삭제 하 고 5 번 PBS-T 다음 5 번 PBS의 200 µ L로 우물을 씻어.
  8. PBS와 700 rpm에서 진동 플랫폼에 실 온에서 30 분 동안 잠복기에 트립 신 0.25 mg/mL의 0.1 mL를 추가 하 여 바운드 페이지 elute.
  9. 트립 신 활동을 풀기 위해 4 mg/mL 4-benzenesulfonyl 불 소 hydrochloride(AEBSF) 솔루션의 5 µ L을 포함 하는 유리병에 솔루션을 전송 합니다.
  10. OD600 까지 떨고와 37 ° C에서 TG1 파지 디스플레이 유능한 세포 성장 = 0.5.
  11. TG1 셀 3 mL에 eluted 살 균 소의 50 µ L를 추가 합니다.
  12. 37 ° C에서 30 분 동안 흔들어 없이 품 어.
  13. 100 µ g/mL 암 피 실린, 2% 포도 당으로 보충 하는 파운드 미디어의 7 mL를 추가 합니다.
  14. 37 ° c.에서 밤새 흔들어
    참고: 가장 다양 한 단일 도메인 항 체를, 클론 시퀀싱, 원하는 속성에 대 한 테스트 고 패닝의 한 라운드 후 활용. 높은 선호도 단일 도메인 항 체를 얻기 위해 이동 하는 2 라운드를 활용 합니다.
  15. 파운드 한 천 배지에서 하룻밤 성장 100 µ g/mL 암 피 실린, 2% 포도 당으로 보충 후 박테리아를 접시. 여러 직렬 희석 해야 합니다 테스트 2 희석 시작, 1/10000, 1의 100 µ L를 도금/100000 희석.
  16. 37 ° c.에 하룻밤 접시를 품 어
  17. 식민지를 선택 하 고 2XYT 100 µ g/mL 암 피 실린, 2% 포도 당, 잘 당 10 %v / v 글리세롤의 100 µ L를 포함 살 균 96 잘 접시의 우물을 예방.
  18. 동요 하지 않고 37 ° C에서 하룻밤를 품 어.
  19. 다음 날, 60 분 동안 37 ° C에서 170 rpm에 흔들.
  20. PCR 튜브 미디어의 2 µ L을 제거 합니다. 나머지 솔루션 수 수는 접시에 남아 1-2 일 동안 4 ° C에서 저장 또는 냉동 저장 및 나중에 사용-80 ° C에.
  21. 벡터 활용에 대 한 적절 한 뇌관을 사용 하 여 PCR 반응을 수행 합니다. 여러 복제 사이트 측면 긍정적인 클론 사용 뇌관의 PCR 검사는 pMES4, CCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTAC 및 GGTGGTGTGAGGAGACGGTGACCTG. 중 합 효소 사용, 57 ° C 그리고 30 사이클의 어 닐 링 온도 사이클링 조건을 적절 한 활용.
  22. 1% (w/v) agarose 젤을 실행 하 여 PCR 반응 분석. 긍정적인 식민지 ~ 500의 단일 도메인 항 체 유전자 삽입 해야 bp. 긍정적인 클론 샘플의 20-50%는 확인 하십시오.
    참고: 이 메서드는 복제에 대 한 선택 및 분석 대부분 연구 실험실에서 수행할 수 있는 수단을 제공 합니다. 또는 다음-세대 시퀀싱 적용 될 수 있다 하 고 통계 및 비교 분석16을 허용 하는 큰 데이터 집합을 제공 합니다.
  23. 신선한 튜브 100 µ g/mL 암 피 실린과 파운드의 7 mL를 포함 하는 접시에서 긍정적인 클론을 예방.
  24. 37 ° c.에 하룻밤을 위해 동요와 성장
  25. 플라스 미드 DNA를 문화에는 miniprep를 수행 합니다.
  26. 긍정적인 복제품 뇌관 pEX-레 브 (CAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGC)을 시퀀싱 하는 표준을 사용 하 여 시퀀스.
  27. 결과 시퀀스를 단일 도메인 항 체에 전산 분석을 수행 합니다. 아니 정지 codons 또는 프레임 이동 확인 하십시오.
  28. 결과 시퀀스 유사성과 다양성에 대 한 분류. 반복적으로 식별 되는 순서는 가장 선택의 2 라운드 후 특히 높은 친 화력 바인딩 시퀀스를 될 것 이다.
  29. 익스프레스 BL21 파생 식 스트레인의를 사용 하 여 단일 도메인 항 체 E. 코일. 22 ° c.에 하룻밤 성장 IPTG의 추가 통해 식 유도
  30. 고정된 금속 친화성 크로마토그래피 (IMAC)을 사용 하 여 단일 도메인 항 체 정화.
  31. 풀 다운, 기본 젤 전기 이동 법, ELISA 등 직접 상호 작용 분석 결과 사용 하 여 단일 도메인 항 체/항 원 바인딩을 확인 합니다.
  32. 특정 실험에 대 한 원하는 대로 응용 프로그램 관련 단일 도메인 항 체 성능을 확인 합니다.

결과

여기에 제시 된 프로토콜은 다양 한 단백질 항 원에 대 한 단일 도메인 항 체를 생성 하기 위해 이용 되었다. 5 항 알파 카 당 활용 했다. 면역 감시 표시 대부분의 항 원 3 주 (그림 1)에서 시작 하는 강력한 응답을 보였다. 생산 물림 및 도서관 건설 후 약 6 주 제공 동물에 대 한 최고의 균형을 여러 항 원을 주입 있다. 이동 하는 2 라운드 각 항 원에 대 한 수행 되었고 고립 된 식민지 상영 (그림 2). 긍정적인 식민지의 시퀀싱 다른 항 원에 대 한 다양 한 단일 도메인 항 체 시퀀스를 식별합니다. 예를 들면, 3 개의 독특한 클론 참조 항 원 맥 아당 의무적인 단백질 (MBP) (그림 3A)에 격리 했다. 자주 관찰 단일 도메인 항 체에는 중요 한 순서 성과 높은 변수 CDR3 길이 (그림 3) 포함 되어 있습니다. 이러한 기능은 단일 도메인 기준 단일 도메인 항 체/CX3CL1 복잡 한17 (그림 3B)에서 본 항 체/항 원 상호 작용에 특히 중요 하다.

전체 길이 단일 도메인 항 체 시퀀스의 대부분 표현 하 고 1-10 mg/l의 문화 (그림 4A) 정화 수 있습니다. CDR3 길이에 다양성 때문에 서로 다른 단일 도메인 항 체 분자량에 약간의 변화를 보여줍니다. 직접 바인딩 및 응용 프로그램 특정 성능 확인이 중요 합니다. 예를 들어 2 라운드 후 항 원 B에 대 한 선택의, 단일 도메인 항 체 되었다 위원 확인 (그림 2). 여러 개의 동일한 시퀀스 확인 되었다, 그리고 단일 도메인 항 체 생성 하 고 정화 되었다. 다음 항 원 친화성 수 지 다운 직접 풀을 통해 테스트 되었고 강력한 복용량 의존 바인딩 (그림 4B)를 보였다. 중요 한 것은, 단일 도메인 항 체 수 지 제어에 대 한 바인딩을 보였다. 이러한 데이터는 직접 바인딩 상호 작용, 그리고 선호도 캡처 풀 다운 및 ELISA 기반 형식에 적합 한 보여 줍니다.

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그림 1 : 두 가지 항 원 같은 동물에 별개의 항 원에 중요 한 특정 면역 응답을 보여주는 대표적인 면역 모니터링. 많은 항 원 면역, 6 주 후 최대한 응답을 보여주는 대부분 개시 후 3 주 일찍 강력한 응답을 표시 합니다. 6 주 또한 친 화력 성숙 가능 하며 생산 도련 및 B 세포 격리에 대 한 권장된 시간 이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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그림 2 : 긍정적인 클론의 PCR 기반 확인. 뇌관 스팬 pMES4 벡터의 MCS 및 긍정적인 nanobody 복제 생산 하는 amplicon ~ 500의 bp (으로 표시 된 *). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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그림 3 : 알파 카 단일 도메인 항 체 다양성을 강조 하는 항 원 특정 시퀀스. (A) 참조 단일 도메인 항 체 4XT1, 프레임 워크와 complementarity 결정 영역 (Kabat) 아래 강조 MBP 격리 선택 단일 도메인 항 체 시퀀스의 맞춤입니다. (B) 구조 알파 카 단일 도메인 항 체 4XT1의 CX3CL1에 바인딩된 (PDB 4XT1), 특정 항 원 바인딩에서 루프 변수 CDR의 중요 한 역할을 강조. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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그림 4 : 정화 및 단일 도메인 항 체의 유효성 검사. (A) SDS-페이지 아이맥 정화 단일 도메인 항 체의 다양 한 단일 도메인 항 체 비교. 다른 분자 무게는 주로 CDR3 루프의 다양 한 길이 되어야 한다. 단일 도메인 항 체 순화 된 단백질의 불 쌍 한 수확량을 보여주는의 소수 식의 다른 레벨도 관찰 된다. (B) 항 원 선호도 풀 다운 메뉴를 사용 하 여 직접 바인딩의 확인. 강력한 복용량 의존 단일 도메인 항 체 바인딩은 항 원 결합 수 지만 수 지 제어 하지 관찰 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

토론

앞에서 언급 했 듯이, 높은 선호도 안정성, 손쉬운 식와 결합 하 여 단일 도메인 항 체의 특이성 있도록 응용 프로그램에 대 한 이상적인 시 약, 생물 의학 연구에 중요 한 생 화 확 적인 시 약, 진단 도구로 또는 치료제18. 상용 응용을 위해 고려해 야 하는 몇 가지 문제 지적에 관련된 속성이 있다. 또한, 단일 도메인 항 체 특정 마커 또는 세포질 분석 실험 또는 진단에 기자로 사용할 수 있는 태그를 포함 하도록 설계 될 수 있다. 이러한 사용의 핵심 관심의 항 원에 대하여 특정 단일 도메인 항 체를 생산 하는 능력 이다. 메서드 설명 여기 alpacas를 사용 하 여 단일 도메인 항 체를 생산 하는 다양 한 단백질 항 원에 대 한 강력한 면역 반응을 생산 합니다. 동물 처리 및 규정 준수에 대 한 고려 사항은 설명 합니다. 이 프로세스의이 부분에서 성공 위한 핵심입니다.

예방 접종, 필요 하지 않지만 대신 선택 및 선호도19,20의 반복 최적화에 대 한 다른 시스템과 semisynthetic 라이브러리를 사용 하는 단일 도메인 항 체 생산을 위한 다른 전략 . 그러나, 면역된 동물에서 파생 된 라이브러리를 사용 하 여 장점은 안정적으로 높은 농축 하 고, 다양 한, 그리고 높은 선호도 단일 도메인 항 체를 분리 하는 기능입니다. 또한, 뿐만 아니라 중요 한 순서 변이 관찰 된다, 하지만 특정 단일 도메인 항 체 분리의 상당한 대다수 CDR3에 특히 독특한 삽입 및 삭제을 했다.

추가, 단일 도메인 항 체만 항 원, 그리고이 과정 후 작은 주사를 필요로 하는 간단한 과정을 통해 생성 될 수 있다, 동물 무리 반환 될 수 있습니다. 메모의, 동물 섬유 생산을 위해 자유롭게 사용 될 수 있습니다 하지만 단일 도메인 항 체 생산을 위한 테스트 항 및 비 FDA 승인 된 보조의 사용으로 인해 고기 (인간 먹이 사슬)으로 사용에서 제외 해야 합니다. 프로시저가 완료 되 면 동물 최종 수의 시험을 주어진 1 주 동안 모니터링 해야 고 수 수 중 그들의 가정 농장에 반환 또는 단일 도메인 항 체 생산의 또 다른 라운드 전에 6 개월 동안 휴식.

공개 사항

박사 Whiteheart와 허 켄터키의 대학에는 단일 도메인에 대 한 서비스 요금으로 알파 카에 항 체를 생산 하는 분자 의학 센터에서 핵심 운영.

감사의 글

이 작품은 건강의 국가 학회 (P30GM103486)에 의해 지원 되었다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
GERBU FAMA adjuvantBiotechnik, 하이델베르크, 독일 3003,6001
혈청 채취 튜브Becton Dickinson 367983
채혈 튜브Becton Dickinson366643
Vacutainer 혈액 채취 세트Becton Dickinson368652
Maxisorp 면역 플레이트Nunc439454
BSASigma-AldrichA7906
HRP-conjugated goat anti-llama IgG 항체 Bethyl LabsA160-100P
TMB 시약 발색 과산화효소 기질 KPL50-76-03
플레이트 리더SpectramaxM5모든 UV/VIS 가능 리더는 허용됩니다.
Uni-SepMAXI+ lyphocyte 분리 튜브는 Uni-SepMAXI+ lyphocyte 분리 튜브NovamedU-17
RNeasy Mini KitQiagen74104
QIAshredder columnQiagen79654
Superscript IV reverse transcriptase   Invitrogen18064014
AEBSF 솔루션BiosynthA-5440
TG1 파지 디스플레이 유능 세포Lucigen60502
입니다.

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