대장균 에서 바이로이드 파생 시스템을 사용 하 여 원형 발판에 재조합 RNAs의 대규모 생산

요약

여기, 선물이 공동 표현 공상 RNA 바이로이드 비 계 및 식물에 대 한 관심의 RNA를 포함 하 여 많은 양의 대장균 에서 재조합 RNA 생성 하는 프로토콜 tRNA 리가. 주요 제품은 동질성을 정화를 용이 하 게 원형 분자 이다.

초록

RNA 생물학과 정교한 바이오 응용 프로그램에서 RNA 분자의 사용에 대 한 관심 증가, 재조합 RNAs의 다량을 생성 하는 방법을 제한 됩니다. 우리가 많은 양의 바이로이드 비 계 및 식물에 대 한 관심의 RNA를 포함 하는 공상 분자의 공동 식에 따라 대장균 에서 재조합 RNA 생성 하는 프로토콜을 설명 하는 여기, tRNA 리가. Viroids는 상대적으로 작은, 비 코딩, 높은 베이스 결합 원형 RNAs 더 높은 식물에 전염성이 있다. 호스트 공장 tRNA 리가 중재 바이로이드 복제 동안 RNA circularization Avsunviroidae, 가지 잠재 바이로이드 (ELVd), 같은 가족에 속하는 viroids에 의해 보충 하는 효소 이다. 비록 ELVd 대장균에 복제 하지 않습니다, ELVd 전조 대장균 RNA 중 합 효소에 의해 복사할 효율적 이며 임베디드 귀상어 ribozymes 세균성 세포에 의해 처리 결과 단위체에 의해 circularized는 공동 표현된 tRNA 리가 놀라운 농도 도달입니다. ELVd 비 계에의 한 RNA의 삽입 당 세균성 문화 일반 실험실 조건에서의 재조합 RNA의 밀리 그램 수만의 생산 수 있습니다. RNA 제품의 주요 일부분 이다 원형, 가상 동질성을 재조합 RNA의 정화를 용이 하 게 하는 기능. 이 프로토콜에는 보완 DNA (cDNA)에 해당 하는 관심의 RNA는 사용 되는, 공동 가지 tRNA 리가 표현 하는 플라스 미드 따라 대장균을 변환 하는 식 플라스 미드에 ELVd cDNA의 특정 위치에 삽입 됩니다. 강력한 제정 발기인의 통제 아래 두 분자의 공동 식 대량의 재조합 RNA의 생산 리드. 재조합 RNA 세균 세포에서 추출 하 고 세균성 RNAs의 순환 활용의 대부분에서 분리 수 있습니다.

서론

DNA와 단백질, 대조적으로 많은 양의 RNA의 쉽게, 효율적이 고 비용 효율적인 생산을 위한 프로토콜 풍부 하지 않습니다. 그러나, 연구 및 산업 수요 또는 그들의 독특한 생물 속성¹, 조사에 사용할 이러한 생체의 금액을 증가 정교한 매우 구체적인 aptamers로 그들의 사용을 포함 한 바이오 응용 프로그램 ², 치료제³또는 선택적인 농약⁴. 생체 외에서 전사 및 화학 합성 일반적으로 사용 됩니다 연구에서 RNA를 생산. 그러나, 이러한 방법은 제품의 대용량이 필요한 경우 중요 한 한계를 수반. 논리적 대안 살아있는 세포, 세포 동료 로부터 관심의 RNAs를 분리 하는 정화 과정 뒤의 내 인 성 전사 기계를 사용 하는 것입니다. 이 전략에 따라 방법은 실험실-친화 등의 세균성 세포에서 재조합 RNAs를 생산 하기 위해 개발 되었다 대장균⁵ 나는 해양 보라색 광합성 알파-proteobacterium Rhodovolum sulfidophilum ⁶. 세균에 재조합 RNA를 생성 하는 대부분의 메서드와 tRN....

프로토콜

1. 플라스 미드 건설

1. PCR에 의해 (또는) 반전 녹음 방송 RNA 서식 파일에서 시작 하는 경우에, PCR에 의해 증폭 식 플라스 미드에 있도록 5' 확장명이 뇌관을 사용 하 여 관심사의 RNA에 해당 하는 cDNA. 고 충실도 DNA 중 합 효소를 사용 하 여 원치 않는 변이 방지.
   1. 깁슨 어셈블리²⁰식 플라스 미드에는 cDNA를 삽입 하려면 다음 5' 확장 PCR 뇌관을 추가: 앞으로, 5'-tctccccctcccaggtactatccccttXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'; 역, 5'-ccctcctagggaacacatccttgaXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'; X의 RNA의 터미널 끝에 뉴클레오티드를 동종을 나타냅니다.
   2. 30 품 어 98 ° c, s 10의 30 주기 다음 s 98 ° C, 30에서 55 ° C와 30에서 s s 72 ° C, 및 72 ° c.에서 10 분의 마지막 확장에
2. 다이제스트 100 ng의 플라스 미드 pLELVd-BZB 10 U 유형 IIS 제한 효소 Bpi 의 0.5 ml에서 20 µ L 반응에서 37 ° C에서 1 시간을 위한 나 버퍼 G (10 ....

결과

ELVd 파생 시스템¹²을 사용 하 여 대장균 에서 재조합 RNA를 생성 하려면 관심의 RNA는 ELVd RNA 비 계에 투입 이다. 이 공상 RNA 가지 tRNA 리가 대장균에 따라 공동 표현 이다. 일단 처리 하 고 죽 습 circularized에서 관심의 RNA 돌출, 공상 원형 RNA 가능성이 세균 세포 ( 에 있는 현저한 농도 도달 공동 표현된 가지 효소와 복잡 한 ribonucleoprotein를 형성 그림 1). 따라서,이 시스템을 사용 하 여 재조합 RNA를 생성 하는 첫 번째 단계는 ELVd 시퀀스 변종 AJ536613에에서 T245-T246 ELVd cDNA의 특정 위치로 RNA에 해당 하는 cDNA를 삽입 이루어져 있다. 플라스 미드 pLELVd-BZB,이 polylinker 포함 된 위치 두 Bpi 로 내가.......

토론

ELVd 시퀀스 및 구조 요구 사항 가지 tRNA 리가 여 인식에 관련 된 연구를 하는 동안 우리 주의 원형 바이로이드의 예기치 않은 큰 축적에 비 호스트 대장균 에 두 분자의 공동 식 세균성 세포¹⁹에 양식입니다. 우리가 이해 하는 대장균 에 RNA 바이로이드의 큰 축적 아마 공동 표현 등 상대적으로 작은 매우 안정적인 RNA 분자의 결과 이었다 (333 nt), 높은 기반-결합, 원형 바이로이드, 그리고이 대 한 단백질 특정 바이로이드 높은 선호도 표시합니다. ELVd RNA 감염 된 공장¹⁷에 복제 하는 동안 그것의 circularization를 중재 하는 호스트 tRNA 리가 모집 해야 합니다. 비록 우리가 실험적인 확인을 하지 않아도, 우리는 두 분자 ribonucleoprotein 대장균 더 바이로이드의 RNA 안정화 및 박테리아의 리터 당 150mg의 현저한 농도 도달에 복잡 한 형성.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Phusion High-Fidelity DNA 중합효소	Thermo Scientific	F530S
Bpi I	Thermo Scientific	ER1011
Agarose	Conda	8010	D1 low EEO
Tris	PanReac AppliChem	A1086,1000
아세트산	PanReac AppliChem	131008.1214
EDTA	Sigma-Aldrich	E5134-500G
에티듐 브로마이드	PanReac AppliChem	A1152,0025	1%
Zymoclean 젤 DNA 회수	Zymo Research	D4001
NanoDrop	ThermoFisher Scientific	ND-3300
NEBuilder HiFi DNA 어셈블리 마스터 믹스	New England BioLabs	E2621S
DNA Clean & 농축기	Zymo Research	D4003
Eporator	Eppendorf	4309000019
Escherichia coli DH5α	Invitrogen	18265-017
트립톤	Intron Biotechnology	Ba2014
효모 추출물	Intron Biotechnology	48045
NaCl	PanReac AppliChem	131659.1211
Agar	Intron Biotechnology	25999
Ampicillin	PanReac AppliChem	A0839,0010
X-gal	Duchefa	X1402.1000
N,N-Dimethylformamide	PanReac AppliChem	131785.1611
NucloSpin Plasmid	Macherey-Nagel	22740588.250
Escherichia coli BL21(DE3)	Novagen	69387-3
Escherichia coli HT115(DE3)			Ref. Timmons et al., 2001
클로람페니콜	두셰파	C 0113.0025
글리세롤	PanReac AppliChem	122329.1211	87%
KH2PO4	PanReac AppliChem	131509.1210
K2HPO4	PanReac AppliChem	122333.1211
HCl	PanReac AppliChem	131020.1211
Phenol	Scharlau	FE04791000	90%
클로로포름	PanReac AppliChem	A3691,1000
Filtropur S 0.2	Sarstedt	83.1826.001
HiTrap DEAE Sepharose FF 열	GE Healthcare Life Sciences	17-5055-01
Ä KTAprime plus 액체 크로마토그래피 시스템	GE Healthcare Life Sciences	11001313
Acrylamyde	PanReac AppliChem	A1089,1000	2K
N,N' -메틸렌비스아크릴아미드	시그마-알드리치	M7279-100G
요소	PanReac AppliChem	146392.1211
붕산	PanReac AppliChem	A2940,1000
포름아미드	PanReac AppliChem	A0937,2500
브로모페놀 블루	시그마-알드리치	B8026-5G
크실렌 시안올	시그마-알드리치	X4126-10G
N,N&프라임;-비스(아크릴로일)시스타민	시그마-알드리치	A4929-5G