연구 조직 이식에 세균성 부착을 병렬 플레이트 관류 시스템의 생체 외에서 모델

요약

우리는 사내 디자인 된 생체 외에서 흐름 챔버 모델, 조직 이식에 세균성 부착의 조사 수 있는 설명 합니다.

초록

다양 한 valved 도관 및 텐트 장착 밸브 오른쪽 심 실 유출 지역 (RVOT) 밸브 교체 선 천 성 심장 질환 환자에 사용 됩니다. 그러나 인공 재료를 사용 하 여, 이러한 이식 세균성 감염 및 다양 한 호스트 응답을 따르게 됩니다.

미생물의 혈관 내 수술 준수에서 중요 한 역할을 하는 박테리아 및 호스트 요인의 식별은 중요성 더 나은 infective 심장 내 막 염 (IE) 같은 감염의 발병의 병 태 생리학을 이해 하 고 예방을 개발 하 전략입니다. 따라서, 생리 전단 조건 하에서 세균성 접착을 조사 하기 위해 유능한 모델의 개발은 필요. 여기, 우리는 새롭게 설계 된 생체 외에서 관류 챔버 병렬 플레이트에 따라 조직 이식의 다른 구성 요소에 세균성 부착의 연구와 같은 기질, 내 피 세포와 불활성 영역 노출 수를 사용 하 여 설명 . 이 방법은 결합 된 식민지를 형성 단위 (CFU) 세 흐름에서 세균성 접착으로 이식 재료의 성향 평가 하다. 더욱, 흐름 챔버 시스템 전단 조건 하에서 세균성 접착 구성 요소 혈액의 역할을 조사 하기 위해 사용할 수 있습니다. 우리는 조직, 그들의 표면 형태 및 세균성 종 특이성의 소스는 우리의 사내 디자인 된 생체 외에서 관류 모델을 사용 하 여 조직 이식에 세균성 부착에 주요 결정 요인 설명 했다.

서론

황색 포도상구균 (S. 구 균) 독성 패 혈 증 같은 심한 혈관 내 감염에 이르게 인간의 순환에 이식 하는 생물 학적 또는 생물 학적 비 표면 정착 호스트 면역 방어 시스템을 회피 전략의 다양 한 고용 및 IE^1,2,3,,45. IE 남아 있다 중요 한 치료 관련 개별 요인 IEare의 발병에 기여 하지 아직 완전히 이해^6,7동안 인공 심장 밸브의 이식 후 환자에서 합병증. 흐름 조건 하에서 박테리아 발생 하는 전단 세력, 그들은 배 벽⁸을 준수 하기 위해 극복 하기 위해 필요. 모델, 박테리아와 인공 밸브 조직 또는 흐름에서 endothelium 사이 상호 작용을 공부 하 고 수 있도록, 그들은 더 많은 비보에 상황을 반영 관심 있습니다.

몇 가지 특정 메커니즘 내 피 세포 (ECs) 노출된 subendothelial 매트릭스 (ECM) 조직 식민 및 vegetations, IE⁹에 필수적인 초기 단계 고의 성숙 하 고 세균 부착을 촉진 한다. 다양 한 포도 표면 단백질 또는 MSCRAMMs (미생물 표면 구성 요소 접착제 매트릭스 분자 인식) 설명 되었습니다 접착 호스트 세포와 ECM 단백질의 중재자로 fibronectin, 같은 분자와 상호 작용 하 여 fibrinogen, 콜라겐과 폰 Willebrand 요인 (VWF)^8,,1011. 그러나, 일부 독성 요인, 정적 조건에서 공부 하는 대부분의 분자 내 폴딩에 비추어 이러한 상호 작용의 많은 다른 혈관 내 수술 감염 혈액 순환에 관련이 있을 수 있습니다.

따라서, 우리는 사내 디자인 된 생체 외에서 병렬 플레이트 흐름 챔버 모델, RVOT 위치에 이식 조직 이식의 맥락에서 ECM와 ECs의 서로 다른 구성 요소에 세균성 부착의 평가 수 있는 선물. 이 작품에서 설명 하는 방법의 전반적인 목적은 박테리아와 밀접 하 게 관련 혈 류 병원 체의 환경 vivo에서 와 같은 흐름 조건에서 기본 혈관 내 수술 조직 간의 상호 작용의 메커니즘을 연구 하는 S. 구 균. 이 새로운 접근 방식을 이식 조직 표면 세균 준수 IE의 개발에 대 한 잠재적인 위험 요소를 식별 하는 민감성에 초점을 맞추고.

프로토콜

1. 생체 외에서 연구에 대 한 이식 조직 준비

참고: 세 가지 유형의 조직 사용 되었다: 소 심장 패치 (BP), Cryopreserved Homograft (CH)와 소 경 정 맥 이식 (BJV). BJV 도관 채널 (조직 유럽 Homograft 은행 (EHB)에 의해 처리 하 고 액체 질소를 사용 하 여 이전에 저장 된) 경우에, 벽과 판 막 병 전단지 사용 되었다. BP 패치 및 BJV 도관 제조 업체에서 구매 되었다. 사용 전에 다음 EHB 지침¹²채널을 녹여.

1. 모든 조직 0.9 %NaCl 사전 사용 하 여 린스 합니다.
2. 사용 하는 일회용 피부 생 검 조직 생 검 펀치 (직경에서 10 m m) 원형 조직 조각을 잘라 준비 합니다.
3. 일회용 멸 균 scalpels를 사용 하 여 같은 높이에 모든 조직 패치를 잘라.
4. 도 (예 : BJV 도관)로 고정 하는 조직에 대 한 인간의 알 부는 정착 액을 중화 하의 200 g/L와 4 ° C에서 하룻밤 이식 조각 품 어.
5. 도 0.9%의 잔류물에 밖으로 세척 NaCl 결정 접시에.  1 분 동안 3 번 반복 합니다.

2. 관류 실험에 대 한 박테리아를 준비

참고: 세 개의 세균 분리 사용 되었다: S. 구 균 완 (ATCC 12598), ATCC 149900 S. epidermidis , S. sanguinis NCTC 7864. S. 구 균 과 S. epidermidis tryptic 간장 국물 (TSB)에 37 ° C에서 성장 했다와 S. sanguinis 5% CO₂ 두뇌 심 혼 주입 국물 (BHI)에서 37 ° C에서 성장 했다.

1. 단단한 혈액 한 천 격판덮개에 박테리아의 숙박 문화를 준비 합니다.
   1. 메 마른 루프를 사용 하 여 냉동된 박테리아를 다쳤어요 37 ° c.에 숙박 문화에 대 한 뮬러-힌 튼 혈액 한 천 배지 위에 접종을
2. 살 균 접종 루프를 사용 하 여 하룻밤 혈액 한 천 문화에서 하나의 식민지를 선택 하 고 37 ° c.에 하룻밤 문화와 14 mL 튜브에 TSB 또는 BHI의 10 mL에 접종을
3. 야간 문화 (g, 4 ° C, 10 분 x 3000) centrifuge 고 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) 10 mL에 산 탄을 resuspend. 얼음에 14 mL 튜브를 배치 합니다.
4. 5 (6)-카-fluorescein N-hydroxy-succinimidyl 에스테 르 (CF)에서 에탄올의 3.7 mg/mL 해결책의 약 수를 준비 하 고-20 ° c.에 저장 또한 CF의 150 µ g/mL의 ' 초순 '를 사용 하 여 재고 희석.
   참고: 알루미늄 호 일을 사용 하 여 광원에서 튜브를 보호 하 고-20 ° c.에 저장
5. Centrifuge 박테리아 (g, 4 ° C, 10 분 x 3000)와 PBS의 800 µ L에 산 탄을 resuspend 고 150 µ g/mL CF 솔루션 (관류 실험을 위해 사용 하는 30 µ g/mL의 최종 농도)의 200 µ L를 추가 합니다. 알루미늄 호 일 빛에서 튜브를 보호 하 고 궤도 셰이 커를 사용 하 여 30 분 동안 품 어.
6. 라벨, 후 PBS에 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 솔루션의 2%를 차단 하 고 스핀 (g, 4 ° C, 10 분 x 3000). 원심 (g, 4 ° C, 10 분 x 3000), PBS와 펠 릿 박테리아의 10 mL를 사용 하 여 세척 단계를 따르십시오.
7. 해당 하는 OD₆₀₀ (광학 밀도) 0.65의 얻을 10⁷ 콜로 니 형성 단위 (CFU) /mL (CFU 뮬러-힌 튼 혈액 한 천 배지에서 계산에 의해 확인), PBS와 박테리아를 희석. 관류 실험 전에 얼음에 어둠 속에서 튜브를 유지.
   참고입니다. OD₆₀₀ 측정 박테리아의 대략적인 수를 반영 하는 명심에서 하십시오. 효과적인 접종 량을 계산, 직렬 희석 방법은 섹션 3.8에에서 설명 된 대로 숫자를 기반 하는 마약을 확인 하는 추가 필요한 단계입니다.

3. 관류 실험 체 외에 병렬 플레이트 흐름 챔버를 사용 하 여

1. 연락해 세균 현 탁 액 직면 하는 내부 표면 조직 생 검 (1.1-1.5 단계에서 준비 하는) 동일한 두께 직경 10 mm의 흐름 챔버 시스템에 탑재 합니다.
   참고: 다양 한 이식에 걸쳐 동일한 조직 두께 같은 조직 높이 모든 조건에서 층 류를 허용 하는 채널에 도달 보장 합니다. 흐름 챔버의 모든 요소는 제시 하 고 그림 1에 설명 된.
   1. 프로토콜을 시작 하는 8 m m 원형 구멍 뚫 기와 현미경 슬라이드와 고무 가스 켓 라운드 조직 조각을 놓습니다.
      참고: 현미경 슬라이드 8 m m 구멍의 생성을 허용 하도록 초박형 하단 필름을 소유한 다. 고무 시트 함께 그것은 조직 표본 및 흐르는 매체 간의 직접 접촉을 가능 하 게 수정 하 고 또한 실험 기간 동안 생 검의 전위를 방지. 조사 조직의 흐름 (작은 직경)에 노출 되는 표면은 겸 자에 의해 조작 될 수 없습니다.
   2. 챔버의 하단 금속 프레임에 포함 되는 가스 켓 시트에는 조직으로 홀더를 삽입 합니다.
   3. 이전 삽입된 조직 홀더 있는 챔버의 아래쪽에 해당 가스 켓 시트 위쪽 금속 프레임에 부착. 이후 8 개의 나사와 전체 챔버를 탑재 하 고 너트를 나사. 챔버 높이 항상 같은 이식에서 다는 것을 확인 하십시오.
      참고: 챔버 높이 나사를 강화 시 항상 결정 되어야 합니다. 캘리퍼스 또는 눈금자를 사용 합니다.
2. 연동 펌프와 튜브와 유체 저수지 흐름 챔버를 연결 합니다.
3. 3 다 인/cm² (평방 센티미터 압력 단위 당 다 인)의 전단 응력으로 10⁷ CFU/mL (CFU 계산과 OD₆₀₀ 측정 관련 하 여 확인) 붙일 표시에 박테리아의 PBS 정지 된 조직에 의해 perfuse 연동 펌프의 수단 (흐름 속도 4 mL/min) 1 h 400 mL 세균성 저수지 (사내 디자인, 그림 1) 접시 온도 (자료 테이블)를 사용 하 여 37 ° C에서 에어컨을 사용 하 여.
4. 지속적으로 동일한 컬렉션 저수지를 사용 하 여 100 mL 세균성 정지 recirculate.
5. 관류, 후 출시 하는 이식 고 3 분에 대 한 실험실 궤도 셰이 커를 사용 하 여 12-잘 접시에 PBS의 두 번 4 mL와 조직 조각을 세척 챔버를 해체. 이후에 작은 직경의 펀치 피부 생 검을 사용 하 여 이식의 안쪽 부분을 잘라.
6. 각 조직 생 검 살 균 0.9%의 1 mL를 포함 하는 별도 14 mL 튜브에 배치 NaCl. #1 튜브 레이블.
7. 10 분 동안 쥡니다 목욕을 사용 하 여 조직에서 세균을 분리 (진폭 = 100% 및 주파수 = 45 kHz).
   참고: 이식 패치 TSB 액체 매체 OD₆₀₀ 측정 뒤에 37 ° C에서 하룻밤의 외피에 평가 해야 하는 조직에서 박테리아의 전체 분리 제어 패치 박테리아 무료 솔루션으로 치료에 비해.
8. CFUs 계산 뮬러-힌 튼 혈액 한 천 배지에서 희석 직렬 메서드를 사용 합니다.
   1. 10 mL 쥡니다 후 얻은 세균 현 탁 액의 직렬 희석 수 있도록 메 마른 염 분의 단일 14 mL 튜브를 준비 합니다. # 2이이 튜브 레이블.
      참고: 각 조직 실험 한 튜브 10 mL의 0.9 %NaCl 필요 합니다.
   2. 살 균 0.9%의 10 mL와 함께 3 14 mL 튜브 준비 단계 2.7에서에서 초기 세균 서 스 펜 션의 직렬 희석에 대 한 NaCl. #3, #4, #5 다음과 같이 튜브 라벨.
      참고:이 단계는 세균성 관류 실험에 사용에 진짜 CFU 번호를 알고 하는 데 필요한.
   3. 소용돌이 혼합 각 튜브 15 미 소용돌이 대 한 튜브 직렬 희석 수 있도록 초기 세균 현 탁 액 뿐만 아니라 조직 생 검.
   4. 3 한 천 배지, 두 조직 실험 (박테리아의 관류와 PBS의 제어 관류)에 대 한 및 perfusions 사용 초기 세균 현 탁 액에 대 한 세 번째 준비.
   5. 다음과 같은 방식으로 10^-1, 10^-3 , 10^-4조직 실험에 대 한 접시 당 3 개의 분야를 레이블을 지정 합니다. 세균 perfusates에서 CFUs의 수를 계산 하려면 다음과 같이 라벨 접시: 10^-1, 10^-3, 10^-5 및 10^-7.
      참고: 모든 표시 agar에 번호판 등 10^-1, 10^-3 CFU/mL는 다음날에 계산의 마지막 번호를 참조 하십시오. 컨트롤 플레이트 팬 들은 어떤 분야의 정보를 요구 하지 않는다. 사용 하기 전에, 혈액 한 천 배지 한다 층 류 후드 아래에 배치 되며, 과도 일 분을 제거 하려면 열.
   6. 계속 하려면 직렬 희석을 준비, 튜브 # 2에 지하철 # 1의 100 µ L 전송 하 고 적극적으로 소용돌이 함께 혼합.
   7. # 1과 #2 해당 분야 10^-1 에 튜브의 내용을 100 µ L 10^-3 한 천 격판덮개의 확산. 마찬가지로, 10 µ L 튜브 #2 부문 10^-4에 확산, 4 번 10 µ L의 각 볼륨에서 4 별도 종양을 얻기 위해이 단계를 반복.
      참고: 때문에 작은 볼륨 도금 분야 10^-4에 대 한 사용, 그것 성장된 CFUs의 평균 수 있도록 방울의 여러 수 하도록 조언 된다.
   8. 준비 하려면 초기 문화의 직렬 희석, 튜브 #3 단계 2.7에서에서 100 µ L 세균 현 탁 액의 전송 하 고 적극적으로 소용돌이 함께 혼합. 튜브 # 4를 100 µ L 튜브 # 3의 추가 잘 혼합, 후속 튜브 # 5에 대 한 절차를 반복.
   9. 분야 10^-3, 10^-5, 10^-7 , 10^-1 의 혈액 한 천 배지 위에 각각의 튜브 #3, #4, #5 및 조정된 세균 현 탁 액 (2.7 단계)의 내용 100 µ L를 확산.
   10. 두고 공기 층 류 후드에 혈액 한 천 배지 건조 10 분 동안 일반적으로 세균 확산. 이후에, 야간 보육에 대 한 37 ° C에서 접시를 놓습니다.
   11. 밤새 부 화 후 세균성 식민지는 관류 사용 시작 세균 현 탁 액에는 조직 생 검으로 CFUs/mL 접착에서 발생 하는 CFUs의 수를 계산 합니다. CFU/c m²로 결과 표현 한다.

4. 형광 현미경 검사 법 준수 박테리아 관류 시 조직의 이식에

1. 관류, 후 PBS의 조직 조각을 세척 (단계 3.5 참조) 및 작은 직경의 펀치를 사용 하 여 이식의 안쪽 부분을 잘라.
2. 6 잘 플레이트를 준비 하 고 장착 매체 (자료 테이블)의 작은 물방울을 배치.
3. 설치 매체의 한 방울에 아래로 그것의 perfused 표면 조직의 각 조각을 놓습니다.
4. 접시는 형광 스캐너 (테이블의 재료)를 사용 하 여 읽기. 세균성 라벨 사용 fluorophore 따라 여기 및 방출 파장의 매개 변수를 설정 합니다.

결과

뒤에 있는 메커니즘을 이해 하기 IE 개발,이 모델 박테리아의 평가 및 조직 관련 요인 감염 발병의 비보에 상황에 존재.

자세하게, 소설 체 외에서 접근 수 있게 3-10 다 인 생리 적 범위의 전단 응력을 발휘 하는 조직에 붙일 레이블된 박테리아를 perfusing에 의해 다른 이식 조직에 흐름 조건에서 세균성 접착을 계량 / cm² 는 RVOT에 대 한입니다. 이 작품에서는, 우리는 3 다 인/c m²에 대응 4 mL/min의 유량을 사용 합니다. 고려 채널 높이 0.3 m m의 모든 조직 패치, 탑재 된 이식 약 39 mm의 중간 입구 사이의 거리, ( 그림 1참조) 관류 챔버 보장 완전 개발된 층 류 흐름 (= 3.8...

토론

최근 임상 관측 게 IE의 특별 한의 식을 사용 하 여 RVOT^6,13의 밸브 교체 받은 것 환자에서 합병증으로. IE에서 이식된 밸브의 부전 광범위 한 염증 및 procoagulant 반응^1,14로 이어지는 혈관 내 수술 이식와 세균 상호 작용의 결과 이다. 모델 제시 소설 체 외에서 를 사용 하 여 조직 구조와 세균 요소에 차이 비보에 사용 된 이식¹⁵의 감염 민감성을 변조 가능성이 있다면 조사 수 있었습니다. BJV 및 채널 이식 조직 흐름 조건에서 세균성 모집으로 비슷한 성향을 보였다. 따라서 데이터에 일반적 조직 및 그것의 표면 구조 뿐만 아니라 특정 세균성 접착 단백질 본질적 의 소스는 초기 세균 부착에서 주요 결정 요인...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
소 심낭(BP) 패치, Supple Peri-Guard Pericardium	Synovis Surgical Innovations, USA	PC-0404SN
소 경정맥 도관(BJV)	Contegra 도관; Medtronic Inc, 미국	M333105D001
CH 냉동 보존 동종이식	유럽 호모그라프 은행(EHB)	-
Acu-Punch	Acuderm Inc, 미국	P850(8mm); P1050 (10 mm)
인간 알부민	플렉스부민; Baxter, Belgium	BE171464 LOT:16G12C
트립틱 소이 육수 (TSB)	Fluka, Steinheim, Germany	22092-500G
심장 주입 국물 (BHI)	Fluka	53286-500G
인산염 완충 식염수 (PBS).	Gibco	14190-094
5(6)-Carboxyfluorescein N-hydroxysuccinimide 에스테르(CF)	Sigma-Aldrich, Germany	21878-100MG-F
연동 펌프(MODEL ISM444B)	Ismatec BVP-Z 표준; Cole Parmer, Wertheim, Germany	631942-2
초음파 처리 수조	VWR 초음파 세척기; VWR, Radnor, Pa	142-6044	230V/50 -60Hz 60VA; HF45kHz, 30W
ProLong Gold Antifade Mountant	Invitrogen by ThermoFisher	P36930
InCell Analyzer 2000 (형광 스캐너)	GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, Pa	29027886
Arium Pro VF - 초순수 - H2O MilliQ	Millipore	87206462
Microscopic slides - Tissue Culture Chambers (1-well)	Sarstedt	94.6140.102
1-웰 온 Lumox 탈착 가능한	Sarstedt	94.6150.101
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Tygon LMT-55 튜빙	Saint Gobain 성능 플라스틱 및 무역;
온도 조절기	BMG BIOMEDIZINTECHNIK	300-0042	230V, 90VA, 50Hz