급성 척수 조각 Substantia Gelatinosa 신경에 있는 전체 셀 패치 클램프 기록에 대 한 준비

요약

여기, 우리가 시험관에서 척수 조각에서 신경 세포 substantia gelatinosa (SG)에서 만든 전체 셀 패치 클램프 기록에 대 한 필수 단계 설명 합니다. 이 메서드는 기본 막 속성, 시 냅 스 전송 및 공부 SG 뉴런의 형태학 상 특성을 수 있습니다.

초록

신경 세포 substantia gelatinosa (SG)에서 최근 전체 셀 패치 클램프 연구는 큰 신체의 감각 전송, nociceptive 규정과 만성 통증이 나 가려움 개발 기본 척추 메커니즘에 대 한 정보를 제공 합니다. 신경 속성에 대 한 우리의 이해 및 sg에서 지역 회로의 구성에 추가 형태학 연구 급성 척수 조각의 유틸리티에 따라 함께 electrophysiological 녹음의 구현 향상 되었습니다. 여기, 우리는 척수 조각 및 쇼 대표 전체 세포 기록 및 형태학 결과의 준비에 대 한 상세 하 고 실용적인 가이드를 제시. 이 프로토콜 이상적인 신경 보존을 허용 하 고 어느 정도 조건 vivo에서 모방 수 있습니다. 요약 하자면, 척수 조각의 생체 외에서 준비 얻을 수 안정 된 전류와 전압 클램프 녹음을 가능 하 게 수 따라서 용이 하 내장 막 속성, 로컬 회로에 대 한 자세한 조사와 다양 한 실험 방법을 사용 하 여 신경 구조입니다.

서론

Substantia gelatinosa (SG, lamina 척추 등 경적의 II) 전송 하 고 규제 하는 감각 정보에 대 한 논의 여지가 없 중요 한 릴레이 센터 이다. 그것은 기본 구심 섬유, 지역 수 및 생 내림차순 억제 시스템¹에서 입력을 받아 흥분 성의 억제 수 구성 됩니다. 최근 수십 년간, 급성 척수 조각 준비의 개발 및 전체 셀 패치 클램프 기록의 출현 설정한 SG 뉴런^2, 의 본질적인 electrophysiological 및 형태학 속성에 대 한 다양 한 연구 ^{3 , 4} 뿐만 아니라 SG^5,6에 로컬 회로의 연구. 또한, 생체 외에서 척수 조각 준비를 사용 하 여 연구원 신경 excitabilities^7,8에 변화를 해석할 수 있는, 이온의 기능^9,10....

프로토콜

모든 실험 프로토콜 설명 동물 윤리 위원회의 남 창 대학 (난창, 홍보 중국, 윤리적인 No.2017-010)에 의해 승인 되었다. 모든 노력이 스트레스와 실험 동물의 고통을 최소화 하기 위해 만들어졌다. 여기 수행 electrophysiological 녹음 실 온 (RT, 22-25 ° C)에서 실행 되었다.

1입니다. 동물

1. 어느 섹스의 Sprague-Dawley 쥐 (3-5 주 이전)을 사용 합니다. 12 h 빛 어두운 주기에서 동물을 집 고 그들에 게 충분 한 음식 및 물 광고 libitum 액세스.

2입니다. 솔루션 및 자료 준비

1. 솔루션
   1. 준비 하는 인공 뇌 척추 액체 (실제) (mM): 117 NaCl, 3.6 KCl, 1.2 NaH₂포₄·2H₂O, 2.5 CaCl₂·2H₂O, 1.2 MgCl₂·6H₂O, 25 NaHCO₃, 11 D-포도 당, 0.4 ascorbic 산 및 2 나트륨 pyruvate입니다. 표 1을 참조 하십....

결과

급성 척수 조각 그림 1에 표시 된 다이어그램에 따라 준비 되었다. 조각화 및 복구, 후 척수 조각 녹음 실로 옮겨 졌다. 건강 한 신경 소마 모양 IR DIC 현미경을 사용 하 여에 따라 확인 되었다. 다음, SG 뉴런의 활동 전위 전류 펄스 (1 s 기간) depolarizing의 시리즈에 의해 elicited 했다 신경 RMP에서 열렸다. 보이는 것 처럼 그림 2설명 되어 있고 이전 연구에 의해 분류 한 SG 신경 포함 토 닉-발사, 지연 발사에서에서 관찰된, 간격-발사, 초기 버스트, phasic 파열, 단일-스파이크와 꺼 려 발사, 발사 패턴.

이 준비를 구현, 우리 또한 기록 subthreshold 전류 및 자발적으로 나타나는 전류 전압 클램프에........

토론

이 프로토콜 세부 SG 뉴런^18,19,,2021에 전체 셀 패치 클램프 실험을 수행할 때 우리가 성공적으로 사용한 척수 조각 준비 단계. 이 메서드를 구현 하 여 우리는 최근 그 minocycline 보고 차세대 항생물질, 현저 하 게 SG 뉴런¹⁹에 연 접 메커니즘을 통해 억제 시 냅 스 전송 향상 시킬 수 있는. 또한,이 에이전트는_h 의 진폭을 감소 하 고 더 SG 뉴런²¹의 흥분을 억제 수 있습니다. 이러한 지원 게시 데이터 및 대표 결과 우리가 여기에 표시, 현재 설명 방법은 electrophysiological 연구의 넓은 범위에서 사용 하기에 적합.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
KCl	Sigma	60130	ACSF, 자당-ACSF 및 K+ 기반 세포 내 용액
NaH2PO4·의 제조에 사용됩니다. 2H2O	Sigma	71500	ACSF, 자당-ACSF 및 PBS
CaCl2·의 제조에 사용됩니다. 2H2O	Sigma	C5080	ACSF 및 자당-ACSF
MgCl2·의 제조에 사용됩니다. 6H 2 < / sub>O	Sigma	M2670	ACSF 및 자당 -ACSF
NaHCO의 제조에 사용 3< / sub>	Sigma	S5761	ACSF 및 자당 -ACSF
D-Glucose	Sigma	G7021	ACSF
Ascorbic acid	Sigma	P5280	ACSF 및 자당 -ACSF
의 제조에 사용나트륨 피루브 산	시그마	A7631	ACSF 및 자당 -ACSF
	시그마	S7903	자당 -ACSF
K-글루코네이	Wako	169-11835	K + < / sup> 기반 세포 내 용액
Na2< / sub>-Phosphocreatine	Sigma	P1937	제조세포 내 용액
EGTA	Sigma	E3889	제조에 사용 세포 내 용액
HEPES	Sigma	H4034	사용 세포 내 용액
Mg-ATP	Sigma	A9187	사용 세포 내 용액
Li-GTP	Sigma	G5884	사용 세포 내 용액
CsMeSO4	Sigma	C1426	Cs+ 기반 세포 내 용액
CsCl	Sigma	C3011	Cs+ 기반 세포 내 용액
TEA-Cl	Sigma	T2265	Cs+ 기반 세포 내 제조에 사용 용액
: Neurobiotin 488	Vector	SP-1145	0.05 % neurobiotin 488은 형태 학적 연구에 사용될 수
Agar	Sigma	A7002	3 % 한천 블록은 파라
포름 알데히드	그마	P6148	4 % 파라 포름 알데히드는 면역 조직 화학 처리에 사용되었습니다
Na2< / sub>HPO4< / sub>	Hengxing Chemical	PBS
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