여기에 설명 된 프로토콜 연구자를 특별히 선택 된 사이트에 아 데 노비 루스 capsids 간단한 화학 수정에 있습니다. 차폐 된 아 데 노 바이러스 벡터 입자 대상이 유전자 전달 벡터 생성 될 수 있습니다, 그리고 벡터 호스트 상호 작용은 공부 될 수 있다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
차폐 및 타겟팅에 대 한 유전과 화학 Capsid 수정 아 데 노비 루스 기반 유전자 전달 벡터의 결합
이 논문에서
요약
초록
아 데 노 바이러스 벡터는 유전자 백신 접종과 oncolytic virotherapy 위한 강력한 도구입니다. 그러나, 그들은 특히 vivo에서 배달 후 여러 원치 않는 벡터-호스트 상호 작용 하는 경향이 있다. 정의 된 벡터 표면 수정 수행 하는 경우 원치 않는 벡터-호스트 상호 작용에 의해 부과 된 제한 에서만 수 합의 극복할 수입니다. 이러한 수정에는 원치 않는 상호 작용에서 입자의 차폐 및 새로운 ligands의 도입에 의해 대상으로 포함 됩니다. 여기에 제시 된 프로토콜의 목표 생성 하 리더를 사용 하는 차폐 하 고, 원하는 경우, 인간의 아 데 노 바이러스 유전자 전달 벡터 또는 oncolytic 바이러스 대상이 변경. 프로토콜에는 아 데 노 바이러스 벡터 capsids 표면 합성 고분자, 탄수화물, 지질, 또는 다른 생물학 또는 화학 moieties의 특정 화학 첨부 하 여 수정 하는 연구자 수 있게 된다. 이해 고의 비보에 아 데 노 바이러스 벡터의 배달에 대 한 장벽을 극복 하 보였다 결합 된 유전과 화학 capsid 수정의 최첨단 기술을 설명 합니다. 생물학적으로 활성 바이러스 또는 바이러스 유래 벡터가 특정 화학 반응을 수행 하기 위한 중요 한 단계는 상세 하 고 주석 설명 제공 됩니다. 프로토콜에서 설명 하는 기술 (자연스럽 게 결 석) 시스테인의 유전자 도입에 따라 파생 하는 아 데 노 바이러스 벡터의 솔벤트 노출 반복으로 잔류물. 이 시스테인 잔류물, 높은 titers 벡터의 생산, 후 악용 될 수 있는 매우 특정 하 고 효율적인를 벡터 다양 한 물질 클래스에서에서 분자의 화학식 화학 결합에 대 한 특정 화학 반응성을 제공 입자입니다. 중요 한 것은,이 프로토콜 아 데 노 바이러스 벡터 capsids의 다른 (비-thiol 기반) 화학 수정의 광범위 한 다양 한 수행 하 쉽게 적응 될 수 있다. 마지막으로, 그것은 가능성이 그 비 싸여 바이러스 기반 유전자 전달 벡터 보다 다른이 프로토콜의 기초에서 아 데 노 바이러스를 수정할 수 있습니다.
서론
Adenoviruses (광고), Adenoviridae, 가족의 구성원은 비 싸여 DNA 바이러스의 70 이상 종류를 지금까지 확인 된 (http://hadvwg.gmu.edu) 되었습니다. Hemaglutination 속성, 게놈 구조 및 시퀀싱 결과 따라 70 광고 종류 7 종 (인간의 adenoviruses g A)1,2로 나눌 수 있습니다. 인간의 광고 게놈 크기에서 38 kb 이며 icosahedral nucleocapsid3에 의해 캡슐. 그들의 풍부 때문에 capsid 단백질 hexon, penton 기지와 섬유는 모두 라고 하 주요 capsid 단백질. 가장 풍부 하 고 큰 capsid 단백질 hexon 12 hexon homotrimers,45의 구성 된 각 20 capsid 측면을 형성 한다. 펜 톤, 각 icosahedral 가장자리 (정점)에 있는 펜 톤 베이스의 pentamers의 구성 되어 있으며 당화 섬유 trimers5,
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
참고:에서 다음과 같은, geneti 화학 PEGylation 벡터 세부 사항에 설명 하는 광고에 대 한 프로토콜. PEG moiety의 특정 연결을 사용 하려면 Ad5 벡터는 미리 유전자 이전 간행물36의 경우와 maleimide 활성화 못에 설명 된 대로 하이퍼 루프 5에서 hexon 단백질에 시스테인 잔류물을 도입 하 여 수정 화합물 화합물 커플링으로 사용 됩니다.
1. CsCL 단계 기울기로 벡터 정화에 대 한 버퍼의 준비
- 아 데 노비 루스 버퍼 (광고-버퍼)의 400 mL 50 mM HEPES (4.76 g/400 mL)을 추가 하 여 준비 및 150 m m NaCl (3.504 g/400 mL) 이중 증 류 물 (ddH2O). 350 mL이이 버퍼의 다음 3 개의 광고 버퍼 이체 준비 필요 합니다.
- 변형 a: 150ml 광고 버퍼의 pH 7.6 NaOH로 조정 합니다.
- 변형 b: 50 ml 10 mM TCEP [tris(2-carboxyethyl)phosphine), 0.143 g]의 최종 농도 추가 하 고 HCl로 pH 7.2에 조정.
- 변형 c: 150 mL에 0.5 m m TCEP (0.022 g....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
그림 2 는 성공적인 벡터 생산을 나타내는 293 (HEK 293) 셀에 cytopathic 효과 (CPE)의 예를 보여 줍니다. 세포는 바이러스 벡터와 접종 후 40-48 시간 형태 (그림 2C)을 표시 합니다. 수확에 대 한 올바른 timepoint 세포 세포의 용 해에 의해 바이러스 입자를 잃지 않는 및 유전자 도입된 thiol 그룹의 산화 방지를 위해 결정적 이다. 벡터 입자 세포 세포의 용 해에 의해 매체에 발표는, 유전자 도입된 thiols 거의 즉시 산화 되 고, 그리고 그것을 정화 하 고 화학적으로 그들을 수정 하기가 될 것입니다.
그림 3 은 모범적인 CsCl 밴드를 보여준다. 불연속 Cs.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
유전자 도입된 시스테인 수정할 수 있습니다 화학적 효율은 일반적으로 80-99%, 그리고 특정 변수가이 효율에 영향을 미칠. 첫째, 그것은 파라마운트 유전자 도입된 시스테인 조기 산화를 받게 하지 않습니다. 프로듀서 셀의 환 환경에서 잘 보호 되 고, 하는 동안 그것은 화학 수정 동안 프로듀서 셀에서 벡터 입자를 해제 한 후 비 산화 환경 제공 하기. 이 위해 시 약을 줄이고 0.1-10 mM에서 농도에서 사용할 수 있습니다 그리고 maleimide 활성화 화합물과 쉽게 반응 thiol 그룹을 포함 하지 않는 환 약을 사용 해야 하는. 둘째, maleimide 활성화 화합물을 사용 하 여, 커플링 반응 중 pH 넘지 말아야 한다 7.35, pH 7.4 반응의 특이성을 줄일 수 있는 보다 큰의 이후. 셋째, 어떤 경우에, 아민 프리 버퍼 (예를 들어, HEPES, PBS) 반응에 사용 되어야 한다. 메모의 시스테인-베어링 벡터 입자 이중 CsCl 설명, 다음 HEPES/10% 글리세롤 화학 수정 이전에 저장 된으로.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개 없다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Vector 정제 및 화학 변형 | |||
| Argon 가스 | Air liquide | 지역 가스 딜러 | |
| 액체 질소 | Air liquide | 지역 가스 딜러 | |
| 500 mL 원심분리기 튜브 | Corning | 431123 | |
| Stericup Express Plus 0.22 µ m | Millipore | SCGPU02RE | |
| Tris(2-카르복시에틸) 포스핀(TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-10g | |
| 2mL(3mL) Norm Ject(주사기) | Henke Sass Wolf | 4020.000V0 | |
| 일회용 미세 입자 바늘(노란색 0.9 x 40mm) | Henke Sass Wolf | 4710009040 | |
| 염화세슘 99.999% 울트라 품질 | Roth | 8627.1 | |
| 실리카 겔 비드 | Applichem | A4569.2500 | |
| 메톡시폴리에틸렌 글리콜 말레이미드 - 750 (PEG mal-750) | Iris Biotech | 는 실리카 겔 비드에 -80 °에 저장합니다. C | |
| 13.2 mL 울트라 클리어 초원심분리기 튜브 | Beckman Coulter | 344059 | 후드에서만 열림 |
| PD-10 크기 배제 크로마토그래피 컬럼 | GE Healthcare | 17-0851-01 | 4 °에 보관; C |
| Hepes | AppliChem | A1069.1000 | |
| SDS Ultrapure | AppliChem | A1112,0500 | |
| 글리세롤 | AppliChem | A1123.1000 | |
| Name | Company | 카탈로그 번호 | Comments |
| 세포 배양용 재료 | |||
| DPBS | PAN Biotech | P04-36500 | |
| DMEM | PAN Biotech | P04-03590 | |
| Trypsin/EDTA | PAN Biotech | P10-0231SP | |
| FBS Good | PAN Biotech | P40-37500 | |
| 페니실린/스트렙토마이신 | PAN Biotech | P06-07100 | |
| Biosphere 필터 팁 (다양한 크기) | Sarstedt | ||
| 혈청학 피펫 (다양한 크기) | Sarstedt | ||
| 반응 튜브 (다양한 크기) | Sarstedt | ||
| TC 플레이트 15cm | Sarstedt | 83.3903 | |
| Name | Company | 카탈로그 번호 | 코멘트 |
| 은 염색 프로토콜 재료 | |||
| Methanol | J.T.Baker | 8045 | |
| 에탄올 절대 | AppliChem | 1613,2500PE | |
| 아세트산 | AppliChem | A0820,2500PE | |
| 포름알데히드 37% | AppliChem | A0877,0250 | |
| 에탄올 앱솔루트 | AppliChem | A1613,2500PE | |
| 티오황산나트륨 | AppliChem | 1,418,791,210 | |
| 질산은 | AppliChem | A3944.0025 | |
| 탄산나트륨 | AppliChem | A3900,0500 | |
| Name | Company | 카탈로그 번호 | 코멘트< |
| strong>특수 실험실 장비 | |||
| Desiccator | Nalgene | 5311-0250 | |
| Megafuge 40 | Heraeus | ||
| Roter for Megafuge TX750 + 500 mL 튜브용 어댑터 및 뚜껑 | Heraeus | ||
| 수조 | 기존 | ||
| 초원심분리기 예: Optima XPN-80 | Beckman Coulter | ||
| 적합한 Ultrazentrifuge Rotor 예: SW41 | Beckman Coulter | ||
| pH -Meter | 클램프 | ||
| 스탠드 | 기존 | ||
| 구스넥 램프 | 기존 | ||
| 오버 헤드 로터 | 기존 | ||
| 열 블록 | 기존 | ||
| 광도계 (OD 260) | 기존 |
참고문헌
- Benko, M., Harrach, B. Molecular evolution of adenoviruses. Current Topics in Microbiology and Immunology. , 3-35 (2003).
- Davison, A. J., Benko, M., Harrach, B. Genetic content and evolution of adenoviruses. Journal of Genetic Virology. 84, 2895-2908 (2003).
- Rowe, W. P., Huebner, R. J., Gilmore, L. K., Parrott, R. H., Ward, T. G.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
