흡입 마 취 코-투-두뇌 약물 전달 평가 Intranasal 행정을 위한 새로운 방법

요약

여기는 실험 동물에 대 한 안정적인 intranasal 관리 최소한의 물리적 스트레스와 흡입 마 취의 두 가지 새로운 방법에 설명합니다. 우리는 또한 방사선된 [¹⁴C]를 사용 하 여 코-투-두뇌 통로 통해 뇌에 약물 분포 레벨의 양적 평가 하는 방법 설명-수용 성 고분자의 모델 기판으로 눌린.

초록

Intranasal 행정 혈액-뇌 장벽 circumvents 치료제의 코-투-두뇌 배달에 대 한 잠재적인 경로 수를 보고 되었습니다. 그러나, 몇 가지 보고서는 정량 분석 뿐만 아니라 최적의 관리 조건 및 코-투-두뇌 배달의 수사를 위해 식이요법을 먹이 지 되었습니다. 설치류를 사용 하 여 코-투-두뇌 통로 메커니즘에 대 한 연구에서 제한 된 진행 후보 약물에 대 한 코-투-두뇌 전달 시스템 설계 측면에서 상당한 장애를 나타냅니다.

이런 점에서 진보를 얻으려면, 우리 개발 하 고 실험 동물에 대 한 안정적인 intranasal 행정 흡입 마 취의 두 가지 새로운 방법으로 평가. 우리는 또한 라디오 표시 [¹⁴C]를 사용 하 여 코-투-두뇌 통로 통해 두뇌에 마약 유통 수준 평가 하는 방법 설명-눌린 (분자량: 5000) 수용 성 고분자의 모델 기질으로.

처음에, 우리는 안정적인 마 취 동물에 신뢰할 수 있는 관리를 수행할 수 있게 일시적으로 열 수 있는 마스크를 사용 하 여 피 펫 기반 intranasal 관리 프로토콜 개발. 이 시스템 [¹⁴C]를 사용 하 여-눌린 작은 실험 오류와 함께 뇌에 전달 될 수 있는.

우리는 이후 mucociliary 클리어런스 (MC)의 효과 최소화 하기 위해 개발 된 식도 통해 기도 측면에서 역방향 cannulation 수 반하는 intranasal 관리 프로토콜 개발. 이 기술은 상당히 높은 수준의 [¹⁴C] 주도-눌린, 양적 嗅, 뇌, 그리고 피 펫 방법 보다 수 질 oblongata에 발견 되었다. 이 비 강에 마약 솔루션의 유지 비 강에 MC 반대 방향으로는 주사기 펌프를 사용 하 여 활성 관리에 의해 실질적으로 증가 하기 때문에 나타납니다.

결론적으로, intranasal 행정이 연구에서 개발의 두 가지 방법 설치류 약 동학을 평가 하기 위한 매우 유용한 기술 될 기대 될 수 있습니다. 역방향 cannulation 방법, 특히, 약 후보자의 코-투-두뇌 배달의 완전 한 잠재력을 평가 하는 데 유용 수 있습니다.

서론

펩 티 드, oligonucleotides, 항 체 등 biomedicines 내 화 중앙 신 경계 장애는 현재 아무 치료 요법에 대 한 새로운 치료 대리인으로 잠재적인 응용 프로그램으로 간주 됩니다. 그러나, 대부분 biomedicines 수용 성 고분자 이기 때문에, 정 맥 또는 구두 관리를 통해 두뇌에 혈액에서 배달 매우 어렵습니다 혈액-뇌 장벽 (BBB)의 임피던스 때문.

최근 몇 년 동안, intranasal 행정 BBB^1,2,3,,45를 방지 하는 치료제의 코-투-두뇌 배달에 대 한 잠재적인 경로 수를 보고 되었습니다. 그러나, 코-투-두뇌 통로 배달⁶의 정량 분석에 대 한 상대적으로 몇 가지 보고서 되었습니다. 또한, 거의 아무 보고 되어 설립된 최적 관리 조건 및 투약 식이요법, 볼륨, 같은 시간, 기간, 및 속도, 코-투-두뇌 배달의 수사를 위해. 다음과 같은 이유 때문에 상기 결함을 관찰 수: 마우스 intranasal 관리의 최적의 방법 (i)는 아직 설정할 수, 그리고 (ii) intranasal 관리 pipetting, 일반적으로 사용 되는 일반적으로 특징 이다 mucociliary 클리어런스 (MC)으로 인해 동물 중 interindividual 변화에 의해 그로 인하여 종종 특정 약물의 실제 코-투-두뇌 배달 잠재력의 underestimations로 이어지는.

흡입 마 취 isoflurane를 사용 하 여 (개시: 4%, 유지 보수: 2%)는 흡입과 설치류에 대 한 마스크는 감소 시키기의 목표와 함께 광범위 한 사용, 또는 실험 동물에서 수행 수술과 관련 된 통증을 제거. 마스크의 사용은 피하, 복, 그리고 정 맥 경로 통해 흡입 마 취 실험 동물에 일반적인 약물 관리를 수행 하는 비교적 간단 합니다. 그러나, intranasal 관리의 경우 마스크를 약국에 대 한 동물에서 일시적으로 제거 될 필요가 있다. 유지 보수 2% 미만 isoflurane, 동물 일반적으로 자각 빠르게 흡입 마 취에서. 복용량 당 관리 볼륨이 큰 경우,이 식도, 코 구멍에서 흘러 마약 솔루션을 발생할 수 있습니다. 그리고 따라서 하나의 큰 복용량 작은 intranasal 행정에 대 한 여러 개의 더 작은 복용량으로 세분화 될 필요가 있습니다. 동물입니다. Intranasal 행정 반복 관리용 마스크 제거 및 지속적인된 비 강 납품을 위한 충분 한 시간을 필요로, 생쥐 관리 절차 동안 마 취에서 각 성 것 이다 높은 확률이입니다. 이 매우 어려운 안정적인 마 취 상태, intranasal 행정을 수행 하 게 하 고 아마 설치류 중 코-투-두뇌 배달의 관찰 된 interindividual 변화에 기여.

이 연구에서 우리는 따라서 실험 동물에 최소한의 물리적 스트레스를 부과 흡입 마 취, 안정적인 intranasal 관리의 두 가지 새로운 방법 개발. 첫 번째 방법은 흡입 마 취 동안 intranasal 행정을 가능 하 게 일시적으로 열 수 있는 마스크를 사용 했습니다. 마스크의 열 수 있는 부분을 피 펫을 사용 하 여 안정적인 intranasal 행정을 촉진 하기 위하여 관리 타이밍에 따라 사용할 수 있는 실리콘 플러그를 포함 합니다. 두 번째 방법으로 비 강, 식도에서 전달 하는 정 삽입 수술 그리고 약물 솔루션 전달 될 수 있는 직접 하 고 확실 하 게 안정적인 흡입에서 비 강에는 주사기 펌프는 다음이 연결 된 마 취입니다. 실질적으로 MC의 영향을 최소화 하 여 비 강에 있는 retentively 약 향상 될 때문에이 방법은 코-투-두뇌 루트를 통해 두뇌에 약의 납품을 강화할 수 있습니다. 또한, 양적 라디오 표시 [¹⁴C]를 사용 하 여 뇌에서 마약 유통 수준 주입된 복용량/g 뇌에 대 한 (%)을 평가 하는 방법 설명-눌린 [분자량 (MW): 5000] 수용의 모델 기판으로 고분자입니다.

프로토콜

이 동물 연구 (#AP17P004)는 니혼 대학 동물 관리 및 사용 위원회 (도쿄, 일본)에 의해 승인 지침에 따라 수행 되었다. 이 연구 (#17-0001) 약 학 학교, 일본 대학의 방사성 동위 원소 센터에 의해 승인 되었다.

1. 흡입 마 취 Intranasal 관리에 사용 되는 동물

1. 제어 온도 23 ± 1 ° C, 습도 50% ± 10%, 그리고 음식과 물에 대 한 광고 libitum 액세스의 유지와 스테인리스 스틸 케이지 12 h 명암 주기 (오전 8시-오후 8시 빛), 아래에서 실험 쥐를 집.
2. 실험, 이전 2 %isoflurane, 다음 개시 4%의 농도에서 흡입을 통해 마우스를 anesthetize. 표면 righting의 실종에 대 한 확인 하 여 anesthetization의 필요한 수준을 확인 합니다.

2입니다. 관리 솔루션의 준비

1. [¹⁴C]의 관리 솔루션 준비-눌린 (50 μ M, 마우스 당 0.5 μCi/mL) 인산 염 버퍼 식 염 수에 희석 하 여 사용 될 때까지 4 ° C에서 저장.

3. 마우스 intranasal 행정

1. 일시적으로 열 수 있는 흡입 마스크를 사용 하 여 micropipette 메서드 (그림 1)
   참고:이 기술은 이다 Frey 그 외 여러분 에 의해 설립 micropipette를 사용 하 여 intranasal 관리 프로토콜의 수정 ³
   1. 흡입 마 취 2 %isoflurane (그림 1A)와 그들의 사지를 찍고 여는 코르크에서 부정사의 위치에서 마우스를 해결.
   2. 30 s 간격으로, 1-2 μ 복용량 쥐는 흡입 마 취 (그림 1B 및 C) 아래에 고정 하는 동안 또는 왼쪽 및 오른쪽 콧구멍으로 관리를 통해 각 마우스 25 μ 관리 솔루션의 전체 볼륨을 관리 합니다.
   3. 참고: 폐기물 마스크 열 때와 수동 방법 (폐기물 마 취 가스 용기)으로 마 취 가스 (연기 후드, 하드 ducted biosafety 내각, 진공, 등) 활성화 방법으로 청소를 닫을 때
2. Cannulation 역 m 는 식도 통해 기도 측면에서 ethod (그림 2)
   참고:이 기술은 이다 쥐 히 라이 외 에 의해 설립에 대 한 intranasal 흡수 프로토콜의 수정 ⁷
   1. 흡입 마 취와 isoflurane 2% 그들의 사지를 찍고 여는 코르크에서 부정사의 위치에서 마우스를 해결.
   2. 목에서 머리 면도 하 고 뒤에 알코올 린스 betadine 또는 액체 응용 프로그램을 통해 준비.
   3. 가 위는 작은 절 개 (1.5 cm) 후 집게로 목 구멍 아래 피부를 확장 하 여 기도 식도 노출 합니다.
   4. 가 위를 사용 하 여 기도에 절 개 (1 m m)를 확인 합니다.
   5. 캐 뉼 러를 삽입 (내부 직경: 0.58 m m, 외부 직경: 0.965 m m) 1.2 c m의 길이에 흡입 마스크의 내부에는 정 맥의 반대쪽 끝을 연결 하는 고.
   6. 가 위를 사용 하 여 식도 있는 절 개 (1mm), 한 캐 뉼 러를 삽입 (내부 직경: 0.28 m m, 외부 직경: 0.61 m m), 코 구멍의 후부 부분을 향해 1.4 c m의 길이에 그것 (그림 2A , B)을 선 고.
      참고: 프로시저 3.2.2 3.2.4 × 10 배율에서 입체 현미경 실행 되었다.
   7. 관리 솔루션으로 채워진 1 mL 주사기를 바늘 (27G × 1/2)를 첨부 하 고 프로그래밍 가능한 마이크로 주사기 펌프에 연결.
   8. 3.2.5 (그림 2C)에서 식도에 삽입 했다 정 맥에 바늘 위에 연결 합니다.
   9. 25 μ [¹⁴C]의 총 볼륨 관리-일정 한 속도로 (5 μ/분) 눌린 솔루션 (그림 2C 및 2D).

4. 양적 실험 라디오 표시 된 수용 성 고분자를 사용 하 여 ([¹⁴C]-눌린)

1. 마 취 실험 쥐 목을 벨을 위를 사용 하 여 그들의 두개 그리고 수 질 oblongata의 측면에서 두뇌를 손상 하지 않도록 주의 복용 하는 동안.
2. 신중 하 게 떠 서 두개골에서 마이크로 주걱을 사용 하 여 전체 뇌를 추출 합니다.
3. 장소 필터 종이 얼음에 저장 된 배양 접시에 염 분 해결책으로 습.
4. 추출 된 두뇌 moistened 필터 종이에 놓습니다.
5. 혈액 두뇌의 표면에 고착 해 서 적어도 [¹⁴C]의 영향을 제거 하기 위해 생리 식 염 수를 적신 면봉으로 닦아-두뇌의 표면에 혈액에 눌린.
6. 빠르게, 두뇌를 해 부 및 세 부분으로 나눌: 후 각 전구, 뇌, 그리고 수 질 oblongata (는 폰 포함).
7. 1 시간에 50 ° C에서 조직 solubilizer에 뇌 샘플을 배치 합니다.
8. 액체 섬광 칵테일의 10 μ 뇌 샘플에 추가 합니다.
9. 섬광 결정 적용된 솔루션의 방사능 섬광 유리병에 칵테일에 녹아 관리 솔루션의 25 μ 약 수를 전송 합니다.
10. 측정 하는 뇌 샘플에서 [¹⁴C]의 분 방사능 당 번 ([¹⁴C] X_뇌) 및 적용된 솔루션 ([¹⁴C]_{에 복용량}X) 액체 섬광 카운터는 적절 한 장착에 ³H, ¹⁴c.에 대 한 크로스 오버 보정

5. 데이터 분석

1. 마약 배포 수준 (%) 주입된 복용량 (ID %)에 대 한 다음 수식을 사용 하 여 계산 합니다.
   ID % ⁄g 뇌 = ([¹⁴C] X_뇌/ [¹⁴C]_복용량에X) × 100
   X_뇌 (뇌 dpm/g)가 [¹⁴C] 금액-눌린 뇌 조직에서 측정 및 X_복용량 (dpm/25 μ 솔루션)은 [¹⁴C]의 농도-눌린 intranasal 관리에 사용 하는 솔루션에서.

결과

그림 3 은 [¹⁴C]-눌린 수준에 후 각 전구 (A), 뇌 (B), (C) 두 가지 유형의 intranasal 행정 현재 연구에서 평가 사용 하 여 얻은 수 질 oblongata (ID % ⁄g 두뇌). 피 펫 사용 방법 배달 [¹⁴C]를 사용 하 여 intranasal 관리-openable 흡입 마스크 (그림 1)를 사용 하 여 두뇌에 눌린. 흡입 마 취, 양적 결과 낮은 표준 오류에 의해 표시 된 시험된 동물 중에서 아무 실험 interindividual 변화를 밝혔다. -흡입 마 취 (그림 2), [¹⁴C]의 상당히 높은 수준의 눌린-눌린 후 각 전구 (에서 관찰 했다 식도 역 정 비 강 관리 방법 [¹⁴C]을 관리 하는 데 사...

토론

약물의 코-투-두뇌 전달이이 통로 BBB를 무시 하는 직접 운송 경로 나타내므로 중앙 신 경계 장애에 뚜렷한 영향을 미칠 전망 이다. 3 개의 다른 코-투-두뇌 통로 날짜⁸보고 되었습니다. 첫 번째는 비 강 점 막에 있는 후 각 점 막에서 개는 후 각 신경을 통해 전달 하는 후 각 신경 통로. 두 번째는 삼차 신경을 통해는 hindbrain에 brainstem에 비 강 점 막의 호흡기 점 막에서 전달 trigeminal 신경 통로. 세 번째는 CSF 통로, CSF 통해 뇌에 걸쳐 배포 됩니다. 코-투-두뇌 통로 BBB에 의해 그리고 중앙 신경^8, 를 biomedicines에 전달 하는 수단으로 장애가 될 경향이 있는 친수성 고분자의 관리에 관하여 상당한 주목을 받고 있다 ^{9 , 10 ,}

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
ddY 마우스	재팬 SLC, Inc.		남성, 4-6주, 20-30g
이소플루란	화이자	v002139
이소플루란 설치	SHINANO manufacturing CO. LTD.	SN-487-OTAir, SN-489-4
이소플루란 마스크	SHINANO manufacturing CO. LTD.		소형 설치류용
이소플루란 마스크(오픈 타입)	SHINANO manufacturing CO., LTD.		특별 주문
마취 상자	SHINANO 제조 CO., LTD.	SN-487-85-02
동물 실험 가위 - 1	NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD.	B-27H
동물 실험 가위 - 2	NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD.	B-13H
핀셋 - 1	파인 사이언스 도구 Inc.	11272-30	듀몽 #7 Dumoxel
Tweezers-2	나츠메 제작쇼 주식회사	A-12-1
캐뉼라 튜브 (PE-50)	Becton, Dickinson and Company.	5069773	내경: 0.58mm, 외경: 0.965mm
캐뉼러 튜브(SP-10)	NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD.	KN-392	I.D.: 0.28 mm, O.D.: 0.61 mm
면도기	MARUKAN, LTD.	DC-381
입체 현미경	올림푸스 주식회사	SZ61
바늘 27G 1/2 in 13mm	TERUMO CORPORATION	NN-2738R
1mL 주사기	TERUMO CORPORATION	SS-01T
사기 펌프	신경 과학	NE-1000
셀룰로오스 멤브레인	Toyo Roshi Kaisya, Ltd.
마이크로 주걱	시미즈 아키라 Inc.	91-0088
마이크로피펫 (0.5-10 uL)	Eppendorf AG	Z368083
피펫 칩	Eppendorf AG	0030 000.811
테이프	TimeMed 라벨링 시스템, Inc.	T-534-R	마우스 고정용
[14C]-Inulin	American Radiolabeled Chemicals Inc.	ARC0124A	0.1 mCi/mL
EtOH	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	054-00461
액체 섬광 카운터	Perkin Elmer Life and Analytical Sciences, Inc	Tri-Carb 4810TR