방법 논문

레이블 무료 이미징의 단일 단백질 분 비 iSCAT 현미경 검사 법을 통해 살아있는 세포에서

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DOI:

10.3791/58486

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2018년 11월 20일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Max Planck Institute for the Science of Light (MPL), 2Area of Scientific Learning, Milligan College, 3Department of Physics, Friedrich Alexander University Erlangen-Nuremberg, 4Department of Internal Medicine 5, Hematology and Oncology, Friedrich Alexander University Erlangen-Nuremberg (FAU), University Hospital Erlangen

이 논문에서

요약

선물이 단일 레이블이 없는 단백질의 실시간 광학 탐지에 대 한 프로토콜으로 그들은 살아있는 세포에서 분 비 됩니다. 이 간섭 산란 (iSCAT) 현미경 검사 법, 다양 한 다른 생물 학적 시스템 및 구성에 적용 될 수 있는 기반으로 합니다.

초록

간섭 산란 (iSCAT) 현미경 검사 법, 실시간으로 개별 살아있는 세포에서 분 비 하는 단일 레이블 없는 단백질을 검출 하는 방법 설명 합니다. 이 프로토콜에서 우리는 기본적인 단계를 iSCAT 현미경을 실현 하 고 추가적인 이미징 채널 모니터링 연구에서 세포의 생존 능력을 보완을 커버. 이것 다음, 사용 방법을 단일 단백질의 실시간 탐지에 대 한 그들은 우리는 불멸 하 게 B-세포 선 (Laz388)으로 설명 하는 살아있는 세포에서 분 비 합니다. 현미경 및 샘플의 준비 뿐만 아니라 기록 된 데이터의 분석에 관한 필요한 단계는 설명 합니다. 비디오 프로토콜 그 iSCAT 현미경 검사 법은 단일 분자 수준에서 분 비 공부를 간단한 방법을 제공 하는 방법을 보여 줍니다.

서론

분 비 단백질은 다양 한 생리 적 프로세스1에 중요 한 역할을 한다. 이 때문에, 그들은 정기적으로 집단 앙상블 (proteomics) 또는 개별 엔터티2,3공부는. Proteomics는 전통적으로 예를 들어, 효소 연결 된 immunosorbent 분석 실험 (ELISA), cytometry, 또는 질량 분석4,5, 특정 생물 학적 시스템에 존재 하는 단백질의 전체 집합을 조사 6. 단일 단백질, 다른 한편으로, 일반적으로 감지 다양 한 형광7,8, 염료9,10또는 저온 전자11 을 기반으로 하는 기법을 사용 하 여 microscopies입니다. 이러한 모든 기술 복잡 한 악기, 라벨, 또는 둘 다 사용 하 고 부족 한 역학 정보로만 연구 시스템에 대 한 장기적인 정보 제공.

여기 iSCAT12,13 현미경 감각 개별 분 비 단백질을 사용 하 여 초 시간적 해상도14. 중요 한 것은, 기술은 모든 단백질12,14본질적인 약한 흩어져 신호를 감지합니다. 작은 bioparticle 없앤다는 빛 양을 그것의 polarizability와 함께 확장 됩니다. 가정 하는 단백질의 형태를 다른 한 효과적인 분산 영역14,15,16, 그리고 그에 의해 접근 수 있습니다. 단백질 매우 비슷한 굴절율, 측정된 된 신호는 직접 수 단백질의 분자량 (MW)에 연결합니다. ISCAT 대비 대 분자량의 측정 기준에 의해 경험적 교정 다양 한 크기의 단백질을 구별할 수 있습니다. iSCAT 실험 쉽게 관심14 의 어떤 단백질의 특정 검색에 대 한 있도록 형광 또는 비 산 레이블 뿐만 아니라 형광 현미경 검사 법17,18, immunosorbent 시 약, 보충 될 수 있다 , 17 , 19.

원칙적으로, iSCAT 보조 참조 파와 간섭 혼합을 통해 단백질의 약한 흩어져 빛을 증폭 하 여 작동 합니다. 검색 된 강도 (figure-introduction-1)는 iSCAT에서 현미경에 의해 설명

figure-introduction-2

어디 figure-introduction-3 사건 강도 figure-introduction-4 참조 웨이브의 기여에 대 한 계수는 figure-introduction-5 연구, 나노-개체의 산란 강도 의미와 figure-introduction-6 는 흩어져 사이 상전이 고 참조 파도14. 두 전송 또는 다시 반영 사건 빛 일반적으로 각각의 경우에 기준 파로 사용 figure-introduction-7 투과율 또는 반사율 샘플 챔버의 각각 차지. 기간 figure-introduction-8 단백질의 비 산 크로스 섹션에 비례 하 고 크로스 기간에 비해 무시 될 수 있습니다. 따라서, 설정 figure-introduction-9 완전 한 파괴 간섭에 대 한 감지 된 빛에 의해 주어진 다 figure-introduction-10 어디 figure-introduction-11 참조 강도 및 figure-introduction-12 간섭 강도.

iSCAT 현미경 단일 분자 수준에 생물학 과정을 공부 하는 우수한 방법을 제공 합니다. 예를 들어, 우리는 Laz388 세포를 조사-엡 스타인-바 바이러스 (EBV) 변형 B 림프 구 세포 선20,21 -로 그들은 IgG 항 체16같은 단백질을 분 비. 그러나, 메서드는 일반 이며 다양 한 다른 생물 학적 시스템에 적용할 수 있습니다. iSCAT은 기본적으로 특정 어떤 단백질을 검출할 수 있다 또는 나노 또는 특정 또는 다중화 검출에 대 한 일반적인 표면 기능화 방법으로 확장할 수 있습니다. 그것의 간명 및 형광 현미경 검사 법, 같은 다른 광학 기술로 결합 될 수 확인 iSCAT 유용한 무료 도구 세포 생물학.

프로토콜

주의: 어떤 화학 물질을 사용 하기 전에 모든 관련 물질 안전 데이터 시트 (MSDS)를 읽어 보시기 바랍니다, 모든 적절 한 안전 관행을 관찰 하 고 필요에 따라 개인 보호 장비 (레이저 안전 고글, 눈 보호, 장갑, 실험실 코트)를 착용.

1. 건물 현미경16,18 iSCAT

참고: iSCAT 현미경은 일반적으로 수정 된 거꾸로 한 현미경 설치의 구성 됩니다. 간단히, 레이저는 높은 수 가늠 구멍 (NA) 목표의 후 초점면에 초점을 맞추고와 이미징 렌즈 카메라 칩에 입자의 다시 흩어져 빛을 집중 하는 데 사용 됩니다. 일반적으로, 넓은 필드 현미경이 처음부터 건설 수 있습니다 또는 기존 거꾸로 현미경 기반. 이 프로토콜에 사용 되는 하드웨어 변경이 가능한 하는 동안 설치, 실현 하기 위해 필수적인 단계를 다루고 있습니다. ISCAT 현미경의 어셈블리에 대 한 더 자세한 설명은 아로요 외 의 작품에서 찾을 수 있습니다. 18.

주의: iSCAT 현미경 클래스 IIIB 클래스 4 레이저 광원을 포함 한다. 적절 한 눈 보호 조립 하 고 현미경 광학 정렬 때 필요 하다. 현미경을 조립 하는 동안 레이저 빔 경로 스트레이트 남아 추가 되는 새로운 광학 구성 요소를 반사 하지는 있는지 확인 합니다.

  1. 현미경의 조명 경로를 설정 합니다.
    1. 현미경 샘플 단계18 높은 수 가늠 구멍 (NA) 목표를 통합 구축 감쇠 광학 테이블과 엄밀한 금속 블록을 사용 하 여 (100 X 1.46 / 없음) 및 초점의 변화 뿐 아니라 측면 샘플 번역을 허용 하는 번역 단위 목표에 대 한 위치입니다.
      참고: 단일 단백질 검출 한계에 iSCAT 현미경의 작업은 외부 진동에 매우 취약 합니다. 모든 면에서 샘플을 지 원하는 centrosymmetric 압 전 단계 그렇지 않으면 초점 및 측면 안정성을 손상 할 것입니다 샘플의 음향 업무가 제한 하는 것이 좋습니다. 그림 1 압 전 번역 단위 및 목표를 포함 하 여 적합 한 샘플 단계를 보여 줍니다. 또한, 다음 단계에서 설명 하는 모든 광학 구성 요소에 대 한 대규모 및 안정적인 마운트 사용 됩니다 것이 좋습니다. 이러한 구성 요소 상용 광학 공급 업체에서 쉽게 사용할 수 있습니다.
    2. 50 cm 초점 거리 내의 렌즈 (렌즈 넓은 필드)와 45 ° (수직) 파장 445 nm는 목표의 후 초점면에 다이오드 레이저의 빛을 초점 거울 커플링을 사용 합니다. 이 조명을된 빔 목표의 앞으로 초점에 만들고 iSCAT 조명 소스 될 것입니다. 필요한 경우, 공간 30 µ m 작은 구멍 또는 단일 모드 광섬유를 통해 50 cm 렌즈 이전 레이저를 필터링 합니다.
    3. 목표를 침수 오일의 방울을 적용 하 고 유리 coverslip 현미경 무대의 샘플 평면에 배치. 이 영상 목표를 통해 다시 반영 하는 빔 발생 합니다.
      참고: 반사 샘플 coverslip의 상부 표면에서 공기 유리 인터페이스에서 발생 하 고 iSCAT 참조 빔에 대 한 기준으로 될 것입니다. 잔여 먼지 또는 먼지는 coverslip의 표면에 산란 포인트 소스 다음 단계에서 이미징 목표의 정확한 초점에 원조를 증가 줄 것 이다.
      주의: 레이저 빛의 대다수는 coverslip 통해 전송 하며 똑바로 목표에서. 불투명 한 반사 기관총을 배치 (예., 종이 카드) 레이저 빛에서 상해의 위험을 최소화 하는 coverslip 위에.

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그림 1: iSCAT 샘플 단. 사진은에 압 전 번역 단위 (블랙) 중심으로 100 뿐만 아니라 마운트되어 대규모 알루미늄 블록 목표 x. 3 축 압 전 단계는 목표의 초점면에 샘플의 정확한 위치에 대 한 수 있습니다. 조 악한 초점 (묘사 되지) 목적은 탑재 스레드 튜브를 회전 하 여 실시 됩니다. 블록은 45 ° 커플링 거울 위에 4 개의 강철 받침대는 광학 테이블에 배치 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

  1. 현미경의 이미지 경로를 설정 합니다.
    1. 반사 방지 (AR) 소개-넓은 필드 렌즈 후 입사 빔, 그리고 대략 10 cm를 기준으로 45 ° 각도로 빔 스플리터 (70% 반영, 30% 전송) 코팅. 포인트 레이저 소스 쪽으로 아칸소 코팅입니다. 이 입사 빔 전송 참조를 반영 하 고 빔 입사 빔에 90 ° 각도로 흩어져.
      참고: 아칸소 코팅 및 근육 빔 스플리터는 권장 상당한 고스팅 및 프린지 효과 빔 분할 큐브, 또는 코팅된 평면 빔 스플리터를 사용 하는 경우 발생할 수 있습니다. 자세한 내용은 토론 을 참조 하십시오. 원하는 경우, 모든 원치 않는 반사 빔 빔 스플리터의 뒷면에서 발생 하는 홍 채 격 막의 사용에 의해 차단 수 있습니다.
    2. 두꺼운 빔 스플리터 레이저를 똑바로 더 이상 목적을 입력할 수 있도록 중요 한 빔 변위를 소개 합니다. 필요한 경우 레이저 빔 경로 목표를 통해 올바른 전파 되도록 빔 스플리터 전에 재개.
      참고: 빔 스플리터 넓은 필드 렌즈 전에 추가할 수 있습니다 또한 고 현미경 단계 배치 됩니다 (에서 단계 1.1.2.), 빔 나중 전치 하지 것입니다.
    3. 이 시점에서,는 간섭계의 이미징 팔을 집중 하 고 샘플 비행기와 카메라 parfocal 되는지 확인 하십시오. 장소는 오목 f = 5cm 위치에서-45 cm 렌즈 넓은 필드 렌즈 사고 빔 경로에 후. 이 목표의 다시 조리개를 입력 조명을된 빔 발생 합니다.
    4. 화면 반사는 간섭계 팔에 배치, 조 악한 초점 위치를 찾을 수 수직 방향으로 목표를 이동 합니다. 목표는 화면을 타격 하는 빔 조명을 때 초점에서입니다.
      참고: 그림 2 는이 과정의 회로도 보여준다.
    5. 모두 f 제거 완료 되 면 조 악한 초점-45 cm 렌즈와 화면을 =.
      참고: 부정적인 초점 거리 렌즈를 사용 하 여, 대신 넓은 필드 렌즈 자체 수 있습니다 이동식 마운트에 배치 되며,이 단계를 위한 빔 경로에서 이동. 그러나, 가장 안정적인 현미경 구성 달성 하기 위해, 그것 것이 좋습니다 고정된 위치에 넓은 필드 렌즈를.
    6. 두 번째 f 추가 = 50cm 내의 렌즈 흩어져 빛을 집중 하 고 CMOS 카메라의 센서에 반사 된 빛을 당기기. 렌즈 다시 참조 빔 당기기 위하여 흩어져 빛을 초점 목표의 후 초점면에서 50cm 배치 됩니다 확인 하십시오.
    7. 장소는 CMOS 칩 f에서 50 cm = 50 cm 렌즈 및 직접 칩의 중간에 광속.
      참고: 다음 매개 변수는 일반적으로 영상에 대 한 사용 됩니다. 레이저 (파장 445 nm)의 출력을 100으로 설정 됩니다 mW. 작은 구멍 및 빔 스플리터 전송된 빛 감소 목표 입력 효과적인 파워는 약 9 mW. 샘플 위치에 빔 직경 6 µ m에 도달 한다. 사용 된 이미징 렌즈 시스템의 효과적인 확대 약 300 x입니다. CMOS 칩에 있는 이미지의 크기는 128 × 128 픽셀 약 5 × 5 µ m2의 시야에 따른 조명된 영역 내에서 설정 됩니다. 그림 3 은 완벽 하 게 조립된 iSCAT 현미경의 회로도 보여준다.

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그림 2: iSCAT 현미경의 조 악한 초점. 회로도에 초점 시스템을가지고 있도록 광학의 배치를 보여 줍니다. AR 코팅의 뒷면 빔 스플리터 (70/30 학사) 빨간색으로 표시 됩니다. 중요 한 거리는 녹색에 제공 됩니다. 사용 렌즈의 초점 길이 (f) 표시 됩니다. 파란색 점선된 상자에 구성 요소 단계 1.2.6-1.2.7 추가 되었습니다. (다시 수렴 iSCAT 빔 당기기를 사용 하는) 오목 렌즈와 화면 나중에 제거 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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그림 3: iSCAT 현미경. 회로도 완전히 조립된 iSCAT 현미경을 보여 줍니다. AR 코팅의 뒷면 빔 스플리터 (70/30 학사) 빨간색으로 표시 됩니다. 중요 한 거리는 녹색에 제공 됩니다. 사용 렌즈의 초점 길이 (f) 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

  1. 추가 영상 채널을 설정 합니다.
    참고:이 섹션의 iSCAT 레이저 형광 현미경을 통해 세포 생존 능력을 모니터링 하 고 밝은 분야 현미경 검사 법을 통해 주변 넓은 지역 관측을 허용 하는 현미경을 다른 이미지 경로 추가 합니다.
    1. 부부는 LED 광원의 출력 (약 500 nm < λ < 580 nm) 긴으로 거리 20 X / 0.4 나 목표, 노력 하 고 측면에 LED 출력의 위치와 초점을 허용 하는 샘플 챔버 위에 기계적 구성 요소를 설치를 샘플입니다.
      1. LED의 스펙트럼 세포 죽음 마커 (propidium 요오드 화물 (PI))의 구동 범위를 커버 하 고 그것의 형광 (λ > 600 nm)을 방해 하지 않는 출력을 확인 합니다. 광학 필터를 사용 하 여 필요한 경우.
    2. 위 (와이드-필드)와 더 낮은 (iSCAT) 목표는 동일 선상 되도록 위 목표를 옆으로 이동 합니다. 이것은 더 낮은 목표 아래 화면을 배치 하 고 화면에 전송 된 LED 빛의 강도 극대화 하 여 결정 됩니다. 장소는 λ = 550 nm 짧은 패스 dichroic 거울 (SPDM) 전송된 LED iSCAT 레이저 경로에서 빛을 분할.
    3. 이 빔 8 %reflective/92% 투과 빔 스플리터 (BS)와 두 개의 채널로 분할. 92% 경로 형광 채널 이며 8% 경로 밝은 필드 이미징에 사용 됩니다.
    4. F를 사용 하 여 CMOS 카메라에 밝은 필드 채널 이미지 = 5 cm 무색 남자 용 상의 렌즈.
    5. 이미지는 f를 사용 하 여 별도 CMOS 카메라에 형광 채널 5 c m 무색 남자 용 상의 렌즈와는 λ = = 여기 빛을 차단 하려면 600 nm 긴 통과 필터. 그림 4a 모든 이미징 채널을 포함 하 여 완벽 하 게 조립된 현미경의 회로도 보여준다.

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그림 4: 단일 세포에서 분 비 하는 단백질의 iSCAT 현미경 검사 법. (a) 프로토콜에서 설명 하는 현미경의 도식. 자세한 내용은 섹션 1을 참조. 약어: LED, 발광 다이오드; SPF, 짧은 패스 필터; obj, 목표; SPDM, 짧은 패스 dichroic 거울; BS, 빔 스플리터; LPF, 긴 패스 필터; BF, 밝은-필드; 형 석, 형광; C1-C3, 카메라 1-3 (b) 밝은 필드 이미지는 단일의 Laz388 iSCAT 보기 (흰색 사각형으로 표시)에서 약 4 µ m 세포. C3, 카메라로 찍은 이미지 스케일 바: 10 µ m. (c) 형광 이미지는 셀의 위치와 (b)에 표시 된 동일한 영역의 흰색 원으로 표시. 형광의 부재는 휴대 가능한 임을 나타냅니다. C2, 카메라로 찍은 이미지 스케일 바: 10 µ m. (d) 원시 iSCAT 카메라 이미지 스냅샷 80 µs 노출 시간. C1 카메라로 찍은 이미지. (e) iSCAT 이미지 spatiotemporal 배경 빼기 토론 섹션에 설명 된 대로 후 같은 지역입니다. 이미지는 프레임에 걸쳐 1000 순차 원시 (d) 최종 프레임 시간 400 ms의 통합 했다 고 밝혀 유리 coverslip의 표면 거칠기. (f) 해당 차동 iSCAT 이미지는 coverslip에 2 단백질의 바인딩 이벤트를 보여 줍니다. 이미지는 두 개의 연속 필터링 된 이미지 (e)를 빼서 건설 되었다. (D)에 바 확장 (e), 그리고 (f): 1 µ m. 이 그림에서 맥도날드, M.P. 외 적응 되었습니다. 16. 저작권 2018 미국 화학 사회. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

  1. 컴퓨터 및 소프트웨어를 설정 합니다.
    1. 모든 카메라를 컴퓨터에 연결 합니다. 해당 드라이버 패키지를 설치 하 고 그들의 통제를 위한 소프트웨어 얻기/쓰기.
      참고: 적합 한 하드웨어는 고속 인수에 필요한. 최소한, 멀티 코어 프로세서, 16GB의 RAM, 프레임 그래버 카드와 데이터 저장을 위한 고체 디스크 것이 좋습니다.
    2. CMOS 카메라에 iSCAT 이미지를 관찰 하 고 그것이 초점에서 유리 coverslip에 잔여 먼지 또는 먼지 입자를 찾는 하 여 확인 합니다. 입자의 이미지는 원형 대칭 지점 확산 기능 (PSF) 인지 확인 합니다.
      참고: 비 원형 대칭 PSF에 대 한 주요 이유는 바로 하지만 광 축에 대해 작은 각도에서 레이저 빔을 목표를 입력 하지 않습니다. 이것은 각도 45 ° 커플링 미러 입사 광선의 위치를 조정 하 여 수정 되었습니다.
    3. 밝은 분야 및 형광 채널의 카메라 이미지를 비교 합니다. 둘 다 초점에와 같은 영역을 표시 확인 하십시오. ISCAT 레이저의 위치는 이미지의 중심에서 약 인지 확인 하 고 나중에 참조할 수에 대 한 위치로의 숙지 합니다. 일반적인 카메라 이미지 그림 4b-4 층을 참조 하십시오.
      참고: 셀 샘플 또는 형광 구슬 두 채널의 초점을 찾는 데 사용 합니다. 일시적으로 시스템을 조정 하려면 형광 롱 패스 필터를 제거 합니다. 셀의 기존 이미징에 대 한 초점은 iSCAT 초점면 보다 약간 높이 필요가 있다. 목표를 이동 하지 않고이 대 한 보상, 2 개의 각각 f의 초점에 그들의 위치에서 카메라를 치환 = 5 cm 렌즈.
    4. 필요한 카메라 매개 변수를 설정 합니다. 고정된 프레임 속도 사용 하 고 소프트웨어 이득 및 수정 도구를 사용 하지 않도록.
      참고: 다음 매개 변수는 사용: iSCAT 카메라 80 µs의 노출 시간 5000 초당 프레임 (fps)로 설정 됩니다. 위에서 설명 했 듯이, 이미지 크기는 128 × 128 픽셀입니다. 밝은 분야와 형광 둘 다 카메라는 풀 프레임 크기 (1280 × 1024 픽셀)에서 작동합니다. 브라이트 필드 이미징 20 ms 노출 시간으로 수행 됩니다. 형광 카메라 750 ms 노출 시간으로 설정 되 고 5 연속 프레임 한 최종 이미지 누적 됩니다. 브라이트 필드 및 형광 이미지는 고정 20 s 시간 간격 획득 됩니다.

2입니다. 실험의 준비

  1. 준비 재고 현미경 매체입니다.
    1. HEPES 버퍼 솔루션의 25 mL를 추가 (1 mol/L) 25 mmol/L HEPES 솔루션의 최종 1 L를 RPMI 1640 매체의 975 ml. 또는 버퍼 매체를 사용 하 여 이미 포함 HEPES와.
      참고: HEPES는 주변 조건 (예를 들어, 인큐베이터 외부와 지속적인 공동2 공급 없이)에서 측정 하는 동안 매체의 pH 값을 유지 하는 데 사용 됩니다.
    2. 실험에 필요한 솔루션의 약 수를 받아 고 실 온까지 따뜻하게 하자. 중간의 2 개 mL는 충분 합니다. 4 ° c.에 남은 재고 솔루션을 유지
  2. 현미경 베트를 준비 합니다.
    참고: 다음 단계는 알루미늄 베이스 플레이트와 아크릴 멧 요리 하는 coverslip 수정 고 압 전 3D 포지 셔 너 커플 구성 된 사용자 샘플 홀더를 위한 절차를 설명 합니다. 유리 바닥으로 상업적으로 사용 가능한 무 균 문화 요리 또한 사용할 수 있습니다.
    참고: 그림 5 에서는 사용자 샘플 홀더의 사진.
    1. 새로운 현미경 coverslip 고 이온된 수 (디-물)과 에탄올으로 그것을 씻어. 공기 건조 질소 또는 가압된 공기 슬라이드.
    2. 500 W RF 전력에서 10 분 동안 산소 플라즈마 분위기 (0.3 mbar 가스 압력)에 coverslip 청소. 이 표면에서 모든 유기 불순물을 제거합니다.
    3. 0.2 mol/L NaOH 솔루션 디 물으로 약 10 분 린스에에서 그것을 immersing 하 여 아크릴 베트 접시를 청소 하십시오.
    4. 샘플 홀더를 조립 하 고 플라스틱 페 트리 접시 실험에 필요한 때까지 그것을 커버.

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그림 5: 사용자 샘플 홀더. (a) 샘플 홀더 구성 요소: (1) 아크릴 베트 접시; (2) 알루미늄 베이스 플레이트; (3) 지주 나사; (4) 실리콘 o-링; (5) coverslip입니다. (b) 완전히 샘플 홀더를 조립. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

  1. 현미경을 준비 합니다.
    1. ISCAT 조명 레이저, 밝은-필드/형광 조명 LED, 카메라, 및 수집 컴퓨터/소프트웨어 설정. 목적은 전에 위치에 레이저 광선을 차단 합니다.
    2. 100 X 확인 / 1.46 나 목적은 깨끗 한. 그렇지 않으면, 렌즈 청소 잎사귀와 에탄올을 사용 하 여 제조 업체의 지침에 따라 목표를 청소.
    3. 현미경 목표에 집중 오일 한 방울을 적용 합니다.
    4. (섹션 2.2에에서 조립) 샘플 홀더를 신중 하 게 그것을 마운트 iSCAT 현미경의 압 전 단계에 샘플 coverslip 현미경 목표에 중심을. 세심 하 고 그래서으로 손상 되지 않도록 주의 렌즈를 수 있습니다. 압 전 포지 셔 너 제조업체 지정 최대 토크를 초과 하면서 엄지 나사를 조이십시오.
    5. 고 멧으로 재고 현미경 매체 (섹션 2.1에서에서 준비.)의 1 mL를 추가 합니다.
    6. 세포 죽음의 표식16,22로 매체 propidium 요오드 화물 얼룩의 2 방울을 추가 합니다.
    7. 레이저를 차단 하 고 초점을 시스템을가지고. 먼저, 1.2.3 단계를 반복 하 여 목표는 coverslip에서 정확한 거리에 배치 됩니다 확인 합니다. -1.2.5. (그림 2)입니다. 다음, 압 전 무대의 z 축과 초점 미세 조정.
    8. 광원, 카메라 및 소프트웨어에 대 한 모든 설정이 올바르게 설정 되었는지 확인 합니다. 레이저 파워, LED 휘도, 카메라 프레임 속도, 카메라 노출 시간, 또는 경로 저장 하는 소프트웨어 같은 매개 변수가 포함 됩니다.
      참고: 높은 프레임 속도에서 동영상을 저장 크기가 큰 파일을 생성할 수 있습니다. 컴퓨터에 충분 한 여유 공간이 있는지 확인 합니다.
    9. 다시 레이저 광선을 차단 합니다. 현미경은 이제 실험에 대 한 준비.
  2. 셀을 준비 합니다.
    참고: Laz388 셀20 는 RPMI 1640 매체와 10% 태아 종 아리 혈 청 (FCS), 아미노산, pyruvate, 항생제 보충으로 경작 된 셀에서 37 ° C, 5% CO2 알을 품는 분할 하 고 모든 2-3 일23신선한 매체와 함께 제공 되는.
    1. 인큐베이터에서 세포 배양 플라스 크를 약 1 x 106 셀을 포함 하는 매체를 발음. 올바른 볼륨 확인 하려면 세포 배양의 농도 hemocytometer의 사용에 의해 계량.
    2. 실 온에서 RPMI 1640 매체의 10 mL와 함께 셀 솔루션을 혼합 하 고 원심 7 분 x 300g에서 샘플.
    3. 신중 하 게 추출 하 고 집중된 셀의 펠 릿 그대로 유지 하면서는 상쾌한 삭제.
    4. 2.4.2 단계를 반복 합니다. -2.4.3. 와 셀의 집중된 펠 릿.
    5. 다시 셀 (섹션 2.1에서에서 준비.) 0.5 mL 재고 현미경 중간에 중단 하 고 즉시 실험에 그들을 사용 하 여.

3입니다. iSCAT 은닉 세포의 현미경 검사 법

  1. 레이저 빔 셀 iSCAT 레이저 빛에 직접 노출 되지 않도록 차단 되어 있는지 확인 합니다.
  2. 샘플 베트에 셀을 삽입할.
    1. 샘플 베트로 셀 샘플 (에 준비 된 섹션 2.4.) 약간 오프 센터의 약 3 µ L를 주사. 부드럽게 하는 coverslip 피 펫 팁 및 셀 솔루션을 천천히 주입. coverslip에 셀 수 있습니다.
      참고: 작은 양 피 펫 팁 (10 µ L) 또는 긴, 유연한 젤 로드 팁을 사용 합니다.
    2. 단일 셀 측정 하지 iSCAT 레이저 주변 지역에 있는 여러 세포에 의해 영향을 수 있도록 셀의 밀도 500 µm² 당 약 1 셀 아래 인지 확인 합니다.
    3. 셀 수가 너무 낮게, 반복 단계 3.2.1 인 경우에. 충분 한 수 수까지.
    4. 셀의 범위 너무 조밀한 경우에, 추가 현미경 매체의 약 20 µ L의 주사를 사용 하 여 셀에 coverslip 걸쳐 분산.
  3. 압 전 위치 확인을 사용 하 여 샘플 셀 가까이 (약 10 µ m) 보기의 iSCAT 필드에 위치를 옆으로 이동 합니다. 445 nm 레이저 빛을 직접 노출 셀에 대 한 유해 될 수 있습니다 셀 보기의 iSCAT 필드를 입력 하지 않습니다 확인 합니다.
  4. 밝은 분야 및 형광 이미지를 사용 하 여 셀의 생존25를 확인 하는데.
    참고: 가능한 셀 둥근 모양 밝은 필드 이미지에 있으며 반면 세포 죽음 셀22내부 propidium 요오드 화물의 존재에서 발생 하는 강한 형광 신호에 의해 형광, 아니다.
  5. ISCAT 레이저 광선을 차단 하 고 여전히 초점에에서 coverslip 표면 인지 확인. 드리프트와 주변 환경에서 음향 결합을 최소화 하기 위해 절연 테이블을 묶습니다.
    참고: 후자는 수행 무거운 광 커튼 또는 광학 테이블을 둘러싼 아크릴 패널.
  6. ISCAT, 밝은-필드, 및 형광 카메라에서 이미지를 획득 하 여 측정을 시작 합니다. 자동화 하 고 실험의 효율을 극대화 하는 소프트웨어를 통해 프로세스를 제어 합니다. 주기적으로 세포의 생존 능력 및 시스템의 초점을 확인 합니다.
    참고: 레이저 강도, 광학 부품 및 카메라의 노출 시간 설정에 따라 iSCAT 레이저 형광 카메라와 함께 방해 수 있습니다. 이 동작을 관찰 하는 경우에 iSCAT 레이저 형광 이미지 인수 동안 일시적으로 폐쇄 하는 것이 좋습니다.

4. 데이터 분석

참고: 실험 데이터는 본질적으로 시끄러운 그리고 iSCAT 이미지는 다르다. 사고 광원, coverslip, 노이즈와 카메라의 표면 거칠기에 파면 왜곡을 포함 한 일반적인 iSCAT 측정 잡음의 여러 소스가 있습니다. 아래 섹션에서는 이러한 잡음 소스 후 처리를 통해 해결 하는 몇 가지 방법이 합니다. 또한, 설치의 측면 기계적인 불안정성 이어질 시끄러운 데이터와 토론 섹션 아래에 설명 된 대로 따라 해결 되어야 합니다. 기술된 분석 사용자 지정 MATLAB 스크립트 수행 됩니다.

  1. 높은 공간 주파수를 제외 하는 2 차원 푸리에 필터와 원시 데이터를 필터링 하 여 카메라 노이즈를 최소화 합니다. 필터의 크기 (주로 시스템의 숫자 조리개에 의해 결정 되는) 실험적인 구성에 맞게 조정 될 필요가 있다.
    참고: 광학 시스템 보다 더 높은 공간 주파수와 이미지에서 기능 (카메라 읽어 잡음)과 같은 외부 소스에서 발생 한 고 무시 될 수 있습니다.
  2. ISCAT 대비 원시 카메라 카운트에서 이미지를 변환 합니다.
    참고: 카메라에 의해 감지 신호는 figure-protocol-6 . iSCAT 대비로 정의 됩니다 figure-protocol-7 어디 figure-protocol-8 참조 빛의 강도 coverslip로 부분 반영 하는 경우에 그리고 figure-protocol-9 사이 방해는 figure-protocol-10 및 흩어져 강도 (figure-protocol-11).
    1. 으로 신호를 분리 figure-protocol-12 와 figure-protocol-13 는 관심의 입자는 존재 하는 특정 프레임의 시간 평균을 계산 하 여. 결과 이미지는 기준 신호를 제공 한다 figure-protocol-14 .
      참고: 또는, 활성 배경 빼기 단계를 수행할 수 있습니다 아래의 토론에 설명 된 대로.
    2. 에 따라 대비를 계산 figure-protocol-15 12,,1416.
  3. 그것의 후임에서 각 연속 프레임을 빼서 롤링 차동 이미지를 만듭니다.
    참고: 잔여 신호는 coverslip의 표면 거칠기에서 그리고 연속 프레임 내의 일정으로 파면 왜곡 효과적으로이 단계에서 제거 됩니다. 롤링 차동 떠나 다음 한 프레임에서 발생 하는 단백질 바인딩만이 잔여 신호를 제거 합니다. 이 동적 배경 빼기는 유익한 장기 샘플 드리프트를 구분 하지 않습니다.
  4. 감지 하 고 각 프레임에 대 한 단일 입자를 색인 그들의 특정 대조 및 위치 결정 피크 찾는 알고리즘을 적용 합니다.
  5. 4.4 단계에서 수집 된 정보를 사용 하 여 단백질 바인딩 이벤트의 히스토그램을 만들고 단백질 질량 알려진된 단백질 샘플14,24에서 컴파일된 보정 곡선을 통해 그들의 추출 된 대조 관계.

결과

ISCAT 현미경의 회로도 그림 4a에 표시 됩니다. 대표적인 밝은 필드, 형광, 및 원시 iSCAT 이미지 그림 4b, 4c, 4d, 각각16에 표시 됩니다. 배경 제거 및 차동 게시물 처리;의 결과 표시 하는 그림 4e 및 4f 2 흡착된 단백질 그림 4 층관광 명소 회절 제한으로 볼 수 있습니다. 그림 6 125의 과정을 통해 검색 된 단백질의 히스토그램은 s. 이러한 데이터 바인딩 이벤트를 계산 하 고 그들의 대비16카탈로그를 캡처한 이미지에 피크 찾는 알고리즘을 적용 하 여 얻은 했다. 503 단백질의 총 수를 발견 했다.

다음, 분 비 종 순화 된 단백질 솔루션, 또는 기능성된 유리 표면14,16추가 측정을 통해 실시 기준 측정 비교해보면 식별 됩니다. ISCAT 데이터 따라서, 직접 웨이크업하 규모16에 세포 분 비 역학을 시각화. 예를 들어, 우리는 이전 발견 IgG 항 체 Laz388 secretome의 주요 일부와 두 번째16당 ca. 100 분자의 비율로 셀에서 해제 됩니다. 또한, 100 kDa-1000 kDa의 범위를 확장 하는 다른 입자는 세포16에 의해 은닉 된다. 설명된 방법 추가 고용 예를 들어, 셀16주변 분 비의 공간 농도 기온 변화도 조사 하거나 세포 세포의 용 해16의 일시적인 역동성 결정 될 수 있습니다.

figure-results-1
그림 6: 단일 Laz388 세포에 의해 분 비 단백질의 정량화. 히스토그램의 125 s. 값 1 x 10-4 대비 쓰레기통 (파란색 막대)에 누적 되는 기간 동안 검색 된 단백질을 보여줍니다. 503 개별 단백질의 총이이 측정 하는 동안 계산 했다. 실험은 유사한 결과 10 번 반복 되었다. 이 그림에서 맥도날드, M.P. 외 적응 되었습니다. 16. 저작권 2018 미국 화학 사회. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

토론

유용한 iSCAT 데이터를 취득 하는 가장 중요 한 측면 중 하나는 coverslip 표면에 그리고, 또한, 정확한 초점 위치를 찾을 수 오랜 시간 동안이 자리를 잡아. 이렇게 하려면 실패 확대 PSFs, 약한 iSCAT 신호 및 드리프트 관련 아티팩트 역학 분석에서 발생 합니다. 그것은 밝혀 깨끗 하 고 맨 손으로 coverslip에 초점 비행기를 찾는 표면 하지 쉬운 작업 표면 특징은 큰 참조 빔 배경으로 ( 그림 4 d참조).

원시 iSCAT 이미지는 종종 여기 소스에 파면 불순물에서 발생 하 고 올바른 이미징 비행기를 찾을 수의 능력을 방해할 수 배경 신호에 의해 왜곡 됩니다. 활성 wavefront 빼기가이 문제를 회피 하 고 이후에 측정16동안 iSCAT 초점을 모니터링 하는 유용한 방법입니다. 이 한 가지 방법은 공간 샘플 변조입니다. 간단히, 함수 발생기 적용된 주파수 (290 nm 진폭)에서 공간 샘플 변조에 따른 압 전 단계의 외부 제어 포트를 50 Hz의 구형 파를 적용 합니다. 동기 카메라 인수 같은 소스에서 그리고, 자물쇠 원리, 파면 보상 이미지14,16결과 통해 결합 될 때 트리거됩니다. 결과 이미지는 일반적으로 표면 거칠기 coverslip (그림 4e)의 보여줍니다. 청소 후 유리에 남아 있는 작은 기능 초점에 현미경을가지고 사용할 수 있습니다. 프레임 속도, 노출 시간, 또는 하드웨어가 활성 배경 빼기 단계에 사용 된 매개 변수를 변경할 수 있습니다.

위에서 설명 했 듯이, iSCAT 설치 (1.2.1 단계.)에서 높은-품질 빔 스플리터를 사용 하 여 것이 좋습니다, 대충 같은 유물을 이미징 또는 얇은 평면 빔 스플리터에서 발생 하는 간섭 영향을 이미지 하 고 측정을 방해. 그림 7 높은-품질과 낮은-품질 빔 스플리터 사이 비교를 보여 줍니다. 두 원시 iSCAT 이미지 일부 잔여 입자를 포함 하는 coverslip에 동일한 영역을 표시 합니다. 동일한 iSCAT 설치는 두 이미지를 캡처하는 데 사용 되었다, 빔 스플리터만 교환 했다. 그림 7a 는 두꺼운 (5 mm), 사용 하 여 카메라에 형성 하는 이미지를 보여줍니다 아칸소 코팅, 및 근육 빔 스플리터. 근육 디자인 빔 스플리터의 뒤 표면에서 반사 된 빔 앞 표면에서 발생 하는 반사 방지 평행 이며 목표 입력 하지. 아니 간섭 유물 발생합니다. 그림 7b 샘플에 보기의 동일한 필드를 표시 하지만이 이번 얇은 (1 mm) 평면 빔 스플리터가 사용 되었다. 빔 스플리터의 정면 그리고 뒤 표면에서 두 반사 병렬 하 고 카메라에 전파. 간섭 유물 명확 하 게 볼 수 있습니다.

figure-discussion-1
그림 7: 비교 iSCAT 이미지의 고품질 및 낮은 빔 스플리터와 생산. 5 m m 두께, 아칸소 코팅, 및 근육 빔 스플리터의 사용 (a) 결과 원시 iSCAT 이미지. (b) 1 m m 두꺼운 평면 빔 스플리터를 사용 하 여 동일한 영역의 결과 원시 iSCAT 이미지. 두 빔 스플리터는 동일한 분할 비율 (50% 반영, 50% 전송). 프레넬 반사에서 발생 하는 간섭 유물 1 m m 두꺼운 평면 빔 스플리터와 이미지에 명확 하 게 관찰 된다. 스케일 바: 2 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

이 프로토콜에서 우리 iSCAT에 대 한 넓은 필드 조명 체계를 설명 하는으로 그것은 빠르고, 실현 하기 쉬운 넓은 지역14이상 병렬 감지에 대 한 허용 합니다. 또 다른 일반적인 접근 acousto 광학 deflectors (AODs)를 사용 하 여 샘플12,17걸쳐 confocal 빔 스캔입니다. 이 이렇게 높은-품질 wavefronts의 필요성을 피할 수 있지만 기존의 넓은 필드 영상 보다 더 실험적으로 복잡. 또한, confocal 조명의 속도 AODs에 의해 제한 됩니다. 원하는 실험 매개 변수에 따라 어느 confocal 또는 넓은 필드 조명 계획, 원칙적, 활용할 수 있습니다 살아있는 세포에서 분 비 한 단백질을 검출 하기 위하여.

프로토콜을 통해 설명 했 듯이, 현미경의 샘플 단계에서 측면 기계적인 동요를 최소화 하기 위해 필수적입니다. 샘플의 위치에도 나노미터 편차 변화 연속 카메라 프레임에 리드 하 고 차동 이미지에 상당한 외부 잡음을 유발 수 있습니다. 따라서 기계적으로 안정 된 현미경 단계와 감쇠 광학 테이블 (단계 1.1.1.)를 사용 하 고 실험 (3.5 단계.) 동안 광 커튼 또는 패널 설치를 커버 것 좋습니다.

활성 포커스 안정화 체계는 또한 장기 측정에 대 한 간주 될 수 있습니다. 이 방법에서는, 두 번째 레이저 총 내부 반사 (사격) 배열, 현미경에 통합 이며 이후 사분면 광다이오드에 몇 군데. 시스템의 초점 변경 사분면 다이오드, 압 전 단계26의 z 축을 제어 하는 적극적인 피드백 루프에 사용할 수 있습니다에 자리 사격 레이저의 수평 변위로 번역. 장기 수직 드리프트 효과 따라서 제거 됩니다.

몇 가지 수정 및 확장 주소 특정 실험적인 요구 제시 기술에 적용할 수 있습니다. 상업적인 현미경 단계 incubators 사용할 수 있습니다 예를 들어 있는 셀의 장기 이미징 iSCAT 현미경에 통합 될 쉽게 수. 다른 기술을 iSCAT 이미징와 같은 보완을 구현할 수도 있습니다 confocal 또는 사격 형광 microscopies17. 그러나 연구, 측정 DMEM 또는 DPBS, 같은 다른 셀 미디어에서 실행 될 수 있다 iSCAT 분 비 시스템에 맞게, pH 지시자 페 놀 레드 피해 야 한다 그것은 레이저 광의 흡수 때문에 실험을 방해 수 있습니다로. 또한, 송아지 태아 혈 청 (FCS) 또는 인간 혈소판 lysate (hPL) 같은 보충 iSCAT 탐지를 방해할 수 있는 단백질을 포함. 실험의 원하는 감도 따라 현미경 매체에서 이러한 보충제를 제외 해야 합니다.

iSCAT는 분석의 수 분산형 빛에 의존-모든 단백질에 본질적인 속성-이며 따라서 본질적으로 일반적인. 그럼에도 불구 하 고, 어느 정도의 특이성 단백질 대량14,,2728와 선형 iSCAT 신호 스케일으로 가능 하다. 이 iSCAT 시스템 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 등 fibrinogen14,,2728표준 단백질 견본을 사용 하 여 교정할 수 있습니다. 사실, 아주 최근에, 젊은 외. 28 Piliarik & Sandoghdar14 의 일에 확장 그리고 19 kDa의 대량 해상도와 정확도 약 5 kDa streptavidin (53 kDa) 작은 단백질의 분자량을 결정 하는 iSCAT를 사용할 수 있습니다 나타났습니다. 여러 가지 기존의 접근 특이성의 추가 레벨을 제공 하 여 iSCAT를 보완 추가 수 있습니다. 예를 들어, 효소 연결 된 immunosorbent 분석 실험 (ELISA), 또는 다른 표면 수정으로 대상 단백질만 검출된16되도록 단백질 바인딩 이벤트를 제한 합니다.

이 프로토콜에서 우리 웨이크업하 시간적 해상도16단일 단백질 수준에서 세포 분 비 조사 iSCAT 현미경 검사 법을 사용 하는 방법을 설명 합니다. 기술은 일반 이며 어떤 상업적 또는 집에서 만든 현미경에 구현 될 수 있습니다. 단일 분자 형광 접근 달리 메서드가 photobleaching에서 고통을 하지 않습니다 또는 점멸 효과 하지만 그것은 여전히 단일 단백질 감도 달성. 이러한 기능 바이오 센 싱 및 현미경의 분야에서 강력한 도구 iSCAT 확인합니다. 미래의 응용 프로그램 elucidating 셀룰러 통신 또는 자극에 면역 반응 등 복잡 한 세포 상호 작용에 집중할 것 이다.

공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

이 작품은 맥스 플랑크 사회, 알렉산더 폰 훔볼트 교수와 도이치 가운데 (CRC 1181)에 의해 지원 되었다. 우리 감사 합니다 스테파니 Schaffer Universitätsklinikum 에를랑겐에서 제공 하는 Laz388 세포에 대 한 유용한 토론. 우리 감사 합니다 시몬 Ihloff과 막심 Schwab MPL에서 기술 지원에 대 한.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Item/Device
100x / 1.46 NA objectiveZeiss420792-9800-000alpha Plan Apochromat oil immersion
20x / 0.4 NA objectiveLeica566049N Plan
Piezo StagePIP-517k0203축 스테이지와 100x100x10µ m 범위
다이오드 레이저(445nm)LasertackPD-01236
광학/광역학Thorlabs/Newport-렌즈, 거울, 포스트, 마운트
핀홀ThorlabsP30H
LED 광원ThorlabsMCWHL5
Shortpass filter(580nm)Omega Optical580SPLED의 스펙트럼을 수정합니다. 형광 여기
장역 통과 필터 (500 nm)ThorlabFEL0500형광 여기
70R/30T 빔 스플리터Newport20Q20BS.1
이코노미 빔 스플리터ThorlabsEBS1fringe 효과 비교에 사용되는
쐐기 플레이트 빔 스플리터ThorlabsBSW26비교에 사용되는 fringe effects
Shortpass dichroic mirror (550 nm)Edmund Optics66249
8R/92T 빔 스플리터ThorlabsBP108
CMOS 카메라PhotonfocusMV1-D1024E-160-CLiSCAT 수집
CMOS 카메라MightexSCE-B013-U명시야/형광 획득용
Longpass filter (600 nm)Thorlabs
컴퓨터후지쯔 지멘스 -코어 i7 프로세서, 16GB RAM, SSD
수집 소프트웨어LabVIEW-LabVIEW2016 Suite
분석 소프트웨어Matlab-Matlab2014 Suite
플라즈마 클리너Diener Diener pico
인큐베이터바인더모델 CB
원심분리기Eppendorf5810R
시약/재료
RPMI 1640 매체Gibco11835063페놀 레드
HEPES 버퍼 용액 (1M)Sigma Aldrich59205C
커버 슬라이드Marienfeld107052
유리 바닥 배양 접시ibidi81158
형광 마이크로스피어Invitrogen교정에 사용되는F8821
Immersol 이멀젼 오일Zeiss444960
Propidium iodide stainInvitrogenR37108
소형 피펫 팁Eppendorf30075005
Flexible 피펫 팁Eppendorf5242956003
Ethanol, 99.8%Fisher ScientificE/0650DF/15
수산화나트륨, 펠릿Sigma Aldrich0.2M NaOH 용액을 준비하기 위해221465
s는 , , , , , , FELH0600는 합니다.

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