체액 성 면역의 해결 핵심 선수: 고급 및 Murine 파이어의 패치에서 림프 구 격리 프로토콜 최적화

요약

이 연구에서는 선물이 고 림프 톨의 격리에 대 한 효율적인 프로토콜 Peyer의 패치 (PPs), 사용할 수 있습니다 이후 follicular T의 흐름 cytometric 학문 뿐만 아니라 vivo에서 그리고 생체 외에서 기능적 분석 실험에서 도우미 고 어린 싹 센터 B 세포입니다.

초록

창 자 점 막에 면역 세포 병원 균에 대 한 면역 방어를 동시에 부여 하는 동안 면역 관용을 승진 시키는 독특한 면역 엔티티를 구성 합니다. 잘 설립 Peyer의 패치 (조달 청) 여러 이펙터 T와 B 세포의 하위 집합을 개최 하 여 점 막 면역 네트워크에 필수적인 역할을 했습니다. 이러한 이펙터 셀, follicular T 도우미 (TFH) 및 본 원 센터 (GC) B 세포의 특정 분수는 독립적일 체액 성 면역의 규칙에서. 따라서, 그들의 차별화 프로그램 및 기능 속성을 조달 청에 내에서 이러한 셀 하위 특성 점 막 면역에 대 한 중요 한 정보를 제공할 수 있습니다. 이 위해 조달 청에서 림프 구 분리는 쉽게 적용, 효율적이 고 재현 방법 연구에 귀중 한 것입니다. 이 연구에서 우리가 높은 셀 수익률 마우스 조달 청에서 세포를 분리 하는 효과적인 방법 생성 목적입니다. 우리의 접근 공개 소화 시 약 및 조직 동요의 사용과 같은 처리 하는 초기 조직으로 세포 얼룩 조건 및 항 체 패널의 선택, 품질 및 고립 된 림프 톨의 정체성에 큰 영향력을가지고 실험 한 결과

여기, 우리가 효율적으로 재현 흐름 cytometry 기반 평가 TFH와 GC B 세포 하위 집합에 초점을 주로 하는 T와 B 세포 하위 집합을 허용 하는 조달 청에서 림프 구 인구를 분리 하는 연구자를 사용 하는 프로토콜을 설명 합니다.

서론

끝에 처음부터 전체 위 장관 이상 어떤 다른 인간의 기관 및 마우스¹면역 세포를 포함 하는 광범위 한 림프 네트워크와 갑판입니다. 파이어의 패치 (조달 청)이 세포 면역 조직, 소위 창 자 연관 된 림프 조직 (GALT)^2,3장 분기의 주요 구성 요소를 구성. 조달 청, 항 원 식이 자료에서 파생 된의 수백만의 수천에서 공생 microbiota 및 병원 체, 샘플링 되 고 그들을 향해 필요한 적절 한 면역 반응 탑재 따라서 유지 장 면역 항상성입니다. 그런 의미에서 조달 청 "편도 소장"으로 라는 수 있습니다. 조달 청 주요 하위 구획의 구성: subepithelial은 돔 (SED) 큰 B-세포 뿌리 영역; overlying 뿌리 관련 상피 (FAE) 및 interfollicular 지역 (IFR) T 세포는 위치⁴. 따라서, 조달 청 협조, 가능 하 게 다른 이펙터 셀 하위 집합의이 독특한 서 용기에서 immunocompetence를 수 여.

조달 청 부족 입성 lymphatics, 그리고 이런이 이유로 인해 항 소장에서 조달 청에 이송 하지 실시 되....

프로토콜

모든 연구 및이 프로토콜에서 설명 하는 실험 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 베스 이스라엘 여자 집사 의료 센터의 지침에 따라 실시 했다.

1. 설계 실험 설정 및 마우스 그룹

1. (선택 사항) 공동 실험 쥐 실험 쥐 사이의 본질적인 microbiota의 수평 전송을 촉진 하 고 PP 세포 내에서 일반적인 다양성을 줄이기 위해 집. 또한, 같은 성별의 littermate 컨트롤을 사용 하 여 변화를 최소화 하기 위해.

2. 외과 절단, 조직 준비 단계:

1. 작은 창 자 (SI)의 외과 제거
   1. CO₂ 질 식 또는 기관 동물 윤리 위원회에 의해 승인 된 모든 해당 메서드를 사용 하 여 마우스를 안락사
   2. 외과 절단에 대 한 전용된 영역에 마우스를 전송 합니다. 아래 뒷면을 놓고 70% 에탄올과 복 부를 청소 합니다. 복 부 피부와 복 막 액에서 따라서 복 막 구멍을 열고 흉 곽에 중간 선 따라 절단 하 여는 개복 술을 수행 합니다.
      참고: 복 막 구멍을 관통 하 고 장 조직 손상 방지에 피부의 비교적 작은 영역에 첫 번째 절 개를 수행 합니다. 계속 원하는 해 부 경계까지 절단.
   ....

결과

이전 프로토콜²⁰, 달리 우리 조달 청 시에 걸쳐 균등 하 게 배포 되지 않은 그러나 더 조밀 하 게 SI의 원심 및 인접 하는 끝을 향해 지역화와 같이 관찰 그림 1A. 흐름 cytometric 분석, 정확 하 게 따라 하는 경우 우리의 프로토콜 PP 림프 구 인구는 앞으로 사이드 분산형 배포 splenocytes (그림 2AE, 및 2D, H)와 비슷한 게 나타났다 > 95% 셀 생존 능력 (그림 2B 와 2 층) 다른 2 차 림프 기관 (Slo), 달리 C57BL/6 쥐에 총 PP 림프 톨의 약 70-80% .......

토론

여기, 우리가 TFH와 GC B 세포의 흐름 cytometric 특성에 최적화 된 프로토콜을 설명 합니다. 우리의 프로토콜의 주요 장점 중의 하나 이다는 하나의 마우스 (C57BL/6 변형)에서 최대 10⁷ (평균 4-5 x 10⁶ 셀) 총 PP 셀의 모든 소화 과정 없이. 총 셀 생산량 조달 청의 수와 긍정적으로 상관 했다 및 실험 계획에 대 한 도움이 되는 다음과 같은 간단한 방정식에서 예상할 수 있는 관찰: "총 PP 셀 수 마우스에 당 0.5-1 = x (삭제 PP 당 수 마우스) x 10⁶". 이 높은 셀 수율 향상 된 세포 생존 능력으로 보충 되었다 (> 95%). 향상 된 세포 복구 및 생존 분석 흐름 cytometric 다양 한 림프 톨 부분 집합의 병렬로 패널 얼룩 다양 한 항 체를 사용 하 여 조달 청에 허용.

드 예수 외의해 최근 PP 격리 프로토콜에 비.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
항-마우스 CD4 항체	eBioscience, Biolegend*	17-0041-81 ,10054*	자세한 정보는 표 1
항-마우스 CD19 항체	eBioscience	MA5-16536	자세한 정보는 표 1
항-마우스 PD-1 항체	eBioscience	61-9985-82	자세한 정보는 표 1
항-마우스 ICOS 항체	eBioscience	참조12-9942-82	자세한 내용은 표 1
항마우스 GL7 항체	참조: Biolegend	144610	자세한 정보는 표 1
항마우스 CXCR5 항체	Biolegend*, BD Bioscience	145512*, 551960	자세한 내용은 표 1
항마우스 BCL-6 항체	Biolegend	358512	자세한 정보는 표 1
항마우스 Foxp3 참조 항체	eBioscience	17-5773-82	자세한 내용은 표 1
Streptavidin-BV421	BD Bioscience	563259	참조 자세한 내용은 표 1
FixableViability Dye	eBioscience	L34957	자세한 내용은 표 1
7AAD	Biolegend	420404	참조 자세한 내용은 표 1
FcBlock(CD16/32)	참조BD Bioscience	553141	자세한 내용은 표 1
Collagenase II	Worthington	LS004176
Collagenase IV	Worthington	LS004188
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set	eBioscience	00-5523-00
6-well,12-well & 96-well plates	Falcon/Corning	353046,353043/3596
50mL 원추형 튜브	Falcon	3520
40 µ m 세포 여과기	Falcon	352340
10 mL 주사기 플런저	Exel INT	26265
RPMI	Corning	15-040-CV
PBS	Corning	21-040-CM
FBS	Atlanta Biologicals	S11150
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