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방법 논문

체액 성 면역의 해결 핵심 선수: 고급 및 Murine 파이어의 패치에서 림프 구 격리 프로토콜 최적화

13.5K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/58490

⸱

2018년 11월 21일

 ,  ,  ,  , 
1Division of Hematology-Oncology, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 2Department of Medicine, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School

이 논문에서

요약

이 연구에서는 선물이 고 림프 톨의 격리에 대 한 효율적인 프로토콜 Peyer의 패치 (PPs), 사용할 수 있습니다 이후 follicular T의 흐름 cytometric 학문 뿐만 아니라 vivo에서 그리고 생체 외에서 기능적 분석 실험에서 도우미 고 어린 싹 센터 B 세포입니다.

초록

창 자 점 막에 면역 세포 병원 균에 대 한 면역 방어를 동시에 부여 하는 동안 면역 관용을 승진 시키는 독특한 면역 엔티티를 구성 합니다. 잘 설립 Peyer의 패치 (조달 청) 여러 이펙터 T와 B 세포의 하위 집합을 개최 하 여 점 막 면역 네트워크에 필수적인 역할을 했습니다. 이러한 이펙터 셀, follicular T 도우미 (TFH) 및 본 원 센터 (GC) B 세포의 특정 분수는 독립적일 체액 성 면역의 규칙에서. 따라서, 그들의 차별화 프로그램 및 기능 속성을 조달 청에 내에서 이러한 셀 하위 특성 점 막 면역에 대 한 중요 한 정보를 제공할 수 있습니다. 이 위해 조달 청에서 림프 구 분리는 쉽게 적용, 효율적이 고 재현 방법 연구에 귀중 한 것입니다. 이 연구에서 우리가 높은 셀 수익률 마우스 조달 청에서 세포를 분리 하는 효과적인 방법 생성 목적입니다. 우리의 접근 공개 소화 시 약 및 조직 동요의 사용과 같은 처리 하는 초기 조직으로 세포 얼룩 조건 및 항 체 패널의 선택, 품질 및 고립 된 림프 톨의 정체성에 큰 영향력을가지고 실험 한 결과

여기, 우리가 효율적으로 재현 흐름 cytometry 기반 평가 TFH와 GC B 세포 하위 집합에 초점을 주로 하는 T와 B 세포 하위 집합을 허용 하는 조달 청에서 림프 구 인구를 분리 하는 연구자를 사용 하는 프로토콜을 설명 합니다.

서론

끝에 처음부터 전체 위 장관 이상 어떤 다른 인간의 기관 및 마우스1면역 세포를 포함 하는 광범위 한 림프 네트워크와 갑판입니다. 파이어의 패치 (조달 청)이 세포 면역 조직, 소위 창 자 연관 된 림프 조직 (GALT)2,3장 분기의 주요 구성 요소를 구성. 조달 청, 항 원 식이 자료에서 파생 된의 수백만의 수천에서 공생 microbiota 및 병원 체, 샘플링 되 고 그들을 향해 필요한 적절 한 면역 반응 탑재 따라서 유지 장 면역 항상성입니다. 그런 의미에서 조달 청 "편도 소장"으로 라는 수 있습니다. 조달 청 주요 하위 구획의 구성: subepithelial은 돔 (SED) 큰 B-세포 뿌리 영역; overlying 뿌리 관련 상피 (FAE) 및 interfollicular 지역 (IFR) T 세포는 위치4. 따라서, 조달 청 협조, 가능 하 게 다른 이펙터 셀 하위 집합의이 독특한 서 용기에서 immunocompetence를 수 여.

조달 청 부족 입성 lymphatics, 그리고 이런이 이유로 인해 항 소장에서 조달 청에 이송 하지 실시 되 고 다른 림프 기관의 대부분과 달리 림프 혈관을 통해. 대신, FAE, 소위 M 세포에에서 위치한 전문된 상피 세포는 luminal 항 조달 청5에 전송 합니다. 그 후, 수송된 항 원에 의해 선택 모 수석 세포 (DCs) 및 FAE6,7아래 subepithelial 돔 (SED) 지역에 있는 식 세포. Dc는 PP에이 항 원 정렬 과정은 적합 한 면역 반응8 및 IgA 은닉 세포9의 후속 세대를 시작 중요 합니다.

공생 식물과 식이 자료 항 원 부담 때문 PPs 호스트 endogenously 활성화 이펙터 T TFH 그리고이+ 가 GC B 세포10, 같은 훌륭한 나타났는데 하위 집합 B 세포 조달 청 활성 면역의 사이트 대표 제안 응답11. 최대 20-25%의 총 CD4 내의 TFH 셀+ T 세포 구획 및 최대 10-15% 총 B 세포 내에서 GC B 세포 이다 unimmunized 젊은 C57BL/6 마우스12에서 수집 하는 조달 청에서 가능 하다. 달리 다른 T 조 수 세포 유형 (즉., Th1, Th2, Th17 세포), TFH 셀 CXCL13 그라데이션13따라 TFH 셀 유도 승진 시키는 CXCR5 식 때문에 주로 B 세포 모 낭에 독특한 차 있는 굴곡 운동 표시. 조달 청의 B 세포 뿌리 영역에서 TFH 셀이 종류 스위치 재결합 및 활성화 된 B 세포에서 높은 선호도 생산 하는가 세포 분화14에 신체적인 hypermutation 유도. 그 후, 이러한 항 체 은닉 플라스마 세포 lamina propria (LP)에 이주 하 고 용기10면역 항상성 조절.

식별 및 조달 청 내 TFH와 GC B 세포 인구의 체액 면역 반응 시간이 걸리는 면역 모델의 필요 없이 정상 상태 조건 하에서 역학 조사 연구원 사용 수 있습니다. 전통적으로 TFH GC B 세포 연구15,,1617,18에 사용. 조달 청 내의 TFH 셀 분석 다른 셀의 하위 집합으로 간단 하지 않습니다. 기술 과제 포함 식별 이상적인 조직 준비 상태, 표면 항 체-마커 조합으로 적절 한 긍정적이 고 부정적인 컨트롤을 선택 합니다. TFH 그리고 PP 연구 분야 실험 절차의 측면에서 큰 다양성을 전시 하 고 부여 하는 여러 가지 이유로 인해 표준화 된 프로토콜을 설정 하는 합의. 첫째, 조달 청 내 각 세포 부분 집합 차동 조직 준비 조건 추가 셀 집합 특정 방식으로 수정 요구에 의해 영향을 받을 경향이 있다. 둘째, 조달 세 번째, 이상적인 조직 준비 기술 및 실험 조건 조사 프로토콜 기반 비교 연구의 수에서 셀 준비의 세부 사항에 관한 보고 방법 중에서 중요 한 차이가 있다 PP와 TFH 연구 다소 제한 됩니다.

현재 프로토콜 기반 연구 PP 셀 준비19,20,21,22 에 대 한 제안 TFH-또는 GC B 세포 지향 되지 않았습니다. 또한, 콜라 기반 소화 등 조달 청19,20 대 한 권장 일부 조직 준비 조건 cytometry에 의해 TFH 식별의 결과 부정적인 영향을 발견 했다18. 이 기초에, 우리는 최적화 된, 표준화 되 고 재현 가능한 프로토콜 TFH 조달 청 내에서 GC B 세포 역학을 공부 하는 데 사용할 수 있는이 주제에 수 사관을 가치가 있을 것 이라고 권유. 이 필요는 우리에 게 격리 및 정밀 하 게 세포 복구, 생존, 그리고 여러 T와 B의 흐름 cytometric 특성에 대 한 효율을 위해 최적화 된 PP 세포의 특성에 대 한 향상 및 최신 프로토콜을 생성 하는 원동력 셀의 하위 집합입니다. 우리는 또한 이전 프로토콜에 따라서, 제안 하는 여러 힘 드는 준비 단계를 제외 하 필요한 조작 및 조달 청에서 조직 및 세포 준비를 위한 시간을 줄이는 목적입니다.

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프로토콜

모든 연구 및이 프로토콜에서 설명 하는 실험 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 베스 이스라엘 여자 집사 의료 센터의 지침에 따라 실시 했다.

1. 설계 실험 설정 및 마우스 그룹

  1. (선택 사항) 공동 실험 쥐 실험 쥐 사이의 본질적인 microbiota의 수평 전송을 촉진 하 고 PP 세포 내에서 일반적인 다양성을 줄이기 위해 집. 또한, 같은 성별의 littermate 컨트롤을 사용 하 여 변화를 최소화 하기 위해.

2. 외과 절단, 조직 준비 단계:

  1. 작은 창 자 (SI)의 외과 제거
    1. CO2 질 식 또는 기관 동물 윤리 위원회에 의해 승인 된 모든 해당 메서드를 사용 하 여 마우스를 안락사
    2. 외과 절단에 대 한 전용된 영역에 마우스를 전송 합니다. 아래 뒷면을 놓고 70% 에탄올과 복 부를 청소 합니다. 복 부 피부와 복 막 액에서 따라서 복 막 구멍을 열고 흉 곽에 중간 선 따라 절단 하 여는 개복 술을 수행 합니다.
      참고: 복 막 구멍을 관통 하 고 장 조직 손상 방지에 피부의 비교적 작은 영역에 첫 번째 절 개를 수행 합니다. 계속 원하는 해 부 경계까지 절단.
    3. 작은 창 자의 원심 세그먼트 구성 터미널 회장의 검출을 위한 이상적인 랜드마크 caecum을 식별 합니다.
      참고: Caecum는 마우스 복 부의 왼쪽 아래에 있습니다 일반적으로.
    4. Ileocaecal 접점을 파악 하 고이 수준에서 절단은 caecum 소장 구분 가능한 원심. 다음 단계에 걸쳐 연약한 PPs 터치 시 쉽게 붕괴 때문에 창 자 벽과 과도 한 신체 접촉을 피하십시오.
    5. 가 위를 사용 하 여 mesentery를 절단 하 여 전체 소장 pyloric 괄약근까지 부드럽게 제거 합니다. Pylorus 십이지, 사이 연결을 식별 하 고이 수준에서 소장 복 부 구멍에서의 분리를 완료로 이어질 것입니다 십이지를 싹 둑.
      참고: (i) 하이퍼 확장으로 피하이장 벽의 파열을 발생할 수 있습니다. (ii) mesenteric 지방의 완전 한 제거는 필요 LP 림프 구 분리 PP 세포 이외에 필요한 경우. 그러나, PP 격리에 대 한 mesenteric 지방 남은 수 혜택을 제공할 몇 가지 추가 격리 단계; 따라서, 그것은 해야 합니다 유지.
    6. 6 잘 플레이트 가득 찬 RPMI + 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)에 분리 소장을 배치 하 고 부드럽게 선동 조직 수동으로 모든 장 세그먼트 차가운 미디어에 잠긴 때까지. 다음 단계에 걸쳐 얼음에 조직 유지 합니다.
    7. 원하는 마우스 소장 수 해 부, 후 수집 된 작은 창 자에서 PP 절단을 진행 합니다.
  2. 조달 청 및 단일 세포 현 탁 액의 준비의 외과 절단:
    1. 부드럽게 종이 타월에 집게를 사용 하 여 mesenteric 지방 창과 작은 창 자 전송 및 종이 타월에 직면 mesenteric 측면 장소. 축 찬 RPMI + 10% 전체 장 세그먼트 FBS 조직 탈수와 끈 적 거 림을 피하기 위해.
      참고: 시의 mesenteric 사이트에 지방 조직 세그먼트 위로 향하도록 반 mesenteric 사이트를 유지 하는 종이 타월에 충실 하기 때문에이 단계에서 도움이 될 수 mesenteric 지방에 남아 있는.
    2. 조달 청, 창 자 벽의 안티 mesenteric 측에 "콜리플라워 같은" 형태로 화이트 멀티 lobulated 집계로 표시 되는 확인 합니다.
      참고: 모든 조달 청 excised 됩니다 때까지 플러싱 luminal 콘텐츠 권장 하지 않습니다. 비우는 luminal 콘텐츠는 조달 청의 붕괴를 발생할 수 있습니다 하 고 조달 청 조달 청의 시각적 식별에 매우 도움이 되는 장벽 사이의 색상 명암을 막을 것 이다.
    3. 확인 후 조달 청 안티 mesenteric 측에, 위 수술 끝 곡선가 위 조달 청 (곡선 해야 얼굴)의 말 초 및 인접 국경에서 PP를 억제.
      선택 사항: PP가 위 손가락을 사용 하 여 블레이드를 향해 부드럽게 밀어. 이 책략 주변의 비 PP 조직은 더 나은 배제 이어질 것입니다. 소비 세는 조달 청 부드럽게, 주변 장 조직을 제외.
      참고: (i)이이 단계는 등 LP 장 상피 세포, T 세포에 풍부도 장의 구획을 이웃 셀 오염 최소화 하면서 최대한 PP 셀 수율을 얻기 위해 중요 한. (ii)에서 한 시 C57BL/6 마우스에서 excised, 5-10 조달 청 (평균 크기, 다중 lobulated)를 수집할 수 있습니다. 심지어 작은 PPs (멀티 lobulated)의 컬렉션을 최대 목표로 하 여 마우스 (C57BL/6) 당 12 월 13 일 조달 청이이 프로토콜을 사용 하 여 가능 하다.
    4. 전송 삭제 조달 청 12 음 조직 문화 접시에 가득 차가운 RPMI + 10 %FBS 유지에 얼음 집게 또는 곡선된 수술가 위를 사용 하 여.
      참고: (i) 조달 청의 절단, 직후 점액과 PP 표면에 장의 내용을 정리할 수 있습니다 종이 타월에 조직을 부드럽게 문질러. 이 단계는 PP 세포의 생존 능력을 개선 하는 데 도움이 됩니다. (ii) 조달 청 접시에 전송의 대신 튜브를 분리 전송 여겨질 수 있다 또한 총 샘플 수에 따라.
    5. 선택 사항: PP 절단 및 잘 플레이트에 후속 배치 완료 되 면 수와 다른 실험/마우스 그룹에서 수집 하는 조달 청의 크기 수 문서화 조달 청을 포함 하는 조직 문화 접시의 그림을 복용 함으로써.
    6. 가득한 RPMI + 10%의 25 mL 50 mL 원뿔 관의 세트를 준비 FBS (37 ° C에서 미리 예 열). 1 mL 피 펫와 조달 청의 열망 하면 거리에서 1000 µ L 팁의 가장자리를 잘라가 위를 사용 하 여. 1 mL 피 펫으로 PPs를 발음 하 고 준비 된 50 mL 원뿔 튜브를 12 음 조직 배양 접시에서 그들을 전송.
      참고: 샘플 중 상호 오염을 피하기 위해 각 마우스 샘플에 대 한 새로운 팁을 사용 합니다.
    7. 뚜껑을 장악 하 고 10 분 125-150 rpm에서 지속적인 동요와 37 ° C에서 궤도 통에 튜브를 수직으로 배치. 한편, 50 mL 튜브의 새로운 세트를 준비 하 고 각 관,이 통해 단일 세포 현 탁 액 준비 됩니다 정상 40 µ m 셀 스 트레이너를 배치.
      참고:는 PP 세포의 회복과 세포 생존 능력을 감소 하지 않을 경우 제거 (i) 동요 단계 나머지 장 콘텐츠, 점액과 세포 파편을 제거 합니다. (소화 과정 세포 표면에서 CXCR5 식의 극적인 손실 때문에 PP 조직에 소화 효소의 어떤 종류를 적용 되지 않습니다 ii).
    8. 동요, 후 40 µ m 셀 스 트레이너 새로 준비 원뿔 50 mL 튜브 상단에 배치 하는 조달 청을 전송 합니다. 부드럽게 10 mL 주사기 플런저의 둥근된 쪽을 사용 하 여 단일 세포 현 탁 액을 생성 하 셀 스 트레이너를 통해 조달 청을 중단. 린스 차가운 RPMI + 10%의 15-20 mL와 여과기 FBS.
      참고: (i) 하기 전에 필터링, 가로로 조달 청을 포함 하는 튜브를 흔들. 이 짧은 동요 셀 멤브레인으로 조달 청의 전송을 촉진 한다. (ii)를 사용 하 여 70 µ m 셀 스 트레이너 비 림프 면역 세포의 고립에 대 한 (예., monocytes, 대 식 세포, Dc) 것이 좋습니다.
    9. 단일 셀 정지 4 ° c.에서 10 분 동안 350-400 x g에서 원심
    10. 신중 하 게 삭제는 상쾌한 고 10 x 106 셀/mL의 농도에서 세포를 resuspend. hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.
      참고: (i) 셀 계산 하기 전에 각 마우스 PP 그룹에 대 한 총 셀 수 예상할 수 있는 대략 다음과 같은 수식을 사용 하 여: "0.5-1 x 106 셀 (조달 청의 수) x 총 세포 수 =". Trypan 블루 셀 카운팅을 위한와 더 희석 할 수도 있습니다. (ii)을 수동 계산 하는 대신으로 자동된 셀 카운터를 사용할 수 있습니다.
    11. 2-2.5 x 106 셀에 적절 한 볼륨을 전송 (예., 200 µ L) 96-잘 라운드-하단 플레이트에.
      참고: 단일 색상 및 부정적인 컨트롤 샘플, 0.5-1 x 106 세포 수 있습니다 충분.
    12. 4 ° c.에서 5 분 동안 350 x g에서 격판덮개 원심 접시를 터치 합니다.
    13. 워시 얼룩 버퍼의 200 µ L에 셀.

3. 표면 항 체 얼룩이 지기

  1. 생존 얼룩:
    1. 최종 세척 후 PBS (1:1, 000)에 희석 고칠 수 생존 염료의 100 μ 셀 resuspend. 얼음에 또는 어둠 속에서 4 ° C에서 30 분 동안 품 어.
      참고: 키 전사의 탐지를 위해 (i) 세포내 얼룩 Foxp3 같은 요인 또는 Bcl-6 셀의 고정을 필요 합니다. 이 경우 고칠 수 비 생존 염료 (예., 7-AAD, DAPI) 사용할 수 없습니다. (ii)를 고칠 수 생존 염료 희석, 단백질을 포함 하는 어떤 얼룩 버퍼를 사용 하지 마십시오. 이 단계에 사용 된 미디어는 단백질 무료 여야 합니다. (iii) 제외 생존 얼룩을 사용 하 여 죽은 세포의 죽은 세포 흐름 cytometry 분석 autofluorescence를 방출 하 여, nonspecifically, 표면 항 체를 바인딩하여 false로 이어질 수 있는 심각한 기술적인 문제가 발생할 수 있습니다 때문에 결정적 이다 긍정적인 결과입니다.
    2. 두 번 버퍼를 얼룩과 세포를 씻어. 4 ° c.에서 5 분 동안 350 x g에서 원심 분리기 접시를 터치 합니다.
  2. Fc 블록 및 표면-i: 레이어
    1. 버퍼를 얼룩이 지기에서 안티-CD16/32 항 체 (1: 200)을 diluting 하 여 Fc 블록 솔루션을 준비 합니다.
    2. 준비 된 Fc 블록 솔루션의 20 μ 셀 resuspend 얼음에 15 분 동안 품 어.
    3. 세척, 없이 표면 항 체 칵테일의 80 μ 적절 한 희석에 준비 (항 체 요약 표 1 참조)를 추가 합니다. 적어도 30 분 동안 얼음에 품 어.
    4. 과도 한 착 색 버퍼를 추가 하 여 두 번 세척. 4 ° c.에서 5 분 동안 350 x g에서 원심 분리기 접시를 터치 합니다.
  3. 표면-레이어 II:
    1. 얼룩 버퍼에 형광 색소 활용 된 Streptavidin diluting 하 여 Streptavidin 얼룩 솔루션을 준비 합니다.
    2. 최종 세척 후 얼룩이 솔루션 사전 희석된 Streptavidin (1: 100)의 100 μ 셀 resuspend. 어둠 속에서 얼음에 적어도 15 분 동안 품 어.
    3. 두 번 버퍼를 얼룩과 워시. 4 ° c.에서 5 분 동안 350 x g에서 원심 분리기 접시를 터치 합니다.
      선택 사항: follicular 규제 T 세포 검출을 위해 얼룩이 지는 세포내가 적절 하지, 마지막 세척 후 얼룩이 버퍼와 교류 cytometer에서 데이터를 얻기 위해 적절 한 튜브로 전송의 200 μ 셀 resuspend. 샘플은 고정 되어 있지 않으며 때 cytometry 데이터의 수집 정확한 결과 얻기 위해 3-4 시간 내에서 수행 되어야 한다.

4. 셀 고정

  1. 고정/permeabilization (수정/파 마) 작업 솔루션 Foxp3/녹음 방송 요인 얼룩 버퍼 설정에서 시 약을 사용 하 여 준비 합니다. 고정/permeabilization 원하는 최종 볼륨을 희석제의 세 부분을 고정/permeabilization의 한 부분 집중을 믹스.
  2. 최종 세척 후 수정/파 마 작업 솔루션의 200 μ 셀 resuspend.
  3. 20 분 동안 4 ° C 또는 얼음에 플레이트를 품 어. 이 단계에 대 일 분을 초과 하지 마십시오. 장시간 보육 심각 셀 복구를 줄일 수 있습니다.
  4. 4 ° c.에서 5 분 동안 350 x g에서 원심 분리기 접시를 터치 합니다. (옵션) 이 단계 후 고정된 세포 얼룩 소 혈 청 알 부 민 (BSA)를 포함 하는 버퍼에 4 ° C에서 며칠 동안 저장 될 수 있다 또는 FBS 후속 세포내 얼룩 또는 흐름 cytometry 인수까지.
  5. Permeabilization 버퍼 갓 순화 이온된 수에 미리 희석 (x1)의 200 μ 셀 resuspend
  6. 실 온 (RT)에서 5 분 동안 350 x g에서 원심.
  7. Permeabilization 버퍼 및 실시간에 5 분 동안 350 x g에서 원심 분리기의 200 μ로 한 번 씻어

5. 세포내 얼룩

  1. Permeabilization 버퍼에 안티-CD16/32 항 체 (1: 200)을 diluting 하 여 Fc 블록 솔루션을 준비 합니다.
    참고: 고정 단계 후 셀 유지 되어야 합니다 permeabilization 버퍼에 세포내 착 과정의 끝까지.
  2. 최종 세척 후 Fc 블록 솔루션의 20 μ 셀 resuspend. 어둠 속에서 RT에서 10-15 분 동안 품 어.
  3. 세척, 없이 세포내 항 체 칵테일 (100 μ 최종 볼륨) permeabilization 버퍼에 미리 희석의 80 μ를 추가 합니다. 실시간에서 30 분 동안 품 어
  4. 실시간에서 5 분 동안 350 x g에서 페름 버퍼, 그리고 원심 분리기의 100 μ를 추가
  5. Permeabilization 버퍼의 200 μ로 한 번 씻어, 실시간에서 5 분 동안 350 x g에서 원심
  6. 최종 세척 후 얼룩이 버퍼의 200 μ 셀 resuspend 하 고 적절 한 튜브 (착 색 버퍼에 400 μ의 최종 볼륨)로 셀 전송 cytometry로 데이터를 수집. 96 잘 접시에 묻은 샘플 튜브 플레이트 리더 옵션 교류 cytometer 사용할 수 있는 경우 전송 없이 실행할 수 있습니다. 이 단계는 셀 전송 하는 동안 셀 손실을 최소화합니다.
  7. 5 x 105 총 셀 흐름 cytometer TFH, TFR의 재현성 분석을 수행할 수의 최소를 취득 뿐만 아니라 GC B 세포.

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결과

이전 프로토콜20, 달리 우리 조달 청 시에 걸쳐 균등 하 게 배포 되지 않은 그러나 더 조밀 하 게 SI의 원심 및 인접 하는 끝을 향해 지역화와 같이 관찰 그림 1A. 흐름 cytometric 분석, 정확 하 게 따라 하는 경우 우리의 프로토콜 PP 림프 구 인구는 앞으로 사이드 분산형 배포 splenocytes (그림 2AE, 및 2D, H)와 비슷한 게 나타났다 > 95% 셀 생존 능력 (그림 2B 와 2 층) 다른 2 차 림프 기관 (Slo), 달리 C57BL/6 쥐에 총 PP 림프 톨의 약 70-80% ...

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토론

여기, 우리가 TFH와 GC B 세포의 흐름 cytometric 특성에 최적화 된 프로토콜을 설명 합니다. 우리의 프로토콜의 주요 장점 중의 하나 이다는 하나의 마우스 (C57BL/6 변형)에서 최대 107 (평균 4-5 x 106 셀) 총 PP 셀의 모든 소화 과정 없이. 총 셀 생산량 조달 청의 수와 긍정적으로 상관 했다 및 실험 계획에 대 한 도움이 되는 다음과 같은 간단한 방정식에서 예상할 수 있는 관찰: "총 PP 셀 수 마우스에 당 0.5-1 = x (삭제 PP 당 수 마우스) x 106". 이 높은 셀 수율 향상 된 세포 생존 능력으로 보충 되었다 (> 95%). 향상 된 세포 복구 및 생존 분석 흐름 cytometric 다양 한 림프 톨 부분 집합의 병렬로 패널 얼룩 다양 한 항 체를 사용 하 여 조달 청에 허용.

드 예수 외의해 최근 PP 격리 프로토콜에 비...

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공개 사항

관심 없음 충돌 선언.

감사의 글

우리는 유용한 토론에 대 한로 라 스트라우스와 피터 세이 지를 감사 하 고 교류 cytometry 분석 지원 하 고 싶습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
항-마우스 CD4 항체eBioscience, Biolegend*17-0041-81 ,10054*자세한 정보는 표 1
항-마우스 CD19 항체eBioscienceMA5-16536자세한 정보는 표 1
항-마우스 PD-1 항체eBioscience61-9985-82자세한 정보는 표 1
항-마우스 ICOS 항체eBioscience참조12-9942-82자세한 내용은 표 1
항마우스 GL7 항체참조: Biolegend144610자세한 정보는 표 1
항마우스 CXCR5 항체Biolegend*, BD Bioscience145512*, 551960자세한 내용은 표 1
항마우스 BCL-6 항체Biolegend358512자세한 정보는 표 1
항마우스 Foxp3 참조 항체eBioscience17-5773-82자세한 내용은 표 1
Streptavidin-BV421BD Bioscience563259참조 자세한 내용은 표 1
FixableViability DyeeBioscienceL34957자세한 내용은 표 1
7AADBiolegend420404참조 자세한 내용은 표 1
FcBlock(CD16/32)참조BD Bioscience553141자세한 내용은 표 1
Collagenase IIWorthingtonLS004176
Collagenase IVWorthingtonLS004188
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer SeteBioscience00-5523-00
6-well,12-well & 96-well platesFalcon/Corning353046,353043/3596
50mL 원추형 튜브Falcon3520
40 µ m 세포 여과기Falcon352340
10 mL 주사기 플런저Exel INT26265
RPMICorning15-040-CV
PBSCorning21-040-CM
FBSAtlanta BiologicalsS11150
Orbital shakerVWR Model 200
Curved-end scissor
파인 톱니 집게
작은 곡선 가위
참조, 참조, 참조, 참조, 참조 을 참조하십시오.

참고문헌

  1. van den Berg, T. K., van der Schoot, C. E. Innate immune ‘self’ recognition: a role for CD47-SIRPα interactions in hematopoietic stem cell transplantation. Trends in Immunology. 29 (5), 203-206 (2008).
  2. Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
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