여러 설치류 두뇌의 동시 Cryosectioning

요약

여기, 선물이 동결 하 고 처리 한 두뇌를 절약해 주는 대신 여러 동물에서 뇌 조직 섹션 프로토콜. 이 immunohistochemistry 동안 얼룩 가변성을 감소 시키고 감소 시간 cryosectioning 및 이미징.

초록

조직학 및 immunohistochemistry 현미경 해부학 시각화 및 지역화 생물 조직 내의 단백질 분석의 일상적인 방법이 있습니다. 신경 과학, 뿐만 아니라 다른 과학 분야의 과다,이 기술은 사용 됩니다. Immunohistochemistry는 슬라이드 마운트 조직 또는 부동성 섹션에서 수행할 수 있습니다. 샘플 슬라이드 마운트 준비 시간 집중적인 과정 이다. 다음 프로토콜 기법, Megabrain에 대 한 단일 냉동된 블록으로 여러 두뇌를 결합 하 여 최대 90%까지에 의해 cryosection 및 마운트 뇌 조직에 걸린 시간 감소. 또한,이 기술은 큰 조직화 학적인 학문에서 라운드를 얼룩 사이 본 다양성 감소. 현재 기술에 맞게 최적화 된 설치류 뇌 조직을 사용 하 여 다운스트림 immunohistochemical 분석; 그러나, cryosectioning 사용 하는 다른 과학 분야에 적용할 수 있습니다.

서론

여기, 우리 소설 방법, 우리는 전화 Megabrain, cryosection 여러 설치류 다운스트림 immunohistochemical 절차에 대 한 동시에 두뇌 개발에 대 한 프로토콜을 제시. Megabrain는 여러 동물에서 조직을 포함 하는 단일 슬라이드의 생산 수 있습니다. 이 기술은 9 성인 쥐 반구, 또는 5 성인 전체 두뇌에서 코로나 섹션을 동시에 최적화 되었습니다. 따라서, 기술은 가장 큰 immunohistochemical 연구 또는 동물의 대규모 코 호트에서 슬라이드 탑재 뇌 조직에서 수행 하는 다른 분석에 적용 됩니다.

Immunohistochemistry 이해 하 고 그들의 표현과 특정 조직^1,2,3세포 변화 특성 관심사의 단백질에 대하여 지시 하는 특정 항 체의 사용을 포함. Immunohistochemistry의 사용은 뇌⁴의 세포 및 분자 이해에 은닉, 다른 과학 분야 중 신경 과학 연구에서 널리 퍼지다. 많은 동물 및 뇌 섹션을 포함 하는 대규모 연구 자원 및 시간 집중 될 수 있습니다. 따라서, 개발 된....

프로토콜

Megabrain 기술은 남성 성인 C57Bl6 마우스⁵, 청소년 Sprague-Dawley 쥐, 및 transcardially 다음 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) x 1 끼얹는다 했다 성인 Sprague-Dawley 쥐에서 hemisected 및 전체 두뇌를 사용 하 여 최적화 된 4% paraformaldehyde⁶으로. 유사한 결과 쥐와 쥐, 남녀 모두에서 그리고 다른 연령대의 다른 긴장에 수행할 수 있습니다. 이 원고에 대 한 데이터를 생성 하는 연구 청소년 Sprague-Dawley 쥐를 사용 하 고 아리조나 대학 제도 동물 보호와 사용 위원회에 의해 승인 되었다 실험 동물 관리에 대 한 가이드 및 실험실 사용에 따라 치료를 받았다 동물⁷.

1입니다. Cryoprotection 끼얹는다 두뇌의

1. 다음 성공적인 transcardial 관류⁶, 동물에서 전체 뇌^6,8 을 수집 하 고 24 시간에 대 한 PBS에 4 %paraformaldehyde ....

결과

이 절차에 긍정적인 최종 결과 거품 또는 동결 된 방향에서 눈물 없이 슬라이드에 있는 조직. 조직 섹션 OCT에서 뇌와 그림 1에서 시연으로 좋은 표기법의 좋은 배치로 인 떨어져 고 쉽게 식별 분포 균등 하 게 됩니다. 뇌 조직의 비슷한 나이의 동물에서 수집 된 고 조직 OCT에 맞춘 제대로 된 슬라이드에서 수집 하는 섹션 동물 사이 뇌 영역의 비교 수 있도록 비슷한 코로나 비행기를 나타내야 합니다. 조직은 고정, 최소한 동결 유물으로는 H & E 얼룩⁹cryoprotection 품질 평가 하기 위해 밖으로 수행할 수 있습니다. 그림 6에 표시 된 얼룩과 같이 Immunohistochemistry 밖으로 수행할 수 있습니다.

토론

그것은 고려 되어야 한다이 절차 동안에 그는 Megabrain와 그 주변 온도 지속적으로 모니터링 해야 녹고 고 다시 조직의 동결을 방지 하기 위해. 뇌만 제거할 수 있습니다-20 ° C 냉동 고에서 최대를 3 번으로 때마다 그것을 건드리지 cryostat 따뜻한 변동 온도, 조직에에서 녹아서 왼쪽과 refreezes, 텍스처 및 비정상적인 조직의 무결성¹⁰같은 젤리를 일으키는. 따라서, 그것은 Megabrain를 모두 한 번에 잘라 최적입니다.

조직 고정 및 cryoprotection을 얼음 결정 형성을 최소화, 줄이고 외부 미생물 성장, 효소 반응, 조직의 무결성¹⁰을 보존 함으로써 중지이 프로토콜의 핵심 부분입니다. 두뇌 자당과 cryoprotected 하지 않습니다, 다음 조직 내의 물 과정에서 동결 조직 분쇄기 고 구멍 형태에 있는 얼음 결정 형성할 수 있다. TBS에서 자당의 직렬 희.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
앤드윈 사이언티픽 티슈-텍 CRYO-OCT 컴파운드 (12개입)	피셔 사이언	14-373-65
써모 사이언티픽 샨돈 필-어-웨이 일회용 임베딩 몰	피셔 사이언티	18-41
피셔브랜드 고정밀 스트레이트 브로드 스트롱 포인트 핀셋/집게	피셔 사이언티픽	12-000-128
피셔브랜드 20 mL HDPE 신틸레이션 바이알 포함 폴리프로필렌 캡	Fisher Scientific	03-337-23
자당, 폴리 병 2.5kg	Fisher Scientific	S2-212	15% 및 30% 자당 농도를 모두 구성해야 합니다.
2-메틸부탄 (인증), 피셔 케미컬	피셔 사이언티픽	O3551-4
PYREX 톨-폼 비커	피셔 사이언	02-546E
피셔브랜드 범용 액체-인-글라스 부분 침수 온도계 (-50 to +50 ° C)	피셔 사이언티픽	13-201-642
피셔브랜드  Scoopula 주걱	Fisher Scientific	14-357Q
STANLEY 면도날	Grainger	4A807
Edge-Rite 마이크로톰 블레이드	Fisher Scientific	14-070-60
현미경 슬라이드 (1" 서리) - 흰색	Fisher Scientific	22-034-979
Gibco  PBS (Phosphate Buffered Saline) 10X, pH 7.2	Fisher Scientific	70-013-032	사용 전에 1X로 희석하십시오
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