여러 설치류 두뇌의 동시 Cryosectioning

요약

여기, 선물이 동결 하 고 처리 한 두뇌를 절약해 주는 대신 여러 동물에서 뇌 조직 섹션 프로토콜. 이 immunohistochemistry 동안 얼룩 가변성을 감소 시키고 감소 시간 cryosectioning 및 이미징.

초록

조직학 및 immunohistochemistry 현미경 해부학 시각화 및 지역화 생물 조직 내의 단백질 분석의 일상적인 방법이 있습니다. 신경 과학, 뿐만 아니라 다른 과학 분야의 과다,이 기술은 사용 됩니다. Immunohistochemistry는 슬라이드 마운트 조직 또는 부동성 섹션에서 수행할 수 있습니다. 샘플 슬라이드 마운트 준비 시간 집중적인 과정 이다. 다음 프로토콜 기법, Megabrain에 대 한 단일 냉동된 블록으로 여러 두뇌를 결합 하 여 최대 90%까지에 의해 cryosection 및 마운트 뇌 조직에 걸린 시간 감소. 또한,이 기술은 큰 조직화 학적인 학문에서 라운드를 얼룩 사이 본 다양성 감소. 현재 기술에 맞게 최적화 된 설치류 뇌 조직을 사용 하 여 다운스트림 immunohistochemical 분석; 그러나, cryosectioning 사용 하는 다른 과학 분야에 적용할 수 있습니다.

서론

여기, 우리 소설 방법, 우리는 전화 Megabrain, cryosection 여러 설치류 다운스트림 immunohistochemical 절차에 대 한 동시에 두뇌 개발에 대 한 프로토콜을 제시. Megabrain는 여러 동물에서 조직을 포함 하는 단일 슬라이드의 생산 수 있습니다. 이 기술은 9 성인 쥐 반구, 또는 5 성인 전체 두뇌에서 코로나 섹션을 동시에 최적화 되었습니다. 따라서, 기술은 가장 큰 immunohistochemical 연구 또는 동물의 대규모 코 호트에서 슬라이드 탑재 뇌 조직에서 수행 하는 다른 분석에 적용 됩니다.

Immunohistochemistry 이해 하 고 그들의 표현과 특정 조직^1,2,3세포 변화 특성 관심사의 단백질에 대하여 지시 하는 특정 항 체의 사용을 포함. Immunohistochemistry의 사용은 뇌⁴의 세포 및 분자 이해에 은닉, 다른 과학 분야 중 신경 과학 연구에서 널리 퍼지다. 많은 동물 및 뇌 섹션을 포함 하는 대규모 연구 자원 및 시간 집중 될 수 있습니다. 따라서, 개발 된 Megabrain의 다각적인 근거 있다: 시간을 줄이기 위해 cryosectioning, 장착, 그리고 결과적으로 더 적은 시 약을 사용 하는 동안 조직, 얼룩을 보냈다. 또한, 프로세스를 간소화 하 고 얼룩 같은 여러 두뇌의 수 라운드 배치, immunohistochemistry³의 한계를 얼룩 사이 가변성의 일부를 완화 하는 데 도움이. 또한,는 Megabrain 단면 단면 개별 냉동된 설치류 두뇌에 시간 절약 대안 이다 하며 동물이 나 심지어 치료 그룹 사이 조직의 빠른 비교를 위해 현미경 검사 법 기술로

프로토콜

Megabrain 기술은 남성 성인 C57Bl6 마우스⁵, 청소년 Sprague-Dawley 쥐, 및 transcardially 다음 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) x 1 끼얹는다 했다 성인 Sprague-Dawley 쥐에서 hemisected 및 전체 두뇌를 사용 하 여 최적화 된 4% paraformaldehyde⁶으로. 유사한 결과 쥐와 쥐, 남녀 모두에서 그리고 다른 연령대의 다른 긴장에 수행할 수 있습니다. 이 원고에 대 한 데이터를 생성 하는 연구 청소년 Sprague-Dawley 쥐를 사용 하 고 아리조나 대학 제도 동물 보호와 사용 위원회에 의해 승인 되었다 실험 동물 관리에 대 한 가이드 및 실험실 사용에 따라 치료를 받았다 동물⁷.

1입니다. Cryoprotection 끼얹는다 두뇌의

1. 다음 성공적인 transcardial 관류⁶, 동물에서 전체 뇌^6,8 을 수집 하 고 24 시간에 대 한 PBS에 4 %paraformaldehyde 25 mL 유리병에 배치 하 여 수정 후.
   주의: Paraformaldehyde은 독성 조직 정착 제; 관심을가지고 처리 합니다. 농도 화학 증기 두건 안쪽 볼륨을 식별 하는 구체적으로 레이블이 지정 된 폐기물 컨테이너로 paraformaldehyde 전송 및 저장소 캐비닛 화학 안전 하거나 제대로 처분 될 때까지 화학 폐기물에 직원을 훈련 하는 다음.
2. 증기 두건에서 24 시간 경과한 후 주걱을 사용 하 여 4 %paraformaldehyde 머리를 제거 합니다. 뇌 (약 24 h) 유리병의 바닥에 싱크 될 때까지 1 x Tris 버퍼 염 분 (TBS)에서 15% 자당 해결책의 약 20 mL의 유리병으로 두뇌를 전송 합니다.
3. 뇌 (약 24-48 h) 유리병의 바닥에 싱크 될 때까지, 1 x TBS에서 30% 자당 해결책의 약 20 mL의 유리병에 두뇌를 전송 합니다.

2. 뇌 동결

1. 드라이 아이스는 얼음 양동이에 침대에 500 mL 유리 비 커를 놓습니다. Isopentane (2 메 틸-부탄)의 300-400 mL 유리 비 커에 붓으십시오.
2. -45 ° C와-50 ° C 사이 도달 isopentane의 온도가 밀접 하 게 모니터 하 고 그것을 유지 하는 절차를 통해 일정 한 온도계로이 온도 범위를 유지. 온도 판독 솔루션, 그리고 하단 또는 비 커의 측면을 감동 하는 동안 하지 중간에서 가져옵니다 확인 하십시오.
3. 벤치탑에 채우기 포함 형 일회용 (자료 목록 참조) 최적의 절삭 온도의 약 1/2 전체 (OCT; 참조 테이블의 자료) 화합물. OCT에서 아무 공기 방울 인지 확인 합니다. 어떤 기포 주걱 또는 바늘 제거 경우에.
4. 주걱으로 30% 자당의 유리병에서 첫 번째 뇌를 제거 합니다. 이 시점에서, 하나는 두뇌 전체 또는 hemisect, 연구 설계에 따라 고정.
   1. Hemisected 두뇌 반구를 분리 하기 위하여 조직을 통해 깨끗 한 컷을 만들기 위해 새로운 면도날을 사용 합니다. 연구에 대 한 필요 하지 않은 경우이 단계에서 소 뇌 및 후 각 전구를 제거 합니다. 소 뇌 연구에 대 한 필요, 그것은 금형에서 똑바로 서에서 뇌를 돕기 위해 두뇌의 뒤 끝에 평면 영역을 잘라 좋습니다. 연구만 필요한 경우 지역화 된 지역에서 조직, 알려진된 좌표에 따라 뇌를 차단 하는 설치류 두뇌 매트릭스를 사용할 수 있습니다.
5. 두뇌 시스템 이름을 지정 하는 숫자를 제공 합니다. 그림 1과 같이 다이어그램을 그립니다. 첫 번째 뇌의 위치 2, 위치 1 두뇌 동결 된 방향의 빠른 식별에 도움을 빈 공간으로 두고 있는 Megabrain 형에 배치의 번호를 작성 합니다.
6. 위치 1에 배치 하는 두뇌를 데리 using 무딘 집게 또는 핀셋. 첫 번째 위쪽으로 향하게 잘라 면 뇌를 방향을 정하십시오. 그것은 의미 하지 독립적으로 때까지 그것의 위치를 조정 하는 핀셋을 사용 하 여 적절 한 위치에 OCT로 뇌에 낮은.
7. 2.3-2.5 위치 3-10에에서 동결을 나머지 두뇌/반구에 대 한 단계를 반복 합니다. 두뇌/반구 대칭 레이아웃에 배치 하지 마십시오.
8. Megabrain 금형에서 모든 9 머리를 검토 합니다. 두뇌를 독립적으로 서는, 일단 바르고 올바르게 지향 oct ( 그림 2B에서 같이), 더 많은 10 월 금형에 (때까지 추가 두뇌 위에 덮여 있다). 다시, OCT에서 볼 수 없는 기포 인지 확인 합니다.
9. 집게는 집게 할 하지 될 부분에 빠져들 OCT (그림 3A) 보장 형의 모서리를 사용 합니다. Isopentane (-45 ° C-50 ° C ~)으로 금형을 낮은 주의 형 수준을 유지 하 되 되도록 바닥의 세 번째 금형 빠져들. 잡고 여기 표면 및 조직 (그림 3B)에서 상승 하는 OCT에서 모든 거품을 허용 하도록.
10. 30 후 s, 낮은 isopentane는 Megabrain를 떠나 집게에서 방출에 전체 금형 빠져들 적어도 3 분 (그림 3C). 그래서 두뇌 유지 직 립 하 고 동일한 금형 수준 유지 되도록 (그림 3D).
11. 3 분 후 사용 10 월 냉동, 포함 된 몰드를 제거 하는 집게는 isopentane에서 두뇌 (그림 3E)를 포함합니다.
12. 즉시, 금형 및 그 내용을 알루미늄 호 일에 포장 및 동물 숫자 또는 Megabrain 식별 레이블. 직물을 녹고 방지 하려면 가능한 한 아껴 언된 Megabrain을 터치 합니다.
13. 이 Megabrain 이제는-20 ° C 냉동 고로 전송 하 고 24 h의 최소 저장 수 있습니다.
    참고: 프로토콜 일시 중지할 수 있습니다 여기 하 고는 Megabrain cryosectioning 수행 될 때까지 냉동 저장 될 수 있다.

3. 준비 하 고 있는 Megabrain는 Cryostat에 단면에 대 한

1. -19 ° c는 cryostat의 캐비닛 온도 설정 계속 하기 전에이 온도 도달할 다는 것을 확인 하십시오. 단면, 전체 캐비닛 온도-18 ℃와-20 ° C 사이 유지 하는 것을 확인합니다
2. -20 ° C 냉동 고에서는 Megabrain를가지고 고는 cryostat에 배치. 또한,는 cryostat에 적절 한 크기 차원 및 두 개의 얇은 끝된 페인트 용의 척을 놓습니다. Cryostat는 cryostat의 온도에 서 적어도 15 분 동안에 Megabrain와는 척을 남겨 주세요.
3. Megabrain 식별 번호와 슬라이드 번호 슬라이드를 레이블을 적절 하 게. 이러한 슬라이드 슬라이드 따뜻한 (35-45 ° C)에 누워.
4. 알루미늄 호 일에서 Megabrain 풀 면도날을 사용 하 여 수직 형 (그림 4A)에서 10 월의 블록의 쉬운 제거를 허용 하도록 금형의 모서리를 잘라.
5. 10 월의 얇은 층 (대략 3 밀리미터 두꺼운)는 척에 분배.
6. 신속 하 게, 손가락 및 OCT 사이의 최소한의 접촉으로 원하는 방향에 척에는 Megabrain를 놓습니다. 셉 해빙을 최소화 하기 위해이 단계에 대 한 사용할 수 있습니다. 섹션, 두고는 Megabrain를 시작 하기 전에 완전히 동결 OCT 있도록 15-20 분 동안 cryostat에서 척을 탑재.
7. 일단 10 월의 기본 레이어, 냉동는 Megabrain의 측의 주위에 10 월 2 m m 두꺼운 레이어를 적용 하 고 물림 쇠에 측면에서 실행이. 안전 물림 쇠를 Megabrain 수 있습니다. 다시, 계속 하기 전에 동결 OCT 있도록 15-20 분 동안 cryostat에 탑재 Megabrain 척을 둡니다.
8. 면도날을 사용 하 여 모든 초과 10 월 척 (그림 4B)의 하단 또는 측면에서 제거.

4입니다. Cryosectioning는 Megabrain

1. 시작 하기 전에, 최소한 20 mL 1 x PBS를 포함 하는 비 커 액세스할 수 인지 확인 합니다.
2. 척, Megabrain, cryostat (그림 4B)에 척 머리에 탑재 위치.
3. 원하는 두께에서 잘라 cryostat을 설정 합니다. 현재 방법론은 10 µ m 50 µ m 섹션에 대해 최적화 되었습니다.
4. 트림 OCT 및 조직 조직 컬렉션 (그림 4C)에 대 한 원하는 뇌 영역에 도달 하는 데 필요한.
5. 때 조직 수집, 안티 롤 접시까지 단계에 달려있다 낮은 고 cryostat 단일 섹션을 준비. 천천히 들어 sectioned Megabrain 안티 롤 플레이트에 연결 되어 있지와 무대 그림 4D가 되지 않습니다 조심 안티 롤 접시에서).
6. 부드럽게 페인트 용을 사용 하 여 (그림 5A) cryostat 무대에 평평 거짓말까지 Megabrain 섹션을 풀 다. (필요한 경우, 개최 OCT 롤링을 방지 하기 위해 페인트 용을 사용 하 여 평면).
7. 따뜻한 슬라이드에서 슬라이드를 제거 하 고 슬라이드, 슬라이드에 충실 하려면 섹션을 허용 하는 무대에서 Megabrain 섹션, 레이블 면 가져가.
8. 신속 하 게 슬라이드에 각 조직 섹션을 1 x PBS의 한 방울을 적용 하 고이 닦 았을 그들이 평면 때까지 건조를 허용 하지 않습니다 (단계 4.9 참조).
9. 1 x PBS에 잘 끝된 붓을 사용 하 여 조직에 어떤 거품 밖으로 솔 질 하 고 그래서 (그림 5B) 슬라이드에 평평 거짓말 조직 전개. 알아서 하지 뇌 섹션의 위치를 변경 하 고 따라서 다른 조직 섹션에 상대적 위치를 잃게. 눈물을 피하기 위해 주의 조직을 조작 합니다. 계속 슬라이드의 가장자리 떨어져 뇌 섹션 주변 공간은 coverslip 및 일부 얼룩 프로토콜에 PAP 펜 응용 프로그램에 필요한.
10. 따뜻한 고 건조 45 분 커버 조직에 정착에서 먼지를 방지 하기 위해 필요에 따라 슬라이드 뒤에 슬라이드를 놓습니다. 일단 건조, 추가 사용까지-80 ° c에 슬라이드를 저장 합니다.

결과

이 절차에 긍정적인 최종 결과 거품 또는 동결 된 방향에서 눈물 없이 슬라이드에 있는 조직. 조직 섹션 OCT에서 뇌와 그림 1에서 시연으로 좋은 표기법의 좋은 배치로 인 떨어져 고 쉽게 식별 분포 균등 하 게 됩니다. 뇌 조직의 비슷한 나이의 동물에서 수집 된 고 조직 OCT에 맞춘 제대로 된 슬라이드에서 수집 하는 섹션 동물 사이 뇌 영역의 비교 수 있도록 비슷한 코로나 비행기를 나타내야 합니다. 조직은 고정, 최소한 동결 유물으로는 H & E 얼룩⁹cryoprotection 품질 평가 하기 위해 밖으로 수행할 수 있습니다. 그림 6에 표시 된 얼룩과 같이 Immunohistochemistry 밖으로 수행할 수 있습니다.

토론

그것은 고려 되어야 한다이 절차 동안에 그는 Megabrain와 그 주변 온도 지속적으로 모니터링 해야 녹고 고 다시 조직의 동결을 방지 하기 위해. 뇌만 제거할 수 있습니다-20 ° C 냉동 고에서 최대를 3 번으로 때마다 그것을 건드리지 cryostat 따뜻한 변동 온도, 조직에에서 녹아서 왼쪽과 refreezes, 텍스처 및 비정상적인 조직의 무결성¹⁰같은 젤리를 일으키는. 따라서, 그것은 Megabrain를 모두 한 번에 잘라 최적입니다.

조직 고정 및 cryoprotection을 얼음 결정 형성을 최소화, 줄이고 외부 미생물 성장, 효소 반응, 조직의 무결성¹⁰을 보존 함으로써 중지이 프로토콜의 핵심 부분입니다. 두뇌 자당과 cryoprotected 하지 않습니다, 다음 조직 내의 물 과정에서 동결 조직 분쇄기 고 구멍 형태에 있는 얼음 결정 형성할 수 있다. TBS에서 자당의 직렬 희...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
앤드윈 사이언티픽 티슈-텍 CRYO-OCT 컴파운드 (12개입)	피셔 사이언	14-373-65
써모 사이언티픽 샨돈 필-어-웨이 일회용 임베딩 몰	피셔 사이언티	18-41
피셔브랜드 고정밀 스트레이트 브로드 스트롱 포인트 핀셋/집게	피셔 사이언티픽	12-000-128
피셔브랜드 20 mL HDPE 신틸레이션 바이알 포함 폴리프로필렌 캡	Fisher Scientific	03-337-23
자당, 폴리 병 2.5kg	Fisher Scientific	S2-212	15% 및 30% 자당 농도를 모두 구성해야 합니다.
2-메틸부탄 (인증), 피셔 케미컬	피셔 사이언티픽	O3551-4
PYREX 톨-폼 비커	피셔 사이언	02-546E
피셔브랜드 범용 액체-인-글라스 부분 침수 온도계 (-50 to +50 ° C)	피셔 사이언티픽	13-201-642
피셔브랜드  Scoopula 주걱	Fisher Scientific	14-357Q
STANLEY 면도날	Grainger	4A807
Edge-Rite 마이크로톰 블레이드	Fisher Scientific	14-070-60
현미경 슬라이드 (1" 서리) - 흰색	Fisher Scientific	22-034-979
Gibco  PBS (Phosphate Buffered Saline) 10X, pH 7.2	Fisher Scientific	70-013-032	사용 전에 1X로 희석하십시오
15개의 세밀한 페인트 브러시	아마존	B079J12ZRV
PAP 펜	abcam	ab2601
척 그림 4에 나와 있는 이 제품은 실험실 기술자에 의해 맞춤 제작되었지만, 다른 회사에서 상업적으로 주문할 수 있는 유사한 크기도 가능합니다.	전자 현미경 과학	EMS065