절연 Glomeruli와 비보에 사 세포 표면 단백질의 라벨

요약

여기 선물이 murine 비보에 biotin과 사 세포 표면 단백질의 라벨에 대 한 프로토콜. 이 프로토콜은 마우스 신장 perfuse glomeruli, 격리 하 고, 관심사의 단백질의 생 immunoprecipitation를 수행 하는 방법에 대 한 정보를 포함 합니다.

초록

Proteinuria fenestrated endothelium, 사 지하실 막 그리고 podocytes 그들의 슬릿 격 막으로 구성 된 사 필터의 붕괴에서 유래한 다. 사 필터, 특히 슬릿 격 막의 섬세 한 구조는 다양 한 세포 표면 단백질의 상호 작용에 의존합니다. 공부 하는이 세포 표면 단백질은 생체 외에서 연구 또는 조직학 분석을 제한 되었습니다 지금까지. 여기, 우리 murine vivo에서 biotinylation 라벨 생리 및 pathophysiologic 조건 사 세포 표면 단백질의 연구를 수 있는 방법 제시. 이 프로토콜은 마우스 신장 perfuse glomeruli, 격리 하 고, 관심사의 단백질의 생 immunoprecipitation를 수행 하는 방법에 대 한 정보를 포함 합니다. 사 셀 표면 풍부의 반 정량이 새로운 방법, 그리고 모든 단백질 biotin 관류에 액세스할 수와 함께 쉽게 사용할 수 이며 immunoprecipitation 공부 될 수 있다. 또한, 격리 또는 biotinylation 없이 glomeruli의 기본 사 세포 배양 (즉, 기본 podocyte 세포 배양) 뿐만 아니라 사 RNA와 단백질의 분석을 추가 있습니다.

서론

Proteinuria 사 상해의 상징 이며 일반적으로 사 필터¹의 장애를 동반 한다. 사 필터 fenestrated endothelium, 사 지하실 막, 및 podocytes 구성 됩니다. 사 필터의 섬세 한 분자 구조는 매우 역동적이 고 모두 건강 하 고 병에 걸린 신장^{2,3,,45,6에에서 거래 하는 세포 표면 단백질에} . 세포 표면 단백질 endocytosis podocytes⁷의 생존을 위해 필수적인 것으로 표시 되었습니다. Nephrin와 podocalyxin는 막 횡단 단백질 podocytes에 표현. Podocalyxin은 sialoglycoprotein podocytes^8,,910의 보조 발 프로세스 코팅 Nephrin은 사 슬릿 격 막의 중추 이다. Endocytic 매매 이전 표시 되었습니다 nephrin와 podocalyxin^{3,11,12,,1314}에 대 한.

우리의 지식의 베스트에 세포 표면 단백질 endocytosis 하지 아직 설명 하고있다 문학에서 사 내 피 세포에. 그러나, 내 피 세포는 일반적 endocytosis (즉, clathrin 종속, 뗏목 종속 endocytosis)^15,16의 다른 종류에 대 한 모든 필요한 단백질을 표현 한다. 따라서, 내 피 세포 표면 매매 수로 공부 될이 메서드를 사용 하 여, 예를 들어 혈관 내 피 (VE)-cadherin 및 세포내 접착 분자 (ICAM-2) 셀으로 표면 사 내 피 세포¹⁷ 마커 단백질 .

불행히도, 아니 정확 하 게 체 외에서 모델 필터에 대 한 섬세 한 3 계층화 사 어느 셀에 표면 단백질 매매 공부 될 수 있다 이다. 이 방법의 목표는 이렇게 사 단백질 밀매 vivo에서공부 하. 또한,이 프로토콜 glomeruli, 추가 분석 사 RNA, 단백질, 세포의 활성화를 격리 하는 방법에 대 한 정보를 포함 합니다. 유사한 사 격리 기법으로 다른 설명 되었습니다^18,19그룹화 합니다.

이전에 우리와 다른 비보 전 사 세포 표면 단백질의 biotinylation^2,,34,,2021에 의해 라벨 사용 했습니다. 그러나,이 비보 전 방법, 격리 glomeruli endocytic 인신 매매에 영향을 미칠 수 있습니다 기계적 스트레스에 노출 되었다. 또는, 사 세포 표면 단백질의 면역 형광 라벨은 광범위 하 게 사용 되었습니다 문학^2,20,22에. 그러나이 방법으로 단백질 수가 적은 하나의 슬라이드 내에서 분석 될 수 있다, 그리고 면역 형광 이미지의 정량은 종종 어려운.

사 세포 표면 단백질 풍부 하 고 매매 정확 하 게에 건강 하 고 병에 걸린 신장, 공부를 신뢰할 수 있는 도구를 제공 하는이 소설은 vivo에서 방법 그리고 면역 형광 시험에 추가로 사용할 수 있습니다.

프로토콜

마우스는 프랑스에서 1 월 실험실 또는 현지 동물 보호 시설에서 자체 품종으로 획득 했다. 조사 관리 및 실험 동물 사용 (미국 국립 연구소의 건강 게시 번호 85-23, 개정 1996)에 대 한 가이드에 설명 된 지침에 따라 실시 했다. 모든 동물 실험 관련 기관 승인에 따라 수행 했다 (주 정부 LANUV 참조 번호 AZ:84-02.04. 2016.A435)입니다.

1. 악기, 솔루션, 및 장비 준비

1. 1mm 염화 마그네슘 (MgCl₂)과 0.1 m m 칼슘 염화 물 (CaCl₂) 보충 버퍼링 인산 염 분의 1 L를 준비 (PBSCM) 하 고 살 균 필터를 통해 필터링.
2. 관류에 대 한 마우스 당 살 균 PBSCM의 5 mL을 준비 하 고 얼음에 그것을 배치.
3. 각 마우스에 대 한 살 균 PBSCM 0.5 mg/mL 비오 틴 보충의 5 mL을 준비 합니다.
4. 각 마우스에 대 한 살 균 PBSCM의 5 mL을 준비 하 고 10⁸ 자석 구슬 x 0.8을 추가 (예. 200, 전처리 없이 4 × 10⁸ 구슬/mL 해결책의 µ L)는 glomeruli의 색전술에 대 한. 원래 관 살 균 자석 구슬을 유지 하기 위해 셀 문화 벤치에서이 솔루션을 준비 합니다. 얼음에이 솔루션을 배치 합니다.
5. PBSCM (5 mL 당 마우스)를 100 mM 글리신을 추가 하 여 냉각 솔루션을 준비 하 고 얼음에 그것을 유지.
6. 콜라 솔루션 (0.378 U/mL 콜라 A 메 마른 PBSCM에) 확인 합니다. 마우스, 당 2 mL 튜브에 콜라 솔루션의 1 mL를 플라스틱 하 고 얼음에 그것을 놓습니다.
7. 세척, 살 균 PBSCM 준비 (단계 1.1 참조) 50 ml에서 튜브를 얼음에.
8. 관류, 2.0 mL/min의 흐름으로는 주사기 펌프를 사용 합니다.
9. 21g 바늘으로 10 mL 주사기를 준비 합니다. 20-30 센티미터 긴 카 테 테 르 바늘의 팁 장소 (내경, ID = 0.58 m m). 카 테 터 연결 (0.58 m m ID) 10cm 짧은 카 테 테 르와 (0.28 m m ID) 마우스 대동맥에 쉽게 삽입에 대 한 간접 작은 카 테 터의 끝을 잘라.
10. 수술 동안에 합자 절차, 잘라 마우스 당 3 5-7 cm 실크 스레드 (6-0 4-0).
11. 수술, 3 수술 클램프, 2 수술가 위, 핀셋 2, 2 고급 핀셋, 1 좋은 위, 및 면봉을 준비 합니다. 마 취 (예: 복 마 취 마 취 제 100 mg/kg bodyweight 및 xylazine 5 mg/kg 체중)을 준비 합니다.
12. 두 개의 신장 glomeruli의 격리, 100 µ m 셀 스 트레이너, 2 개의 50 ml 튜브, 그리고 자석 포 수를 사용 하 여.
13. 세포의 용 해 버퍼 챕 준비: 20 m m 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio]-1-propanesulfonate (챕); 20 mM Tris (hydroxymethyl)-aminomethan (Tris) pH 7.5; 50 m m sodiumchorlide (NaCl); 50 m m sodiumfluoride (NaF); 15 m m 나₄P₂O₇; 0.1 m m Ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) pH 8.0; 2 mM sodiumorthovanadate; 그리고 2 m m adenosinetriphosphat (ATP)입니다.
14. 4 ° c.에 멋진 원심 분리기

2입니다. 수술 현미경

1. Anesthetize는 마우스 (예를 들어, 케 타 민/xylazine와 intraperitoneally, 단계 참조 1.11). 발가락-핀치 테스트 확인 하는 적절 한 마 취를 수행.
2. 70% 소 프로 파 놀과 마우스의 복 부 측을 치료.
3. 흉 골을 골반에서 피부를 통해 중간 컷을 수행 하 고 핀셋을 사용 하 여 복 부 근 막에서 피부를 제거 합니다. 수술가 위로 복 부 중간 양쪽에는 피부를 잘라.
4. 수술 도구를 변경 합니다. 복 부 근육 층을 통해 방광에 칼에서 중간 컷을 적용 하 고 핀셋과 수술가 위를 사용 하 여 4 개의 사분면으로 나눕니다. 마우스의 목 쪽으로 2 개의 외과 클램프와 클램프 상단 두 옆으로 첨부 합니다.
   참고: 복 지금 열립니다.
5. 따로 멸 균 면봉으로 내장 기관 넣고 잘가 위 키 모 인할지 인 대를 잘라.
6. 2 개의 정밀한 핀셋으로 부 신 샘의 높이에 신장 동맥의 근 위 대동맥 주위 (실크 스레드 4-0 6-0)와 함께 결 찰을 준비 합니다. 핀셋으로 혈액 흐름을 폐지 하 고 인접 대동맥 결 찰을 조입니다.
7. 근 막, 지방, 그리고 다른 조직에서 원심 대동맥 및 미세 수술 핀셋을 사용 하 여 신장 동맥의 두개골 키 모/mesenteric 동맥 주위 결 찰을 준비 합니다.
8. 결 찰 (실크 스레드 4-0 6-0)와 원심 대동맥 주위 신장 동맥의를 준비 하 고 분기의 높이에서 베 나 정 맥과 대동맥을 클램프.
9. 작은 구멍으로 잘라 대동맥 원심 신장 동맥에 구멍은 대동맥의 절반 직경. 대동맥으로 카 테 터를 넣고 준비 된 합자와 그것을 해결.
   주의: 공기 색 전 증을 방지 하기 위해 관류 시스템에서 거품을 피하십시오.
10. 2 mL/min의 유량에 얼음 처럼 차가운 PBSCM로 재 관류를 시작 합니다.
11. 미세 수술가 위 신장 동맥의 수준에서 신장 혈관에 구멍을 삭감 하 고 간장 및 mesenteric 동맥 주위 결 찰 조입니다.
    참고: 신장 한다 돌 창백한는 관류를 시작 후.

3. Vivo에서 Biotinylation

1. 변경 차가운 PBSCM를 거품 없는 주사기 0.5 mg/mL biotin 라벨, 표면에 대 한 보충 하 고 신장 2 mL/min의 유량에 5 mL와 함께 perfuse.
   참고: 혼합 PBSCM 솔루션 (예를 들어, 50 mL 튜브 여) 솔루션 내에 거품 형성 방지를 부드럽게. 주사기 내 솔루션의 포부, 후 주사기에서 어떤 거품 또는 공기를 철수. 주사기에 여분의 정 (21 G)를 사용 하 여 정 맥 카 테 터 시스템에 연결 된에서 공간을 채우기 위해. 마지막으로, 거품 없이 카 테 터와 정 맥에 주사기를 스틱.
2. 거품 없는 주사기는 glomeruli 담금질 2 mL/min의 흐름에 5 mL와 함께 perfuse를 100 mM 글리신 보충 차가운 PBSCM 변경 합니다.
3. 변경 차가운 PBSCM를 거품 없는 주사기 200 μ 자석 구슬/mL으로 보충 하 고 신장 2 mL/min에서 perfuse.
   참고: 신장 표면에 갈색 자석 구슬 glomeruli의 색전술 표시 됩니다.

4입니다. 두 개의 신장에서 Glomeruli의 격리

1. 신장은 hilum에서 제거 하 고 캡슐을 제거. 10 cm 세포 배양 접시에 PBSCM의 15 mL에 얼음에 신장을 놓습니다. 신장 수확 후 마 취에서 자 궁 경부 전위와 마우스 안락사 수술 및 관류 절차 마지막 약 20 ~ 22 분.
2. 신장으로 잘라 작은 조각 가능한 새로운 더블 가장자리 칼 날. 콜라 A의 1 mL 2 mL 튜브에 조직 이동 (단계 1.6 참조) 및 30 분 동안 37 ° C에서 다이제스트. 전후 소화, 피 펫 컷 1000 μ와 부드럽게 섞는다.
3. 얼음 처럼 차가운 PBSCM를 사용 하 여 100 μ 셀 스 트레이너를 통해 소화 조직 린스. 부드럽게 셀-스 크레이 퍼를 사용 하 여 나머지 조직 구 유 셀 스 트레이너를 말하다 고 차가운 PBSCM 50 mL의 총 볼륨에 나중에 그것을 씻어.
4. 5 분 제거는 상쾌한 고 resuspend vortexing 펠 릿 하면서 차가운 PBSCM의 약간 미만의 1.5 mL와 펠 릿 4 ° C 500 x g에서 현 탁 액을 원심. 나중에, 새로운 2 mL 튜브에 사 현 탁 액을 넣어.

5입니다. 세척

1. 자석 포 수를 사용 하 여 한쪽에는 glomeruli를 당겨. glomeruli 자석 쪽으로 이동 하기 전에 1 분을 기다립니다.
2. 2 mL 튜브 자석 포 수에 남아 있는 동안 1000 μ 피 펫과 상쾌한을 제거 합니다. 첫 번째 및 두 번째 세척 중 단계 (단계 5.3 참조), 250 μ glomeruli의 손실을 방지 하기 위해 튜브 표면에 뜨는 남아의. 관 구조는 튜브의 바닥에 침 몰 시키는 피하기 위해 신속 하 게이 프로시저를 수행 합니다.
   참고: 세척 절차 오래 지속 됩니다 그렇지 않으면.
3. 자석 포 수에서 2 mL 튜브를 제거 하 고 PBSCM, (매우 중요), 그 아래로 피 펫의 1 mL을 추가 소용돌이.
4. 자석 포 수 튜브를 다시 넣어 고 5.2 단계부터 다시 시작.
5. 세척 단계를 반복 하 여 glomeruli 순도 90%에 도달 했습니다. 이 위해, 현미경 (40-100 X) 상쾌한의 대표적인 약 수를 검사 합니다.
   참고: Glomeruli 갈색 자석 구슬을 포함 하는 둥근 구조로 표시 됩니다. 길쭉한 구조는 관 조각, 그리고 무료 자석 구슬 갈색 둥근 점으로 표시. 셀 파편은 부피가 큰 구조로 나타날 수 있습니다.
6. 순수성에 도달 하면 glomeruli PBSCM의 1 mL에 용 해 하 여 glomeruli의 수를 견적 한다. 혼합 후, 10 μ의 약 수 고 현미경 glomeruli 계산. 다음 방정식으로 glomeruli의 수를 계산: glomeruli의 최종 번호 = 10 μ aliquot x 100에에서 glomeruli의 수.
7. Glomeruli의 성공적인 절연 리드 10000-40000 glomeruli의 범위.

6. 단백질 추출 및 Immunoprecipitation (IP)

1. 6800 x g 5 분에서 4 ° C에서 원심 분리 하 여 수집 glomeruli 자석 포 수를 사용 하는 동안은 상쾌한을 제거 하 고 얼음 세포의 용 해 버퍼에 펠 릿을 resuspend (예., 300 μ; 30000 glomeruli 챕, 단계 1.11 참조). 30에 대 한 최고 속도로 조직 균질 화기와 샘플을 균질 s와 30 분 동안 얼음에 그들을 lyse.
2. 15000 x g 30 분 4 ° c에서 원심 분리 하 여 불용 성 물질을 제거 새로운 1.5 mL 튜브에 lysate 셀을 포함 하는 상쾌한 플라스틱 펠 릿을 삭제 합니다.
3. Bicinchoninic (BCA)를 사용 하 여는 상쾌한의 단백질 농도 측정-제조업체의 지침에 따라 방법을 기반으로. 30000 glomeruli의 성공적인 세포 사 단백질 양의 700-1000 µ g/mL를 생성합니다. 세포의 용 해 버퍼와 동일한 단백질 양을 조정 합니다.
4. 10%에 대 한 전체 볼륨의 약 수를 사가지고 lysate Laemmli + 5 분 동안 부 화 하기 전에 dithiothreithol (DTT) x 2 95 ° c.에 추가
5. IP, 오버 헤드 통에 4 ° C에서 하룻밤 streptavidin agarose 구슬 lysate의 나머지를 품 어.
6. Agarose 구슬 4 ° C에서 3 분 1000 x g에서 원심, 상쾌한, 제거 하 고 씻어 난다 단백질 바인딩 위한 구슬 세포의 용 해 버퍼의 800 μ를 추가.
7. 반복 세척 3 번 하 고는 상쾌한을 완전히 제거.
8. 2x Laemmli + DTT의 30 μ를 추가 하 고 5 분 동안 95 ° C에 품 어.
9. Lysate를 로드 하 고 10 %SDS IP 프로브 젤 70 V 30 분, 다음 20에 SDS 젤을 실행 1.5 헤 대 한 젤 당 mA 나중에, 오 점 200에서 2 h 젤 니트로 멤브레인에 mA.
10. 버퍼를 세척에 니트로 막 5% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)와 4 ° C에서 하룻밤을 차단 합니다.
11. 4 ° c.에서 하룻밤의 항 체를 막 품 어 세척 통에 5 분 동안 3 번 버퍼와 세척 하 고 실 온에서 1 h HRP 태그 이차 항 체를 막 품 어. 세척 단계를 반복 합니다.
12. lysate 시각화 및 CCD 카메라와 슈퍼 해상도 chemiluminescent 에이전트를 사용 하 여 막에 조사 하는 immunoprecipitation 있습니다.

결과

격리 glomeruli 정확 하 게, 먼저 murine 신장 PBSCM와 perfuse 필요가 있다. PBSCM와 관류 신장 창백 (그림 1A) 나타났다. 마그네틱 구슬 glomeruli의 색전술 신장 표면 (그림 1B)에 갈색 점 들으로 표시 됩니다. 자석 포 수와 glomeruli의 절연 오염 신장 tubuli (그림 1C)으로 표시할 수 있습니다. 추가 분석 glomeruli, 전에 glomeruli의 > 95% 순도 glomeruli를 더 철저 하 게 세척 하 여 달성 될 필요가 (그림 1D).

토론

제시 방법 glomeruli 조사 사 RNA 또는 단백질의 성공적인 격리 수 있습니다. 또한, 기본 사 셀 문화 격리 glomeruli에서 수행할 수 있습니다. Biotin 사 격리 하기 전에 적용 되는 경우 사 세포 표면 단백질의 라벨을 수행할 수 있습니다. 이 방법으로, vivo에서 사 세포 표면 단백질 매매 공부 될 수 있다, 그리고 단백질 풍부의 반 정량 가능 합니다. 사 세포 표면 단백질 풍부를 성공적으로 테스트를 위한 가장 중요 한 단계 1는) 마우스 수술 대동맥의 특히 cannulation 수동 전문성 개발, 2) 거품 없는 주사기의 연결의 공기 색전술을 피하기 위하여는 glomeruli, 및 3) 차가운 조건에서 일 하는 관류 PBSCM 함께 시작 했다.

이 기술에 대 한 수동 전문 마우스 수술에 필수적 이다. 대동맥의 cannulation은 특히 중요 한 혈관의 해 부는 신장 관류를 방지할 것 이다. 대동맥에서 컷 충분히 커야 한다 (혈관 직경의 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
마우스 수술 용	Motic SMZ168 BL	Motic	SMZ168BL
KL1500LCD	Pulch 및 Lorenz 현미경	150500	마우스 수술
용 광 Rompun (Xylazin) 2 %	바이엘	PZN : 01320422	마취
Microfederschere	Braun, Aesculap	FD100R	미세 가위, 대동맥
Durotip Feine Scheren	복부 절단을 위한	Aesculap	BC210R
Anatomische Pinzette	Braun, 복	부가 열릴 때까지 수술을 위한	BD215R
Prä 수술용 parierklemme	Aesculap	BJ008R
Seraflex	Serag Wiessner	IC108000	실크 스레드
케타민 10%	Medistar		마취
Rompun (Xylazin) 2%	Bayer		마취
파인 보어 폴리에틸렌 튜빙 ID 0.28mm OD 0.61mm	Portex	800/100/100	카테터
파인 보어 폴리에틸렌 튜빙 ID 0.58mm OD 0.96mm	Portex	800/100/200	카테터
Harvard Apparatus 11 Plus	Harvard Apparatus	70-2209	주사기 펌프
EZ-link Sulfo-NHC-LC-Biotin	Thermo Scientific	21335	비오틴
Dynabeads 비접촉 마우스 T 세포	구체 색전술을 위한	Invitrogen	11413D
콜라겐분해효소 A	Roche	10103578001신	장 조직
DynaMag-2	Invitrogen	123.21D	자석 포수
100µ	사구체 분리를 위한	Greiner-bio	542000
구체 순도를 확인할 수	Axiovert 40 CFL	Zeiss	수 없음
TissueRuptor	Quiagen	9002755	조직 균질화기
CHAPS	Sigma-Aldrich	C3023	용해 완충액
Tris-HCL	Sigma-Aldrich	T5941	완충액
용해 완충액용	NaCl	VWR 화학 물질	27810295
NaF	Sigma-Aldrich	201154	용해 완충액용
EDTA	Sigma-Aldrich	E5134	용해 완충액용
ATP	Sigma-Aldrich	34369-07-8	용해 완충액용
Pierce BCA 단백질 분석 키트	Thermo Scientific	23225	제조업체의 지침을 따르십시오.
nephrin 항체	Progen	GP-N2	for westernblot
Polyclonal goat anti-podocalyxin 항체	R& D Systems	AF15556-SP	for westernblot
Streptavidin Agarose Resin	Thermo Scientific	20347	면역침전
단백질 A 세파로스 CL-4B	GE 헬스케어	17096303	면역침전성
다클론 토끼 anti-p57 항체	SCBT	sc-8298	면역조직화학용
마우스 단클론 항베타 액틴 항체, 클론 AC-74	Sigma-Aldrich	A2228	웨스턴 블롯 로딩 제어
토끼 안티-p44/42	세포 신호	4695	웨스턴 블롯
피어스 고감도 스트렙타비딘-HRP	웨스턴		롯
폴리클론 마우스 ICAM-2 항체	R& 웨스턴		블롯
다클론 마우스 안티 VE-cadherin	R & 웨스턴	블롯용	AF1002