여기에서, 우리는 분자 비콘, 회전 디스크 공초점 현미경 및 오픈 소스 분석을 사용하여 살아있는 Drosophila melanogaster 계란 챔버에서 내인성 mRNA 인신 매매의 시각화, 탐지, 분석 및 추적을위한 프로토콜을 제시합니다. 소프트웨어.
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이 논문에서
요약
초록
형광 기지를 둔 화상 진찰 기술은, 가벼운 현미경 검사법에 있는 발달과 조합하여, 세포 생물학자가 살아있는 세포 화상 진찰 연구 결과를 수행하는 방법 혁명을 일으켰습니다. RNA를 검출하는 방법은 정액 연구 결과 유전자 발현 규칙에 사이트 특정 mRNA 현지화를 연결하기 때문에 크게 확장되었습니다. 동적 mRNA 프로세스는 지금 분자 행동의 동적 범위를 포착하기 위하여 충분히 빠른 현미경 설치와 결합된 mRNA를 검출하는 접근을 통해 구상될 수 있습니다. 분자 비콘 기술은 살아있는 세포에서 내인성 전사체를 직접 검출할 수 있는 혼성화 기반 접근법이다. 분자 비콘은 헤어핀 모양, 내부적으로 담금질, 단일 뉴클레오티드 차별 핵산 프로브이며, 이는 독특한 표적 서열로 혼성화될 때만 형광됩니다. 고급 형광 현미경 검사법 및 고해상도 이미징과 결합할 때, 그들은 mRNA의 세포 내 움직임의 공간적 및 시간적 추적을 수행 할 수 있습니다. 이 기술은 내인성 전사체를 검출할 수 있는 유일한 방법이지만, 세포 생물학자는 살아있는 세포 화상 진찰을 위한 그 같은 탐사기를 디자인하는 어려움 때문에 아직 완전히 이 기술을 받아들이지 않았습니다. 새로운 소프트웨어 애플리케이션인 PinMol은살아있는 세포 내의 mRNA 표적 영역을 효율적으로 혼성화하는 데 가장 적합한 프로브의 향상된 신속한 설계를 가능하게 합니다. 또한 고해상도, 실시간 이미지 수집 및 현재 오픈 소스 이미지 분석 소프트웨어를 통해 정교한 데이터 출력을 통해 mRNA의 수명 주기에 관련된 동적 프로세스의 복잡성을 보다 세밀하게 평가할 수 있습니다.
여기에서 우리는 Drosophila melanogaster 계란 약실에 분자 비콘을 디자인하고 전달하기 위한 포괄적인 프로토콜을 제시합니다. 내인성 모계 mRNAs의 직접적이고 고도로 구체적인 검출 및 시각화는 회전 디스크 공초점 현미경 검사법을 통해 수행됩니다. 이미징 데이터는 Icy 소프트웨어에서 물체 감지 및 추적을 사용하여 처리및 분석되어 oocyte 내의 특수 영역으로 이송되고 국한되는 mRNA의 동적 움직임에 대한 세부 정보를 얻을 수 있습니다.
서론
공간적 및 시간적 해상도로 동적 이벤트를 시각화하는 세포 생물학 연구는 형광 기반 라이브 세포 이미징 기술의 개발에 의해 가능해졌습니다. 현재, 생체 내 mRNA 시각화는 RNA aptamer-단백질 상호 작용, 유기 염료 및 핵산 프로브어닐링 1,2의RNA aptamer 유도 형광에 기초한 기술을 통해 달성된다. 3. 그들은 모두 높은 특이성, 감도 및 신호 대 배경 비율을 제공합니다. 그러나 RNA aptamer 중심 접근법은 광범위한 유전자 조작을 필요로하며, 여기서 이식유전자는 단백질 또는 유기 염료 결합에 필요한 인공 구조 모티브로 RNA를 발현하도록 설계되었습니다. 예를 들어, MS2/MCP 시스템은 박테리오파지 MS2 코트 단백질(MCP)에 대한 결합 서열의 다중 탠덤 반복을 포함하는 RNA 구성을 발현하는 이식유전자의 공동 발현을 필요로 하며, 또 다른 이식유전자는 형광 단백질을 코딩한다. MCP4,5에융합 . 이러한 이차 구조 모티프를 RNA에 첨가하고, 부피가 큰 형광 태그가 붙은 단백질과....
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프로토콜
1. 라이브 셀 이미징을 위한 MB의 설계
-
표적 RNA 서열을 접어 mfold 서버로부터 "RNA 형태"를 사용하여 mRNA 표적의 이차 구조를 예측한다(http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form).
- FASTA 형식으로 대상 시퀀스를 붙여 넣기/업로드하고, 5 또는 10% 하위 최적도(MFE 값의 5 또는 10% 이내로 접는 자유 에너지가 있는 구조)를 선택하고 그에 따라 계산된 폴딩의 최대 개수를 조정합니다(예: 10% 더 큰 크기) 하위 최적성).
참고: MB를 설계할 때 최적 이하의 이차 구조를 포함하면 최소 자유 에너지(MFE) 구조에 대해 예측한 것보다 더 유연하거나 더 단단한 대상 mRNA 내 영역을 식별할 수 있습니다. 라이브 셀 이미징에 적합한 MB의 전반적인 설계. - 800개의 뉴클레오티드(nt)의 mRNA 대상에 대해 "즉각적인 작업"을 선택하거나 801~8,000nt 사이의 mRNA 길이에 대한 "배치 작업"을 간단한 텍스트 파일로 저장합니다.
- FASTA 형식으로 대상 시퀀스를 붙여 넣기/업로드하고, 5 또는 10% 하위 최적도(MFE 값의 5 또는 10% 이내로 접는 자유 에너지가 있는 구조)를 선택하고 그에 따라 계산된 폴딩의 최대 개수를 조정합니다(예: 10% 더 큰 크기) 하위 최적성).
- 1.1단계에서 얻은 "ss-count" 파일을 원하는 매개 변수로 PinMol 프로그램(http....
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결과
PinMol을사용하여, 여러 MB는 하나의 mRNA 표적을 위해 설계될 수 있다(도 1B-C). 합성 및 정제 후, 선택된 MB는 시험관내 분석을 사용하여 특징화되고 비교된다.
도 1: 내인성 mRNA의 살아있는 세포 화상 진찰을 위한 기술 및 조직 설명. (A) 미세 주입에 사용되는 중간 단계 의 초파리 계란 챔버의 묘사. 미세 주입 바늘 (녹색)은 오스카 mRNA에 특이적인 분자 비콘의 칵테일을 제공합니다. 간호사 세포에 .......
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토론
Drosophila 계란 챔버에서 내인성 mRNA 인신 매매의 라이브 시각화는 이제 PinMol 소프트웨어로 쉽게 설계 할 수있는 특정, 효율적이고 뉴클레아제 내성 MBs의 사용에 의존합니다. MB는 표적 mRNA(바람직하게는 이차 구조가 없는 영역) 내에서 고유한 서열을 검출하도록 설계된 특정 프로브로서, 전사체의 고도로 해결된 검출이 가능하다. 다른 조직/세포 유형에 대해 이 기술/프로토콜을 채택할 때 유일한 제한사항은 관심 있는 표본에 대한 MB 전달의 효율성입니다. 다른 접근법은 하나의 표적 mRNA(예를 들어 MS2/MCP 시스템)를 시각화하기 위해 형광 단백질로 태그된 aptamer 및 RNA 결합 단백질을 발현하기 위해 조직의 유전자 조작을 필요로 하지만, 다중화는 최대 2개의 전사체에 대해 가능하다. MB 기술은 살아있는 세포에 있는 내인성 mRNAs를 검출하기 위한 단독으로 서 있고, 2개 이상의 mRNA 종의 공동 시각화를 허용하는 유일한 기술입니다.
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공개 사항
저자는 공개할 이해상충이 없습니다.
감사의 글
우리는 합성, 라벨링 및 분자 비콘의 정화에 대한 살바토레 A.E. 마라스 (공중 보건 연구소 센터, 럿거스 대학) 감사, 다니엘 세인트 존스턴 (거든 연구소, 케임브리지 대학) 오스카-MS2 / MCP-GFP 형질 전환 플라이 스톡. 이 작품은 국립 과학 재단 경력 상 1149738 및 DPB에 전문 직원 의회 - CUNY 상에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 분광 형광계 | Fluoromax-4, Horiba-Jobin, Yvon | n/a | 광자 계수 분광량계 |
| 석영 큐벳 | Fireflysci (구 Precision Cells, Inc.) | 701MFL | |
| Dumont #5 핀셋 | World Precision Instruments | 501985 | 얇은 핀셋은 개별 난자를 분리하는 데 매우 중요합니다. |
| 할로카본 오일 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | |
| Cover slip No.1 22 mm x 40 mm | VWR | 48393-048 | |
| 해부 현미경 | Leica MZ6 Leica Microsystems Inc. | 없음 CO | |
| 2 초파리 마취 패드 | Genesee Scienific | 59-114 | |
| Tris-HCL pH 7.5 | Sigma-Aldrich | 1185-53-1 | |
| 염화마그네슘 | Sigma-Aldrich | 7791-18-6 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| 회전 디스크 컨포칼 현미경 | Yokogawa CSU 10 회전 디스크가 장착된 Leica DMI-4000B 도립 현미경 Leica Microsystems Inc. | 해당 사항 없음 | |
| Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD 카메라 | Hamamatsu | 해당 없음 | |
| PatchMan NP 2 Micromanipulator | Eppendorf Inc. | ||
| FemtoJet 마이크로인젝터 | Eppendorf Inc. | ||
| 주삿바늘: Femtotips II | Eppendorf Inc. | ||
| 로딩 팁: 20 μ L 마이크로로더 | Eppendorf Inc. | ||
| 마이크로 커버 안경 번호 1 또는 1.5, 22 mm x 40 mm | VWR | 48393-026; 48393-172 | |
| 드라이 이스트 | 모든 식료품 점 | 없음 | |
| 컴퓨터, > 20 GB RAM | 대부분의 컴퓨터에서 처리를 수행 할 수 있지만 더 높은 기능으로 처리 속도가 빨라집니다. |
참고문헌
- Tyagi, S. Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells. Nature Methods. 6 (5), 331-338 (2009).
- Bao, G., Rhee, W. J., Tsourkas, A. Fluorescent probes for live-cell RNA detection. Annual Reviews of Biomedical Engineering. 11
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재인쇄 및 허가
