재조합 막 단백질의 양성자 회전율을 분석하기 위한 Micro-agar Salt Bridge 전극

막 단백질은 알려진 모든 제약 약물의 최대 60%를 표적으로 합니다¹. 멤브레인 단백질의 전기생리학적 측정은 멤브레인 캐리어 단백질에 의해 매개되는 기질의 전기적 전달을 분석하기 위한 강력하면서도 섬세한 도구입니다. 정전압 또는 전압 램프의 적용에 의한 막관통 전류의 변조를 통해 캐리어의 약리학적 및 물리적 특성(예: 기질 또는 수송 역학에 의한 활성화 및 억제)을 평가할 수 있습니다. 특히 흥미로운 것은 기질 회전율(pile turnover number)인데, 이는 시간 단위당 막 단백질에 의해 전위된 기질의 양을 표시합니다. 이는 다양한 막 단백질의 동역학을 비교할 때 중요한 매개변수입니다. 멤브레인을 가로질러 하전된 기판의 농도 구배를 설정하면 기판의 회전율 수가 추론되는 기전력이 생성됩니다.

AgCl 전극을 사용하여 염화물이 없는 버퍼가 있으면 전극 전위를 변경하고 전류-전압 측정의 이동을 유발하는 확산 전위가 생성됩니다². 항상 존재하지만 이러한 매개변수는 전류-전압 기록(컨덕턴스)의 기울기에 따라 달라지거나 전위를 상쇄하는 단일 기록(용량)의 차이이기 때문에 표준 컨덕턴스 및 용량 측정에는 무시할 수 있습니다. 그러나, 기판의 수송에 의해 생성되는 역전위의 기록은 확산 전위에 의해 크게 방해받을 수 있습니다. 따라서 역전위를 정확하게 측정하려면 전극 전위를 일정하게 유지해야 합니다.

확산 전위는 두 가지 방법으로 최소화할 수 있습니다: (i) 이중층 멤브레인이 있는 경우 멤브레인의 한쪽 면에서 기판 농도를 증가시켜야 합니다^3,4 또는 (ii) 염교는 전극 전위의 균형을 이룹니다⁵. 첫 번째 방법은 측정의 안정성에 크게 의존합니다. 멤브레인은 교반하에 기질을 첨가한 후 기질이 용액에 거의 균등하게 분포될 때까지 몇 분 동안 생존해야 합니다. 중간에 멤브레인이 파열되면 하전 분자의 자유 교환에 의해 기질 구배가 변경되고 측정이 부정확해집니다. 후자의 방법은 확산 전위의 균형을 맞추지만 설정 크기에 의해 제한됩니다. 작지만 기능하는 소금 다리를 마이크로 범위에서 전기 생리학적 설정에 구현하는 것은 어려운 일입니다⁶. 후자의 방법에서, 염 용액을 마이크로 모세관 팁에 채우고 아가로스를 첨가하여 안정화하여 염 용액이 완충 용액으로 확산되는 것을 방지합니다.

이 프로토콜에서는 마이크로 한천 염교의 간단한 생산 및 피펫 setup-up^{7을 기반으로 하는 전기생리학적 설정에 대한 구현}에 대해 설명합니다. 미세모세관 팁은 1 mol%(w/v) 아가로스와 함께 3M KCl 용액을 포함하고 AgCl 전극과 완충 용액을 연결하도록 조정됩니다. micro-salt bridge의 장점은 전극 전위 이동의 시간 기록과 다양한 pH 구배에서 멤브레인 전위의 보다 정확한 측정으로 표시됩니다. 리포좀으로 재구성된 재조합 단백질의 모델 시스템에서 유사한 조건에서 생성된 미토콘드리아 운반체 UCP1 및 UCP3의 회전율을 재조사하고 이전 결과와 비교합니다^3,8.

1. UCP(Recombinant Uncoupling Proteins)의 생산 및 평면 이중막의 형성

1. Rupprecht et al.에 기술된 바와 같이 재조합 UCP1 및 UCP3을 생산합니다.⁹ 및 Hilse et al.¹⁰
2. Beck et al.에 의해 설명 된 바와 같이 기존의 디스펜탈 플라스틱 피펫의 팁에 평면 이중층 멤브레인을 형성합니다.⁷

2. Micro-agar Salt Bridge 전극의 준비

1. 미세 모세관 피펫 팁(재료 표 참조)을 적절한 길이로 조정합니다.
   1. 버퍼 함유 팁이 부착될 빈 팁의 위치를 표시하고 슬라이딩 캘리퍼를 사용하여 마이크로 한천 염교 전극의 길이를 측정합니다.
      주의 : 미세 모세관 팁은 측정을 위해 버퍼 용액에 들어갈 수 있을 만큼 충분히 길어야 합니다.
   2. 날카로운 칼이나 칼날로 미세 모세관 끝을 자르고 절단면을 에탄올과 물로 청소합니다.
2. AgCl 코팅 전극을 준비합니다.
   1. 약 8cm 길이의 Ag 와이어를 잘라 에탄올과 물로 청소하십시오.
   2. 사포 한 장을 가지고 소금 용액과 접촉해야 하는 와이어 끝에서 1cm 길이의 표면을 매끄럽게 만듭니다.
   3. 매끄럽게 처리된 끝을 3M KCl 용액에 담그고 1.5V에서 10초 동안 DC 공급을 사용하여 염화물로 전기화학적으로 코팅합니다.
   4. 전극을 물로 세척하고 건조시킨 다음 코팅되지 않은 쪽에서 AgCl 전극의 길이를 조정하여 미세 모세관 팁에 최대한 깊이 침투하도록 합니다.
      참고: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.
3. 3%(v/v) 아가로스로 1M KCl 염 용액을 준비합니다.
   1. 4.47g의 KCl을 계량하고 플라스크에서 저어 물 20mL에 용해시킵니다.
   2. 교반기를 제거하고 아가로스 0.2g의 무게를 잰 다음 플라스크에 넣습니다.
   3. 용액을 100°C로 가열하여 아가로스를 녹이고 응고를 방지합니다.
      주의 : 플라스크는 매우 뜨거울 것입니다. 맨손으로 만지지 마십시오. 취급에는 장갑을 사용하십시오.
4. 미세모세관 끝에 아가로스 염 용액을 채웁니다.
   주의: 솔루션이 뜨겁습니다. 손을 보호하고 물이 튀지 않도록 조심스럽게 작업하십시오.
   1. 아가로스가 응고되기 시작하면 소금 용액을 가열하여 아가로스를 다시 완전히 녹입니다.
   2. 10μL의 한천염 용액을 미세모세관 팁에 담그십시오. 팁에 기포가 생기지 않도록 천천히 조심스럽게 담그십시오.
   3. 피펫에서 팁을 제거하고 팁의 넓은 쪽에서 AgCl 전극을 밀어 넣습니다. 전극이 염 용액을 관통하는지 확인하십시오.
   4. 전극을 실온으로 식히고 앰프에 꽂습니다.
5. 측정을 위한 버퍼를 준비합니다.
   1. _Na2SO4 0.710g, MES 0.195g, TRIS 0.121g, EGTA 0.023g의 무게를 잰 다음 비커에 증류수 100mL를 넣고 용액을 저어줍니다.
   2. pH 전극을 사용하여 버퍼의 pH 값을 확인하고 pH 값을 7.32로 조정합니다.
   3. 기준 전극과 한천 염교 전극이 전기적으로 접촉하고 있는지 확인하십시오.
      1. 플라스틱 용기에 1mL의 버퍼를 추가합니다.
      2. 기준 전극과 한천 염교 전극을 담그고 신호 응답을 확인합니다. 신호 응답이 올바르면 2.7단계로 진행합니다.
6. 잘못된 신호 응답이 있거나 전기 접촉이 전혀 없는 경우 다음 문제 해결을 수행하십시오.
   1. 전극이 염 용액과 접촉하고 있는지 확인하고 전극을 용액에 밀어 넣습니다.
      참고: 용액이 이미 너무 끈적끈적하면 미세한천 염교를 제거하고 새 미세모세관 팁을 준비합니다.
   2. 소금 용액 내에 기포가 있는지 확인하십시오. 그렇다면 새 미세 모세관 팁을 준비하십시오.
   3. 소금 용액이 완충 용액과 접촉하고 있는지 확인하십시오. 그렇지 않은 경우 팁의 튜브 끝을 1mm 더 잘라냅니다.
      주의: 팁이 버퍼가 포함된 팁을 관통할 수 있을 만큼 충분히 긴지 확인하십시오. 그래도 접촉이 없으면 새 미세 모세관 팁을 준비하십시오.
   4. 이러한 단계 중 어느 것도 도움이 되지 않으면 새로운 미세 모세관 팁을 준비하십시오.
7. 보관을 위해 한천 염교 전극을 3M KCl 용액에 담그십시오.
   참고: 여기에서 프로토콜을 중지할 수 있습니다. 하룻밤 동안 일시 중지하려면 3°C에서 4M KCl 염 용액에 전극을 보관하십시오.
8. 완충액이 들어있는 플라스틱 tip.
   를 준비합니다. 참고 : 전극을 밤새 보관한 경우 꺼내서 실온으로 30분 동안 가열하십시오.
   1. 미세 모세관 팁을 잡고 열선을 사용하여 좁은 부분의 가장자리에서 약 2cm 떨어진 튜브를 약 90도 구부립니다.
   2. 매우 날카로운 칼이나 칼날을 사용하여 구부러진 부분에서 약 5mm 떨어진 튜브를 잘라냅니다.
   3. 끝 부분의 표면을 에탄올과 물로 청소하고 팁 구멍의 직경을 측정합니다. 여기에서 표면의 면적을 계산합니다.
   4. 팁 표면을 85:15 (v:v) hexane:hexadecane으로 코팅합니다.
      1. 용매 3 μL를 피펫팅하고 팁에서 제거합니다.
      2. 팁의 모든 잔류 용매가 증발할 때까지 1분 동안 기다립니다.
   5. 측정 팁에 3μL의 버퍼를 채우고 염교 전극에 꽂습니다.
      알림: 2.5.3단계를 수행하여 염교 전극과 기준 전극이 전기 접촉에 있는지 다시 확인하십시오.
   6. 전기 접점이 없는 경우 다음 사항을 확인하십시오.
      1. 소금 다리 전극이 완충 용액과 접촉하고 있는지 확인하십시오. 그렇지 않은 경우 팁의 버퍼 부피를 늘리거나 더 긴 미세 모세관 팁을 준비하십시오.
      2. 기포가 있는 경우 미세염 브리지 전극에서 팁을 제거하고 팁의 버퍼를 다시 채운 다음 전극에 다시 꽂습니다.

3. 재조합 단백질로 재구성 된 멤브레인의 전기적 매개 변수 측정

1. 최대 전압 U_max = 50mV 및 ΔT_램프 = 50ms인 삼각형 교류 전압 신호를 적용하여 직사각형 교류 응답을 생성합니다. 양전류와 음전류(I₊ 및 I_-)의 평균값에서 다음 공식에 따라 멤브레인의 용량을 계산합니다.
   
2. -50mV에서 +50mV 범위의 전압 램프를 적용하고 전류를 기록합니다. 선형 함수를 데이터에 맞추고(기울기는 컨덕턴스입니다) 피팅의 x축 교차점을 계산합니다.
3. 플라스틱 팁에서 용액을 배출하고 증가된 기판 농도를 포함하는 버퍼로 새 용액을 채웁니다.
   1. 처음 20 - 30초 이내에 멤브레인이 형성되지 않으면 볼륨을 배출하고 다시 채우십시오. 이는 멤브레인 전체의 농도 구배가 멤브레인 형성 중에 크게 변하지 않도록 보장합니다.
   2. 멤브레인 형성 후 3.1단계와 3.2단계를 다시 수행하여 적절한 멤브레인 형성을 확인하고 x축 교차점을 얻습니다.

4. 기판 회전율 계산

참고: 자세한 내용은 이전 작업을 참조하십시오^3,7.

1. 지질과 단백질(M_지질 및 M_단백질)의 분자량, 멤브레인 및 하나의 지질 헤드 그룹(A_멤브레인 및 A_지질)의 면적, 지질(r)당 단백질의 질량 비율에서 멤브레인의 단백질 양을 추정합니다.
   
2. 수송된 기판에 대한 Nernst 전위를 계산합니다. R은 기체 상수, T는 온도, z는 수송된 기판의 전하, F는 패러데이 상수, c₁ 및 c₂는 멤브레인 양쪽의 기판 농도입니다.
   
3. 전류-전압 기록에서, 기판 구배의 존재 유무에 따라 선형 맞춤에서 x축 교차점의 차이로 계산된 역전위를 취합니다.
총 멤브레인 전도도에 대한 기판 전도도 G_Substrate의 비율을 Nernst potential에 대한 역 전위의 비율로 계산합니다11.

4. 
5. 기판 회전율 수 ΔN 기판 전도도(G_기판), 인가 전압 U 및 기판 z:
   의 전하에서 시간 단위 ΔT당_기판을 계산합니다.
6. 단백질 수에 대한 시간당 수송된 기질의 비율에서 회전율 κ.
   를 계산합니다.

확산 전위의 최소화를 확인하기 위해 온전한 멤브레인의 전류-전압 측정의 안정성을 측정했습니다. 그림 2A에서 대표 전류 전압 기록은 pH 구배의 존재(흰색 점)와 부재(검은색 점)로 표시됩니다. Nernst 방정식에 따르면 pH 구배는 전압 이동을 유도합니다. 선형 피팅의 x축 교차점에서 데이터까지 잠재적 이동이 계산됩니다. 두 전극을 모두 테스트하기 위해 표준 AgCl 전극(그림 2B, 흰색 점) 및 마이크로 한천 염교(그림 2 B, 검은색 점)에 대해 x축 교차점의 이동을 분석했습니다. 전압 램프는 연속으로 10번 기록되었으며 x축의 평균 이동은 시간에 따라 표시됩니다. 한천 염교 전극은 300초 측정 후에도 최대 5mV 미만의 이동을 보인 반면, 표준 전극은 예측할 수 없는 무작위 동작으로 최대 30mV까지 변화했습니다.

다음으로, 두 전극은 서로 다른 pH 구배(그림 3 A)에서 테스트되었습니다. 표준 전극의 경우 0.35 및 1.0(흰색 점)의 pH 구배가 생성되었습니다. 한천 염교 전극의 경우 pH 구배는 0.35, 0.7 및 1.0(검은색 점)입니다. 전위의 이동은 세 가지 독립적인 측정으로 분석되었습니다. 측정된 이동이 약간만 변하는 0.35의 구배와 대조적으로, 전압 이동은 마이크로-한천 염교가 없는 경우 1.0의 pH 구배에서 크게 변경됩니다. 선형 맞춤에서 데이터에 이르기까지 함수의 기울기는 표준 전극의 경우 26.4 ± 2.3 mV/ΔpH이고 마이크로 한천 염 브리지 전극의 경우 50.1 ± 4.6 mV/ΔpH입니다. Nernst 방정식에 따르면 계산된 전위 이동은 T = 32°C에서 60.7mV/ΔpH입니다.

마이크로-아가르 소금 다리를 사용하여 미토콘드리아 UCP1 및 UCP3의 양성자 회전율 수 κ를 측정하고 이전 측정과 비교했습니다(그림 3B). A ΔpH = 1.0을 생성하고 역전위를 측정했습니다. 멤브레인의 단백질 양은 프로토콜의 섹션 4에 제공된 공식에 따라 추정되었으며, 단백질 대 지질 비율은 4 μg/(지질의 mg), 분자량은 33,000, 단백질 및 지질의 경우 750Da, 멤브레인 표면적은 3.53 x 10-4 cm2, 및 지질당 면적은 7.8 x 10-15 cm2입니다. 얻어진 κ는 UCP1 및 UCP3에 대해 각각 5.56 ± 0.38 s-1 및 4.10 ± 0.71 s-1이었습니다(그림 3B).

그림 1: 마이크로 한천 염교를 사용한 전기생리학적 설정.(A) 이 패널은 설정의 스케치를 보여줍니다. 한천 염 용액(주황색으로 표시)을 포함하는 미세모세관 팁은 전극(검은색)과 완충액 함유 팁(파란색) 사이에 배치됩니다. 멤브레인은 완충액을 함유하는 팁의 끝에있는 표면에 형성됩니다 (화살표로 표시). (B) 이 패널은 micro-agar salt bridge의 구현에 따른 전기생리학적 설정의 이미지를 보여줍니다. 화살표는 전극, micro-agar salt bridge, reference electrode 및 완충 용액이 있는 용기를 가리킵니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 마이크로 한천 염교와 표준 AgCl 전극의 비교. (A) 이 패널은 pH 구배가 1인 경우(회색 점)와 부재(흰색 점)의 대표적인 전류-전압 측정을 보여줍니다. 선은 데이터에 대한 선형 피팅을 나타내며, 이로부터 컨덕턴스 및 x축 교차 값을 얻습니다. 전압 이동은 두 기록의 교차 값의 차이에 의해 평가됩니다. (B) 이 패널은 표준 AgCl 전극(흰색 점)의 멤브레인 전위가 시간에 따라 마이크로 한천 염교 전극(검은색 점)으로 이동하는 것을 보여줍니다. 10개의 전류-전압 측정이 연속으로 기록되었으며 확산 전위에 의한 평균 전압 이동이 시간에 따라 표시됩니다. 모든 실험에서 멤브레인은 1.5 mg/mL의 농도에서 15 mol% 아라키돈산으로 재구성된 45:45:10 mol% DOPC:DOPE:CL로 만들어졌습니다. 버퍼에는 pH = 7.34 및 T = 32°C에서 50mMNa2SO4, 10mM MES, 10mM TRIS 및 0.6mM EGTA가 포함되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: pH 구배가 있는 경우 역전위에서 계산된 UCP1 및 UCP3의 양성자 회전율 수.(A) 이 패널은 표준 AgCl 전극(흰색 점) 및 마이크로 한천 염교 전극(검은색 점)의 다양한 pH 구배의 UCP1 함유 멤브레인의 전위 이동을 보여줍니다. 선은 데이터에 대한 선형 피팅을 나타냅니다. (B) 이 패널은 프로토콜의 섹션 4의 공식에 따라 전압 이동과 Nernst 전위의 비율에서 계산된 UCP1(첫 번째 데이터 세트) 및 UCP3(두 번째 데이터 세트)의 양성자 회전율 수를 보여줍니다. 각 세트의 첫 번째 막대는 마이크로 한천 염교로 측정된 회전율을 나타냅니다. 각 데이터 세트의 두 번째 막대는 표준 AgCl 전극을 사용한 이전 측정을 나타냅니다. UCP1 및 UCP3에 대한 값은 Urbankovaet al.에서 가져왔습니다.3 및 Macher et al.8. 모든 측정에서 멤브레인은 15 mol% AA 및 UCP1/UCP3으로 재구성된 45:45:10 mol% DOPC:DOPE:CL로 만들어졌습니다. 지질과 단백질의 농도는 각각 1.5mg/mL 및 4μg/mg의 지질이었습니다. 완충액은 pH = 7.34 및 T = 32°C에서 50mMNa2SO4, 10mM MES, 10mM TRIS 및 0.6mM EGTA를 함유했습니다. 구배 측정을 위한 버퍼의 pH는 TRIS를 첨가하여 7.66, 8.00 또는 8.33으로 증가시키고 용액 함유 피펫에서 변경했습니다. 값은 세 개의 독립적인 측정값의 평균 ± 표준 편차입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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