성인 쥐에 있는 재조합 형 Adeno 관련 바이러스의 직접 Intrathecal 주입

요약

여기에 우리가 작은 동물에 게 효율적인 adeno 관련 바이러스 전달 되도록 하 여 중앙에서 변환 효율 예측 점수 시스템 구축 바이러스 솔루션에서 1 %lidocaine 염 산 염을 사용 하 여 직접 intrathecal 사출 기법 제시 lidocaine에 의해 유도 된 과도 함의 정도 따라 신경 시스템.

초록

Adeno 관련 바이러스 (AAV)의 Intrathecal (IT) 주사는 CNS에 CNS 유전자 치료의 안전, noninvasiveness, 그리고 우수한 전달 효능 덕에 상당한 관심을 받고 있다. 이전 연구는 관리 그것에 의해 신경 장애에서 AAV 전달 유전자 치료의 치료 효능 입증. 그러나, 작은 동물에서 IT 관리의 기술적 제한으로 인해 예측할 수 없는 실패의 높은 속도 보고 되었습니다. 여기, 우리는 주입 솔루션으로 1 %lidocaine 염 산을 추가 하 여 작은 동물에 허리 빵 꾸의 성공 정도 나타내는 점수 시스템 설립. 우리는 추가 주입 다음 과도 함의 정도 AAV의 변환 효율을 예측할 수 있습니다 보여줍니다. 따라서,이 IT 주입 방법 CNS의 넓은 영역을 괴롭히다 CNS 질병 마우스 모델에서 치료 실험을 최적화 하기 위해 사용할 수 있습니다.

서론

AAV 몇 가지 부작용, CNS 변환에 장기적이 고 광범위 한 유전자 발현을 중재할 수 및 따라서 루 경화 증 (ALS), 헌팅턴의를 포함 하 여 CNS 질병을 치료 하는 유전자 치료에 대 한 가장 유망한 차량 중 하나 되고있다 (HD) 질병, Alzheimer의 질병 (광고), lysosomal 저장 질병 (LSD), Gaucher 질환 (GD), 그리고 신경 ceroid lipofuscinosis (NCL)¹ 현재, 이상의 100 AAV serotypes 인간과 동물에서 분리 되었습니다. 이러한 가운데, 적어도 12 전 임상에서 사용 되 고 AAV1, 2, 4, 5, 6, 8, 9, 같은 유전자 벡터를 사용 하는 가장 일반적으로 포함 하는 임상 시험, rAAVrh.8, 및 rAAVrh.10^,12,3,4, ^5,6.

다른 CNS 질병 때문에 다양 한....

프로토콜

FVB/뉴저지 쥐 허베이 신경과 키 실험실의 동물 시설에서 자란 했다. 모든 마우스 실험에 의해 두 번째 병원의 허베이 의료 대학 윤리 위원회 승인 되었고 실험실 동물 관리 과학과의 인민 공화국의 기술에 의해의 규정에 따라 실시 중국입니다.

1. 20 %Lidocaine 염 산 염 재고 솔루션의 준비

1. Lidocaine 염 산 염의 2 세대의 무게. 부드럽게 살 균 물과 소용돌이의 5-6 mL를 추가 합니다. 멸 균 물 10 mL의 총 볼륨을 증가.
2. 1.2 0.2 미크론 필터를 통해 재고 솔루션을 필터링 합니다. 약 수 재고 솔루션, 1.5 mL microcentrifuge 당 1 mL 튜브, 및 씰링 필름으로 그것을 봉인. 4 ° c.에 게

2. 깨어 있는 마우스에 직접 Intrathecal AAV 배달

1. 70% 에탄올과 멸 균 거 즈를 사용 하 여 작업 영역을 닦 고 표 1에서 설명한 대로 필요한 용품을 준비.
2. 살 균 200 µ L microcentrifuge 튜브에 rAAVrh10 재고 솔루션 (5 x 10¹² 게놈 사본/mL)의 95 µ L을 추가 하 여 복잡....

결과

마우스 과도 약점의 다른도 바로 뒤 AAV 솔루션의 주사로 intrathecal 주입의 다양 한 품질 1 %lidocaine 염 산 염 보였다. 시스템에 따라 반 양적 5 학년 점수 우리는 설립, 우리 AAV의 변환 패턴에에서 테스트 쥐 lidocaine 유도 사지 약점의 다른도로 (점수 0, n = 2; 1, n 점수 = 1; 4, n 점수 = 4; 점수 5, n = 3). 척수의 EGFP immunostaining 보였다 중 "없음" 또는 "작은 0를 득점 하는 쥐의 요 추 척수에 전달, 마우스 1, 점수에 약간 향상 된 변환 및 강력 하 고 광범위 한 transductions 마우스 4 또는 5 (그림 1A) 점수. 우리 계량 GFP 과도 사지 약점 (그림 1B)의 다양 한 학위를 표시 하는 그 쥐의.......

토론

기술적으로, 깨어 있는 쥐의 IT 주입 하는 동안 몇 가지 중요 한 단계가 있다. 첫째, 적절 한 제스처 및 회사 전체 작업을 통해 쥐의 관리는 배달 하기 위해 필수. 둘째, 그것은 저항 없이 너무 깊게 삽입 하거나 동물 부상 또는 절곡 바늘 팁의 경우 강력한 저항에서 강제로 삽입 하지 필요한 가장 어려운 포인트 바늘 팁과 척추 공간을 느낌입니다. 셋째, lidocaine 인해 일시적인 마비 제공 하지만 객관적인 지표로 그것에 대 한 사출 품질, 더 많은 연습 일관 되 고 성공적인 결과 달성 하기 위해 필요 합니다.

이 보고서에서 AAV, lidocaine 역할 IT 주입 성공의 정도 대 한 지표로 서, 유전자 치료의 효율성에 대 한 예측으로의 배달을 위해 깨어 마우스에 직접 intrathecal 주입 방법을 개발 했습니다. 실험적인 직접 요 추 찔린 처음 에이전트, 특히 마 취약, 진통 및 마 취, 척수에 전달 하기 위해 사용 그리고 CNS 질병에 대 한 유전자 치료에 매우 권.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
FVB / NJ 마우스	Charles River Laboratories 중국
리도카인 염산염 일수화물	HEOWNS	73-78-9
AAV	매사추세츠 대학교 의과 대학
25 µ 엘  해밀턴 주사기/27-30G 바늘	GASTIGHT	1702
O.C.T 콤 폰	SAKURA	4583
H 2O 2	SHUI HUAN PAI
염소 세럼	Solarbio	S9070
트리톤 X-100	LIFE SCIENCES	T8200
토끼 안티 GFP	라이프 테크	G10362	1:333 희석
두 번째 항체 (염소 - 토끼)	Jackson Immuno Research	111-005-144	1 : 1,000 희석
VECTASTAIN ABC REAGENT	Vector Lab	PK-6100
ImmPACT DAB Peroxidase Substrate Kit	Vector Lab	SK-4105
Vectorshield	H-1200		을 사용한 형광 용 마운팅 배지
	용 다 화학
NaH 2 < / sub> PO < > 4< / sub >· 2H2O	Yong Da 화학
Na2HPO4· 12H2O	Yong Da Chemical
Paraformaldehyde	Yong Da Chemical	307699
접착 현미경 슬라이드	CITOGLAS	17083	25 mm x 75 mm
SUPER-SLIP MICRO-GLAS	Electro Microscopy Siences	72236-60	24 mm x 60
mm 15 mL 원심분리기 튜브	CORNING	430790
96 well 세포 배양 클러스터	Coster	3599
24 웰 세포 배양 클러스터	Coster	3524
70% 에탄올	WEN ZHI
Gauze	Wei AN	05171112	8 cm x 10 cm x 12 cm
1 mL 주사기	Hong Da
마이크로튜브	플라즈믹
마이크로피펫	eppendorf
Peppet 팁	Rainin
Centirifuge	Eppendorf	5427R
Regerator	Haier	BCD-539WT
필터	MILLEX GP	R4PA42342
펌프	LongerPump	BT-100-2J/YZ1515X
현미경	Olympus	BX53
냉동 마이크로 톰	Leica	CM1520

유전자 치료 센터의 바이러스 벡터 코어드 170401 DAPI NaCl