이 문서에서는, 우리는 다이아몬드 나 방 (이용한 배 xylostella)에서 ryanodine 수용 체의 N 맨끝 도메인의 단백질 식, 정화, 결정 화 및 구조 결정의 프로토콜 설명합니다.
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방법 논문
N 맨끝 도메인의 Ryanodine 수용 체 이용한 배 xylostella 에서 결정 구조
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
곤충 ryanodine 수용 체 (RyRs)를 대상으로 하는 강력 하 고 효율적인 살충제의 개발 농업 해충의 영역에 큰 관심의 되었습니다. 까지, 몇몇 diamide 살충제 RyRs 상용화 되었습니다 해충을 대상으로는 2 십억 미국 달러의 연간 수익을 생성 합니다. 그러나 RyR 타겟팅 살충제의 행동의 모드의 이해 구조 정보 곤충 RyR의 부족에 의해 제한 된다. 이 차례로 해충에 살충제 저항 개발의 이해를 제한합니다. 다이아몬드 나 방 (DBM) diamide 살충제에 저항을 표시를 보고도 전세계, 십자화과 작물 파괴 엄청난 해충 이다. 그러므로, DBM RyR, 특히 전통적인 diamide 바인딩 사이트에서 다른 영역을 대상으로 타겟팅 새로운 살충제를 개발 하는 실용적인 중요성의 이다. 여기, 선물이 구조적 특성 DBM에서 RyR의 N 맨끝 도메인 프로토콜. X 선 결정 구조 분자 교체는 해상도에 의해 해결 되었다 Å는 2.84의 베타-개미 자리의 접는 모티브와 측면에 서 알파 나선 보여줍니다. 이 프로토콜은 일반적으로 식, 정화와 다른 도메인 또는 단백질의 구조적 특성에 대 한 적응 될 수 있다.
서론
Ryanodine 수용 체 (RyRs)은 근육 세포에 sarcoplasmic 그물 (SR) 세포 막에 걸쳐 캘리포니아2 + 이온의 투과 중재 하는 특정 이온 채널입니다. 따라서, 그들은 흥분 수축 연결 과정에서에서 중요 한 역할을 재생 합니다. 기능 형태의 RyR의 분자 질량을 가진 호모 tetramer로 조립 > ~ 5000 아미노산 잔류물의 구성 하는 각 소 단위와 2 MDa. 포유류에서 3 개의 isoforms는: RyR1 골격 근육 형, RyR2-심장 근육 유형 및 RyR3-다른 조직1편 표현.
곤충에는 근육과 신경 조직2에서 표현 RyR의 한 유형이 있다.입니다. 곤충 RyR 비슷합니다 더 약 47%의 시퀀스 id 가진 포유류 RyR23. 타겟팅 RyR의 나비목과 딱정벌레목 Diamide 살충제를 개발 하 고 바이엘 (flubendiamide), 듀 폰 (chlorantraniliprole) 및 Syngenta (cyantraniliprole) 같은 주요 기업에 의해 판매 되었습니다. 비교적 최근 출시 이후, diamide 살충제 살충제의 급성장 클래스 중 하나가 되고있다. 현재, 매년 ....
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프로토콜
1. 유전자 복제, 단백질 표정과 정화
- PCR 증폭 관심사의 단백질에 해당 하는 DNA (DBM RyR, 은행의 잔류물 1-205 없음 acc.. AFW97408) 및 결 찰 독립적인 복제 (LIC)25애완 동물-28a-HMT 벡터에 클론. 이 벡터 포함 히스티딘 태그, MBP 태그와 N-말단에 TEV protease 분열 사이트15.
- LIC 호환 5' 확장명을 가진 대상 유전자의 증폭에 대 한 디자인 LIC 뇌관:
LIC 뇌관을 전달:
5 ' 3' TACTTCCAATCCAATGCAATGGCGGAAGCGGAAGGGG
역방향 LIC 뇌관:
5 ' 3' TTATCCACTTCCAATGTTATTATATGCCGGTCCCGTACGGC - 결합 반응 구성 요소 (50 μ): DNA 템플릿 (100 ng/μ), 앞으로 뇌관 (10 μ M), 역방향 뇌관 (10 μ M), DNA 중 합 효소 (코), 10 x 반응의 5 μ의 0.5 μ의 1 μ의 1 μ 1 μ 버퍼, dNTP (25 mM)의 1 μ RNase의 40.5 μ 무료 ddH2o.
- PCR 기계에 반응 혼합물을 놓고 다음 프로그램....
- LIC 호환 5' 확장명을 가진 대상 유전자의 증폭에 대 한 디자인 LIC 뇌관:
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결과
정화
DBM RyR의 N 맨끝 도메인 TEV protease 분열 사이트, MBP 태그와 hexahistidine 태그 융합 단백질으로 표현 했다. 우리는 매우 순수한 단백질 결정 화 목적에 적합을 얻기 위해 5 단계 정화 전략을 따 랐 다. 처음에, 융해 단백질 Ni NTA 열 (HP HisTrap)에 의해 세포 lysate의 녹는 분수에서 순화 했다. 다음으로, TEV protease 분열 융해 단백질은 대상 하 고 hexahistidine MBP moiety amylose 수 지 열 Ni NTA 열 뒤에 의해 삭제 되었습니다. 또한, 단백질 음이온 교환 열 (Q Sepharose HP)에 의해 순화 되었다 그리고 마지막으로 젤 여과 열 (Superdex 200 26/600). 2YT 미디어를 사용 하 여 1 L 세균성 문화에서 순화 된 단백질의 최종 수익률 ~ 4.......
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토론
이 문서에서 우리는 recombinantly 익스프레스, 정화, 구체화 및 DBM RyR NTD의 구조를 결정 하는 절차를 설명 합니다. 결정 화에 대 한 중요 한 요구 사항이 높은 용 해도, 순도와 균질 단백질을 얻을 것입니다. 우리의 프로토콜에서 우리는 hexahistidine 태그와 MBP, 둘 다 더 높은 배 순도를 정화에 대 한 활용 될 수 포함 되어 애완 동물-28a-HMT 벡터를 사용 하기로 결정 했다. 또한,는 MBP 태그 에이즈 대상 단백질의 용 해도에. 우리는 매우 순수 하 고 결정 화를 위해 적당 한 단백질이 나왔고 5 연속 단계에 의해 단백질 정화. 결정 화 심사 자동된 액체 처리 시스템을 사용 하 여 수행 되었다. 수동 드롭 설정 하 여 전통적인 심사에 비해, 자동화 시스템 매우 작은 양의 샘플을 사용 하 여, 시간 및 에너지를 절약 한다. 그것은 또한 액체 처리의 정확도 때문에 재현성을 향상 시킵니다. 결정 했다 diffracted 자체 심사 및 데이터 수집에 대 한 싱크 로트 론에서 높은 강도 가진 x.......
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
이 연구에 의해 제공 된에 대 한 자금: 국가 주요 연구 개발 프로그램의 (2017YFD0201400, 2017YFD0201403), 국립 자연 과학 재단의 중국 (31320103922, 31230061)와 중국의 프로젝트의 국가 기초 연구 (973) 프로그램 중국 (2015CB856500, 2015CB856504)입니다. 우리는 beamline BL17U1 상해 싱크 로트 론 방사선 시설 (SSRF)에서 직원에 게 감사입니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| pET-28a-HMT 벡터 | 이 변형된 pET 벡터는 N-말단에서 헥사히스티딘 태그, MBP 융합 단백질 및 TEV 프로테아제 절단 부위를 포함합니다(Lobo and Van Petegem, 2009) | ||
| E. coli BL21 (DE3) 균주 | Novagen | 69450-3CN | |
| HisTrapHP 컬럼(5mL) | GE Healthcare | 45-000-325 | |
| Amylose 수지 컬럼 | New England Biolabs | E8021S | |
| Q Sepharose 고성능 컬럼 | GE Healthcare | 17-1154-01 | |
| Amicon 농축기 (10 kDa MWCO) | Millipore | UFC901008 | |
| Superdex 200 26/600 겔 여과 컬럼 | GE 헬스케어 | 28-9893-36 | |
| 자동 액체 처리 로봇 시스템 | Art Robbins Instruments | Gryphon | |
| 96 Well CrystalQuick | Greiner bio-one | 82050-494 | |
| Uni-Puck | 분자 치수 | MD7-601 | |
| 장착 CryoLoop - 20 미크론 | Hampton Research | HR4-955 | |
| CryoWand | 분자 치수 | MD7-411 | |
| Puck dewar 로딩 도구 | 분자 치수 | MD7-607 | |
| 나노 드롭 | , Thermo Scientific | NanoDrop, 단결정 | |
| 인큐베이터 | , 분자 치수 | MD5-605 | |
| X-Ray 회절기 | Rigaku | FRX, | |
| PCR 기계 | Eppendorf | Nexus GX2 | |
| 플라스미드 미니 준비 키트 | Qiagen | 27104 | |
| 젤 추출 키트 | Qiagen | 28704 | |
| SspI 제한 엔도뉴클레아제 | NEB | R0132S | |
| T4 DNA 중합효소 | 노바겐 | 2868713 | |
| 카나마이신 | 과학 화학 25389940 | ||
| IPTG | Genview | 367931 | |
| Hepes | Genview | 7365459 | |
| β-메르캅토에탄올 | Genview | 60242 | |
| 원심분리기 | Thermo Scientific | Sorvall LYNX 6000 | |
| Sonnicator | Scientz | II-D | |
| 단백질 정제 시스템 | GE Healthcare | Akta 순수 | |
| 광학 현미경 | Nikon | SMZ745 | |
| IzIt 결정 염료 | Hampton Research | HR4-710 | |
| 전기 영동 장치 | Bio-Rad | 1658005EDU | |
| 셰이커 인큐베이터 | Zhicheng | ZWYR-D2401 | |
| 인덱스 크리스탈 스크린 | Hampton Research | HR2-144 | |
| 구조 크리스탈 스크린 | 분자 치수 | MD1-01 | |
| ProPlex 크리스탈 스크린 | 분자 치수 | MD1-38 | |
| PACT 프리미어 크리스탈 스크린 | 분자 치수 | MD1-29 | |
| JCSG-plus 크리스탈 스크린 | 분자 치수 | MD1-37 |
참고문헌
- Giannini, G., Sorrentino, V. Molecular structure and tissue distribution of ryanodine receptors calcium channels. Medicinal Research Reviews. 15 (4), 313-323 (1995).
- Takeshima, H., et al. Isola....
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재인쇄 및 허가
