배양 된 초파리 계란 챔버의 시간 경과 영화를 사용하여 로컬 세포 및 조직 저울에서 Actomyosin 역학분석

요약

이 프로토콜은 개별 세포 및 곡선 상피 조직에서 actomyosin 행동을 안정적으로 분석하는 방법을 설명하는 간단한 지침과 함께 피지 기반의 사용자 친화적 인 방법론을 제공합니다. 자습서를 따르기 위해 프로그래밍 기술이 필요하지 않습니다. 모든 단계는 피지와 관련 플러그인의 그래픽 사용자 인터페이스를 사용하여 반 대화 형 방식으로 수행됩니다.

초록

초파리 미성숙 계란이라고 하는 계란 챔버, 그리고 그들의 구조는 개발 하는 동안 타원형 모양에 둥근에서 형태 변화를 겪는 원시 장기를 닮은. 이 발달 과정은 oogenesis에게 불리고 다음 플라이 세대를 확보하기 위하여 기능적인 성숙한 계란을 생성하는 것이 중요합니다. 이러한 이유로, 계란 챔버동물 장기 발달을 이해하는 이상적이고 관련 있는 모형으로 봉사했습니다.

몇몇 시험관 내 배양 프로토콜이 개발되었지만, 이러한 프로토콜에는 몇 가지 단점이 있다. 하나는 그들을 고정하고 분석 된 계란 챔버의 원주 표면의 이미지 획득 평면을 증가시키기 위해 이미지 계란 챔버에 인공 압력을 가하는 다양한 커버의 적용을 포함한다. 이러한 접근법은 더 긴 축을 중심으로 계란 챔버를 회전시키는 힘을 생성하는 얇은 아토미오신 기계의 거동에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다.

따라서, 이러한 한계를 극복하기 위해, 우리는 알 챔버의 둘레를 따라 아토미오신 기계를 안정적으로 분석하기 위해 배지에서 Drosophila 난자 챔버를 자유롭게 배양한다. 프로토콜의 첫 번째 부분에서는 로컬 셀룰러 스케일(최대 15셀)에서 제한된 획득 평면에서 actomyosin 기계를 분석하는 방법을 자세히 설명하는 매뉴얼을 제공합니다. 프로토콜의 두 번째 부분에서, 우리는 계란 챔버의 원주 표면의 정의 된 얇은 층의 간단한 추출을 허용 하는 새로운 피지 기반 플러그인을 사용자에 게 제공. 다음 프로토콜은 조직 규모에서 actomyosin 신호를 분석하는 방법을 설명합니다 (>50 세포). 마지막으로, 우리는 현지 세포 및 조직 규모 둘 다에 있는 이 접근의 한계를 찾아내고 그것의 잠재적인 미래 발달 및 가능한 응용을 토론합니다.

서론

생명 과학 분야의 응용 분야와 함께 새로운 이미징 및 소프트웨어 기술의 지속적인 발전은 삶의 기본 원리를 이해하는 데 엄청난 영향을 미쳤습니다. 주요 과제 중 하나는 다양한 조직에서 의 한 번의 생생한 이미징과 함께 개발 과정의 신뢰할 수 있는 시각화입니다. 조직은 기관 및 바디의 부분이고, 이와 같이, 대다수는 화상 진찰을 위해 쉽게 접근할 수 없습니다. 따라서, 그들의 해부 및 시험관 내 배양을 허용하는 프로토콜은 생체 내의 생체 내 상황을 충분히 반영하는 생물학적 사건을 시각화하기 위해 개발되었다.

지난 수십 년 동안, 초원성 기관 을 닮은 acinar 같은 구조, Drosophila 계란 챔버의 배양 및 라이브 이미징, 원시 장기 개발의 기본 원칙의 이해에 대단히 기여하고있다^{1 , 2개 , 3}. 현재, 사용할 수있는 몇 가지 배양 프로토콜이 있으며, 그 사용은 수집 시간, 이미지 할 세포 유형 및 접근성 (예를 들어, 내부 생식선 대 외부 체세포 선)에 따라 달라집니다⁴.

이러한 모든 배양 프로토콜의 일반적인 특징은 액체 매체에서 높은 수축 활성을 나타내는 분석 된 계란 챔버의 고정에 대한 필요성입니다. 계란 챔버의 수축 활성은 주로 연결된 계란 챔버 5,^6,7의긴 문자열을 덮는 근육 시트에 의해 발생합니다. 따라서, 젊은 계란 챔버의 적절한 고정을 달성하기 위해, 다양한 접근 방식은 커버립 6,^8,9 또는 유연한 담요^4,커버 립과 계란 챔버를 덮고 포함, 개발되었다. ^{도 10} 또는 저융점 아가로즈^3,11에포함. 이 접근은 또한 계란 약실의 원주 표면의 미묘한 평평하게 때문에 더 큰 시각적 인 비행기의 화상 진찰을 허용하기 때문에 대중적입니다.

그러나 최근에는 어린 난자 챔버(1-8단계)가 전방 후방 축 6을 중심으로 회전하고 이 조직 운동이 이 젊은 달걀 챔버의 ^{원주 표면에 가까운 미세한 actomyosin 네트워크에 의해 구동되는 것으로 나타났습니다. 12}. 따라서,이 조직의 미묘한 평탄화로 인한 세포 표면의 인공 적인 변화는 힘 생성 actomyosin 기계의 행동에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 카운터포인트는 난자 챔버 조직이 평평해지지 않으면, 계란 챔버의 원주 표면에 있는 단백질의 현미경 이미징이 획득 평면의 감소된 크기에 의해 더욱 제한된다는 것입니다.

따라서, 우리는 Prasad 등 에서 프로토콜을 결합⁹ 셀레스트 버그의 실험실^4,10 그리고 더 커버 슬립 / 유연한 담요 / 아가로즈가 개발 된 방법에 사용되지 않도록 그들을 수정. 초파리 난자 챔버는 자유롭게 배지에서 배양되며 여기에 제시된 프로토콜은 거꾸로 된 현미경 검사법만 적용합니다. 프로토콜에는 두 부분으로 구성됩니다. 첫 번째 부분은 계란 챔버 내에서 로컬 세포 규모 (최대 15 세포)에서 actomyosin 신호의 분석에 초점을 맞추고있다. 두 번째 부분에서는 계란 챔버의 자유로운 배양으로 인한 작은 획득 평면과 관련된 한계를 극복하는 데 중점을 둡니다. 이와 관련하여, 우리는 선택적으로 추출하고 원주 조직 표면의 정의 층을 전개 반 대화 형 그래픽 사용자 인터페이스와 새로운 피지 기반의 계산 방법을 개발했다. 이것은 조직 규모 (즉, >50 세포)에서 actomyosin을 분석하는 방법을 설명하는 프로토콜에 의해 뒤따른다. 고전적 z-stack 프로젝션(도 1)을 사용하여 정의된 얇은 층의 정의된 얇은 층의 선택적 추출이 용이하지 않았기 때문에,이 사용하기 쉬운 방법은 포괄적으로 이해하기 위한 중요한 전제 조건으로 작용하여 초파리 난자 챔버의 조직 규모에서 얇은 (&1 μm) 아토미오신 네트워크의 행동.

또한, 프로토콜을 용이하게 하기 위해, 우리는 형광태그가 지정된 비근육 종래의 Myosin II 동작의 예시 타임랩스 영화(TLM) 및 샘플 파일을 제공한다(보충 파일 3참조). 묘신 II는 모터 단백질이며 아토미오신 기계의 활성 수축 부위를 나타낸다. Myosin II를 이미지화하기 위해, 우리는 MRLC라는 Myosin II의 수정 된 조절 광체인을 포함하는 Drosophila 형질 전환 라인을 사용합니다 ::GFP (자세한 내용은 재료 표 참조)^12,13. 세포막을 시각화하기 위해, 프로토콜은 상업적 염료를 기반으로 한다(재료 표참조). 이 프로토콜은 작은 세포내 MRLC의 분석뿐만 아니라 12:GFP 신호^12뿐만 아니라 생명법으로 관찰된 것과 같은 ±300 μM 정도의 유사한 크기의 세포내 입자에도 적합합니다::GFP^12,14.

이러한 두 프로토콜은 시험관 내 배양 Drosophila 난자 챔버를 사용하여 제시되지만, actomyosin 신호의 취득은 또한 배양 매체의 최적화및 가용성에 따라 다른 조직을 사용하여 수행 될 수있다 상응하는 상용 염료를 가진 형광태그된 단백질 또는, 예를 들어, 일시적인 유전자 발현 단면도를 얻기 위하여 mRNA 미세 주사. 유사하게, 원주 표면으로부터 얇은 층을 추출하기 위한 피지 계 프로토콜은 타원 및 장기 유사 조직에 보다 일반적으로 적용될 수 있다.

프로토콜

참고: 다음 프로토콜은 국소 세포및 Drosophila 계란 챔버에서 조직 규모에서 actomyosin을 분석하는 방법에 대한 지침을 제공합니다. 로컬 스케일 접근법을 통해 사용자는 달걀 챔버 당 최대 15 개의 세포에서 상세한 actomyosin 거동을 분석할 수 있으며 고속 이미징과 반전 된 공초점 현미경을 사용하여 짧은 기간 (5-10 분) 동안 TLM을 수집해야합니다. 대조적으로, 조직 규모는 50-100 세포에 있는 actomyosin 정보를 사용자에게 제공하고 저속 화상 진찰 및 반전된 회전 디스크 현미경을 사용하여 오랜 기간 동안 (≥30 분) TL의 취득을 요구합니다 (그림 2 및 [표1)]의 각 축척에서 권장된 매개 변수를 참조할 수 있습니다. actomyosin 신호를 분석 하는 규모에 결정은 전적으로 사용자의 과학적 질문에 따라 달라 집니다. 동반 테스트 TLM은 이 결정을 내리는 데 도움이 됩니다.

1. 로컬 셀 룰러 스케일 (LCS)

참고: 체외 배양 Drosophila 난자 챔버에서 해부 및 이미지를 해부하려면, 보충 파일1에 기재된 프로토콜을 따르십시오. 획득한 TLM을 분석하려면 다음 프로토콜을 계속 합니다. TL의 첨부 테스트 파일에 대한 링크는 보충 파일3에 제공됩니다.

1. 로컬 셀룰러 스케일(LCS)에서 TLM의 데이터 처리
   1. 형광 라벨의 강도 붕괴를 보상하기 위해 TLM의 표백보정
      1. 피지 > TLM을 엽니다 (예를 들어, 보충 파일3에서 TestMovie1.tif) : 피지 > 다음 지침에 따라 사용되는 컴퓨터에 최신 피지 응용 프로그램이 설치되어 있는지 확인하십시오.
      2. 이미지 > 색상 > 분할 채널을클릭하여 색상 채널을 분할합니다.
      3. 이미지 > 조정 > 표백 보정 > 단순 비율 > 배경 강도 0.0을사용하여 두 채널에서 표백보정을 수행합니다.
         참고: 만족스럽지 못한 결과를 얻은 경우 이 플러그인에서 어떤 교정 방법이 가장 적합한지 살펴보십시오(예: 단순 비율대신 히스토그램 일치 사용).
   2. TLM용 셀 마스크를 생성하는 셀 세분화
      1. 피지가 아직 열려 있지 않은 경우, 도움말 > 업데이트 > 변경 사항을 적용 > 확인에따라 (그리고 최신 상태인지 확인) 다시 엽니 다.
      2. 이 작업이 아직 완료되지 않은 경우, 매크로 TissueCellSegmentMovie.ijm을 다운로드 (http://adm.irbbarcelona.org/matlab/TissueCellSegmentMovie.ijm). 이 스크립트를 피지로 끌어 놓습니다.
      3. 표백보정 된 TLM .tiff 파일을 엽니다 (섹션 1.1.1 참조). 이미지 > 색상 > 분할 채널을 사용하여 표백보정 파일의 채널을분할합니다.
      4. 선택한 TLM의 활성 세포막 채널에서 업로드된 스크립트를 실행하려면 열린 스크립트에서 실행 아이콘을 누른 다. 가우시안 흐림 효과를 2.500으로 설정하고 셀 감지 감도를 -1로 설정하고 확인을클릭합니다. 좋은 셀 마스크를 얻으려면 위의 매개 변수를 변경하지 마십시오. 63x 목표치로 획득한 TLM의 경우 10~20사이의 예상 노이즈 허용 오차를 설정하고 확인을 클릭합니다.
         참고: 다른 목표의 경우 다른 매개 변수가 필요할 수 있습니다. TLM의 배경이 깨끗할수록 예상 노이즈 허용 오차가 낮아야 합니다.
      5. 생성된 셀 마스크는 분석된 TLM과 ParticleStack(G)이라는새 창에도 나타나며, 또한 작업 필수라는 작은 창이 나타납니다. TLM의 셀 마스크에서 TLM 중앙에 있는 셀에만 초점을 맞추고 TLM 전체에 걸쳐 완전하고 잘 정의된 윤곽선을 제공할 수 있는 셀을 선택합니다.
      6. 선택한 셀에 인공/추가 셀 윤곽선이 포함된 경우 TLM에서 필요한 작업이라는 병합 도구 창을 사용합니다. 후자의 경우 창의 지침을 따르십시오.
         참고: 어떤 부정확성이 후속 분석에 영향을 미칠 수 있기 때문에 세포 윤곽이 잘 정의되고 TLM에 있는 실제 세포막에 대응한다는 것을 확인하십시오. 원치 않는 셀 제거와 같은 추가 조정 및 변경 사항은 나중에 Surface 관리자 도구(섹션 1.1.3에 설명)를 사용하여 수행할 수 있습니다.
      7. 중앙에 있는 선택한 셀이 실제 세포막과 잘 일치하면 FileStack을 파일 및 저장 As > Tiff다음에 .tiff 파일로 저장합니다.
   3. 생성된 셀 마스크를 Surface 관리자로 로드
      1. 표면 관리자 플러그인을 설치¹⁵ 사용 된 피지 설정에. Viktorinova 외.^16의지시에 따라 .
      2. 플러그인 > 세분화 및 표면 관리자(3D)를 사용하여 표면 관리자를 엽니다.
         참고: Surface 관리자 창에는 오른쪽에 여러 작업 버튼이 표시되고 왼쪽에는 빈 창이 표시됩니다. 모든 작업 단추를 보려면 높이/너비에서 창을 늘여야 할 수 있습니다. 시간 프레임은 z-슬라이스로 표시됩니다.
      3. 파일 > 열기를 클릭하여 해당 ParticleStack .tiff 파일을 표면 관리자로 열고 열 이미지를 선택합니다(예: ParticlesStack1.tif).
      4. Surface Manager에서 개요 이미지 읽기 단추를 클릭하고 자카드 인덱스를 60%로 설정합니다.
         참고: ParticlesStack1.tif 파일을 로드하는 것은 컴퓨터의 처리 방법에 따라 최대 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다.
      5. 로드되면 각 셀에 S 번호가 할당되고 Surface 관리자 창의 왼쪽 부분에 표시됩니다.
         참고: 모든 셀에 대한 윤곽선과 셀 이름을 표시하려면 Surface 관리자 창 하단에 있는 모든 표시 및 레이블 표시 확인란을 선택합니다. 셀 번호가 정확성을 확인한 후에는 이 기능을 사용하는 것이 좋습니다.
      6. 첫 번째 S 번호를 클릭합니다. ParticlesStack1.tif에서 가져온 셀 윤곽선이 TLM에 나타납니다. 가져온 각 S 번호에서 TLM 전체에서 셀 윤곽선 품질이 있는지 확인하고 잘못된 셀 윤곽선을 표시하는 원치 않는 셀을 제거합니다. 이렇게 하려면 셀 윤곽선을 강조 표시하고 삭제단추를 클릭합니다.
         참고: 또한 부정확한 셀 윤곽선을 수정하고 새 셀 윤곽선을 추가할 수도 있습니다. 이것은 토론 섹션에 설명되어 있습니다.
      7. 디스크에 저장 버튼을 눌러 모든 수정 된 셀을 RoiSet.zip 파일로 저장합니다.
         참고: 세션을 중단해야 하는 경우 나중에 RoiSet 파일을 Surface 관리자에 로드할 수 있습니다: 피지에서 TLM을 엽니다(파일 > 열기)를열고 TLM을 선택합니다. 플러그인을 통해 표면 관리자를 엽니 다 > 세분화 > 표면 관리자 (3D). 디스크 단추에서 로드를 클릭하고 적절한 RoiSet.zip 파일을 선택하여 해당 RoiSet.zip 파일을 로드합니다. 로드된 셀 마스크가 로드된 TLM에 해당하는지 다시 확인합니다.
   4. TLM의 조직 드리프트 교정
      참고: TLM의 획득 시간 동안 상피 회전 또는 원치 않는 움직임으로 인해 드리프트 효과가 관찰 될 수 있습니다. 두 경우 모두 나중에 수동 actomyosin 분석을 단순화하기 위해 드리프트를 수정하는 것이 좋습니다. 드리프트 보정은 수동 actomyosin 분석에 필요합니다. 이 자습서는 MultiStackReg 플러그인 (https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#multistackreg) 설치 된 최신 피지 소프트웨어가 필요 합니다.
      1. File >를 통해 피지에서 표백제 보정 된 TLM을 열고 위에서 언급 한 자습서를 사용하여 만든 표백제 수정 파일을 선택하십시오.
      2. 채널을 분할하고 이미지 > 컬러 > 분할 채널을통해 세포막을 식별하는 채널을 선택합니다.
      3. 셀 윤곽선이 눈에 띄게 매끄럽지 않은 경우 다음 프로토콜을 사용합니다. 63x 목표에 대해 ~ 1-2로 설정한 다음 확인을 클릭한 다음 예. 프로세스 > 바이너리 > 기본 설정을 사용 하 여 마스크로 변환; 그런 다음 확인을 클릭합니다.
      4. 플러그인 및 등록 > MultiStackReg다음 MultiStackReg 플러그인을로드합니다.
      5. 스택 1이 세포막 채널로 설정되어 있는지, 작업 1이 정렬로 설정되고 변환이 번역으로 설정되어 있는지 확인합니다. 변환 파일 저장 확인란을 확인한 다음 확인을클릭합니다.
      6. 선택한 TLM, MultiStackReg 플러그인 및 파일 > 열기 및 TLM을 사용하여 저장된 변환 파일을 다시 엽니다. 이미지 > 색상 > 분할 채널을 사용하여 색상 채널을분할합니다.
      7. 플러그인을 클릭하여 MultiStackReg 플러그인을로드 > 등록 > MultiStackReg. 변환 파일 로드를 작업 1로 선택합니다.
      8. 변환을 강체로 두고 확인을클릭합니다. 이전에 저장된 변환 파일을 선택하고 확인을 다시 클릭합니다.
      9. 이미지 채널을 병합하고 등록된 TLM을 이미지 > 컬러 > 채널 병합다음에 .tiff 파일로 저장합니다. 파일 > 저장 > Tiff를클릭하여 파일을 저장합니다.
         참고: 피지에서 조직 드리프트에 대 한 수정 하는 다른 방법이 있다, 즉 플러그인을 통해 > 등록 > StackReg/올바른 3D 드리프트.
2. LCS의 표면 관리자에서 아토미오신 펄스 분석
   참고: 이 프로토콜 단계를 통해 과학자들은 아토미오신 펄스가 분석된 조직에 존재하는지 여부를 확인하고 아토미오신 신호의 방향성뿐만 아니라 상세한 행동을 이해할 수 있습니다.
   1. 피지를 열고 TLM 및 해당 셀 마스크가 Surface 관리자에서 열려 있는지 확인합니다.
      참고: 피지가 설치되고 최신 상태이고 Surface 관리자 플러그인이 설치되었는지 확인합니다(단계 1.1.3.1).
   2. 파일 > 열고 열 TLM을 선택 (예 : TestMovie1_bleach.tif)와 TLM을 엽니 다. 플러그인을 통해 표면 관리자 플러그인을로드 > 세분화 > 표면 관리자 (3D). 파일 >를 열고 셀 마스크(예: ParticlesStack1.tif)를 선택하여 자습서에서 만든 저장된 셀 마스크를 로드합니다(예: ParticlesStack1.tif). 해당 관심 영역(예: TestMovie1_RoiSet.zip)을 로드합니다. 그림 3A를참조하십시오.
   3. 선택한 TLM의 관심 채널로 전환합니다.
      참고: 채널을 구분하려면 TLM 주위에 표시된 색상 코드를 따르십시오.
   4. Surface Manager에서 통계 단추를 클릭하여 평균 회색 값 슬라이스(그림3B)라는창을 가져옵니다. 시간이 지남에 따라 정의된 셀 윤곽선 내에서 주어진 분석 채널에서 actomyosin 신호의 평균/중앙값은 셀 영역 및 셀 모양과 관련된 다른 파라미터뿐만 아니라 표시됩니다.
      참고: 강도 값은 중재 단위(A.U.)에 있습니다. 셀 영역은 픽셀 단위이며 평방 마이크로미터로 변환해야 합니다.
   5. 가져온 값을 스프레드시트 파일로 저장합니다. 통계 창, 파일 > 로저장을 클릭합니다.
      참고: 피지에서 표백보정 TLM을 열고 표면 관리자를 엽니다. 디스크 단추에서 로드를 눌러 해당 RoiSet.zip을 TLM에 로드하고 파일을 엽니다. 셀 윤곽선이 있는 저장된 마스크가 업로드되고 셀 이름이 왼쪽 Surface 관리자 창에 나타납니다. 통계 값을 보려면 통계 단추를 클릭합니다.
3. LCS에서 개별 세포 내 아토마이오신 신호의 수동 분석
   참고: 이 프로토콜은 가장 많은 농도가 필요하며 시간이 많이 걸립니다. 일반적으로, 획득한 TLM은 1일 이내에 편안하게 분석할 수 있습니다. 여기에는 해부, 해부 자체 및 이미지 수집 전에 비행 준비 시간이 포함되지 않습니다.
   1. 최신 피지 응용 프로그램에서 선택, 표백 보정 및 등록 (드리프트 보정) TLM을 엽니 다. 표백제 보정 및 드리프트 보정 TLM(예: TestMovie1_bleach_reg.tif)을 테스트 예제로 사용합니다.
   2. 밝기와 대비를 조정하여 이미지 > 조정 > 밝기/콘트라스트를사용하여 개별 actomyosin 신호를 볼 수 있습니다.
   3. TLM을 조직/신체 축을 기준으로 동일한 방향으로 정렬합니다. 계란 챔버의 경우, 분석 하기 전에 이미지/하위 영화/TLM의 왼쪽에 항상 계란 챔버의 앞쪽을 정렬 합니다.
   4. 선택한 영화를 짧은 30s 하위 영화로 나누고 각각 시간 투영합니다. 해당 이름으로 시간 투영 및 시간 투영 하위 동영상을 저장합니다. 원본 소스를 유지합니다.
      참고: 하위 동영상은 먼저 이미지 > 스택 > 슬라이스 리무버를통해 원치 않는 프레임을 삭제하여 원래 TLM에서 만들 수 있습니다. 제거할 조각을 정의하고 증분을 설정합니다. 증분 = 1일 때 슬라이스 리무버를 사용하기 전에 RGB로 변환합니다. 30초 의 서브무비를 시간 투영하려면 정의된 프레임(슬라이스)에 대한 이미지 > 스택 > Z 프로젝트 > 최대 강도를 클릭한 다음 확인을클릭합니다. 아토미오신 신호가 2x 2x 인 후일의 30 초 서브 무비를 계산하지 않도록 매 초 30 의 서브 무비를 건너 뜁니다.
   5. 해당 30s 하위 동영상 옆에 시간 투영 된 이미지를 배치합니다 (그림4A,B). 시간 투영 하위 동영상의 신호 라인을 식별합니다. 하위 영화를 수동으로 재생하여 원래 하위 영화에서 이 라인을 따라 아토미오신 신호 이동(0°-360°)의 방향을 식별합니다. [피지 바]에서 각도 도구를 사용하여 정의된 조직 축 또는 이와 유사한 사용 가능한 도구를 기준으로 신호 이동 방향을 수동으로 측정합니다.
      참고: 피지는 0°-180° 척도(그림4C)에서만 작동하며, 얻은 값을 0°-360° 스케일로 다시 계산해야 합니다. 신호 라인은 시간이 지남에 따라 하나의 actomyosin 신호 움직임의 궤적에 해당합니다.
   6. actomyosin 신호의 분석에서 중복을 방지하려면, 시간 투영 하위 영화에서 세포 내의 분석 된 신호 라인을 표시 (그림4B,D).
   7. 30s 서브무비에서 선택한 모든 셀을 분석하고 얻은 각도를 저장합니다.
      참고: TLM을 통하여 잘 정의된 세포 윤곽을 가진 세포에 있는 세포세포 세포질 actomyosin 신호만 분석하십시오. 전체 TLM에서 15~20개 미만의 검출된 신호가 있는 개별 셀을 제외합니다. 알 수 없는 기원으로 인해 세포를 가로질러 이동하는 actomyosin 신호를 무시합니다. 30s 서브무비에서 분석된 셀 하나에 대한 신호 카운트의 예는 도 4D에도시되어 있다.
   8. 하나의 TLM의 30s 길이의 서브무비를 모두 분석할 때까지 계속하고, 하나의 TLM의 측정된 모든 각도를 스프레드시트 파일에 저장합니다.
   9. 관련 TLM 수에 대해 측정된 모든 각도를 합산합니다(실험에 따라 다름). 예를 들어, 선호하는 소프트웨어로 0°~ 360°범위의 장미 다이어그램으로 분석된 아토미오신 신호 방향의 백분율을 플로팅합니다.
      참고: 통계적으로 유의한 결과를 얻으려면, 어떤 계란 챔버 단계의 5 개 에서 10 개의 독립적인 계란 챔버를 분석하는 것이 좋습니다.

2. 조직 규모

참고: 체외 배양 Drosophila 계란 챔버에서 해부 및 이미지를 해부하려면 보충 파일2의 프로토콜을 따르십시오. 획득한 TLM을 분석하려면 아래 프로토콜을 계속 하십시오. TL의 동반 테스트 파일은 보충 파일3에 배치됩니다.

1. 곡면 상피 조직의 선택적 표면 추출
   참고:이 프로토콜은 사용자가 선택적으로 시간이 지남에 따라 곡선 상피 조직에서 actomyosin의 얇은 층을 추출 할 수 있습니다. 이 프로토콜 단계는 사용자 친화적이며 직관적인 그래픽 인터페이스를 기반으로 합니다. 여러 TLM을 편안하게 분석(추출 표면)할 수 있습니다.보조 파일 3)을 테스트 TLM 예로 들 수 있습니다.
   1. 최신 피지 응용 프로그램을 엽니 다 (피지 > 도움말 > 업데이트 > 변경 사항을 적용 > 확인).
   2. 타원 표면 투영 플러그인^15가 설치되어 있는지 확인합니다. 빅토리노바 외를따르십시오. ¹⁶.
   3. TLM을 열고 플러그인을 클릭하여 XML / HDF5 파일로 내보내기 > BigDataViewer > XML / HDF5 파일로 현재 이미지를 내보내기.
      참고: 내보내기 경로를 정의해야 합니다. 저장 자체는 몇 분 정도 걸릴 수 있으며 TLM 길이에 따라 다릅니다.
   4. 플러그인 > BigDataViewer > 타원 표면 프로젝션 > XML 파일선택을 클릭하여 타원 표면 투영에서 내보낸 파일을 엽니다.
      참고: 계란 챔버의 시상 뷰와 처리를 통해 사용자를 안내하는 대화 상자가있는 새로운 창이 나타납니다. 슬라이스 뷰에서 탐색하는 방법에 대한 자세한 내용은 https://imagej.net/BigDataViewer 확인할 수 있습니다.
   5. 난소 프로젝션이라는 대화 창에는 여러 탭이 있습니다. 경계 상자라는 첫 번째 대화 탭에서 경계 상자의 z 너비(즉, z 스택/달걀 챔버의 깊이)와 함께 TLM에 있는 계란 챔버의 x 및 y 테두리를 정의하고 [그림5A]를누릅니다.
   6. 테두리를 정의하려면 x, y 및 z 옆에 있는 단추를 드래그하거나 x, y 및 z 상자의 숫자 좌표를 정의합니다. 테두리가 표면 추출에 관심계란 챔버의 일부를 얻을 수있을만큼 관대되어 있는지 확인합니다. 달걀 챔버의 선택된 부분은 분홍색으로 강조 표시됩니다.
   7. 창 난소 투영에서 Blob 찾기라는 탭으로 전환합니다. 시그마와 최소 피크 값을 정의합니다. 그런 다음 계산을 눌러 녹색 Blob으로 나타나는actomyosin 신호(그림 5B)를 식별합니다. 충분한 지점(약 100개)이 발견될 때까지 다른 매개 변수로 이 단계를 다시 시도합니다.
      참고: 최소 피크 값 20\u2012100시그마 1\u20123은 6단계에서 -8개의 달걀 챔버의 아토미오신 신호를 식별하는 데 가장 적합합니다. actomyosin 신호를 식별하는 것은 중요한 단계이며 신호 품질과 크기에 따라 달라집니다. 기존 Blob의 올바른 크기를 확인하는 것이 중요합니다. 이미지에 녹색 반점/Blob이 표시되지 않는다는 것은 다음 단계가 작동하지 않음을 의미합니다. 선택한 z 평면을 탐색하여 Blob을 확인합니다.
   8. 타원을 디자인하려면 타원맞춤이라는 탭을 계속합니다. 임의 표본을 10,000으로 설정하고 외부/내부 컷오프 거리를 1\u201210으로 설정한 다음 계산(그림 5C)을 클릭합니다.
      참고: 컷오프 거리가 낮을수록 원하는 타원이 더 정확해집니다. 이 후에는 프로젝션이라는 탭이 자동으로 열리고 표면 추출의 정의가 허용됩니다. 설정을 최적화해야 합니다.
   9. 프로젝션(그림 5D)이라는탭을 계속 진행합니다. 최소 및 최대 투영 거리(즉, 원하는 타원의 폭)를 설정합니다. 분홍색으로 정의된 타원 영역이 계란 챔버의 전체 외부 층을 포함하도록 최소및 최대 투영 거리를 설정해야 합니다. 슬라이스 거리를 정의합니다(1은 권장).
      참고: 잘못되고 최적의 타원 맞춤의 예는 올바르고 최적의 투영 매개변수를 초래하는 그림 6A,C에 나와 있습니다. 관심의 얇은 원주 층은 나중에 정의 할 수 있습니다. 계산을 누르기 전에 달걀 챔버에 정의된 너비가 있는 타원의 분홍색 영역이 표시되는지 확인합니다. 최상의 결과를 얻으려면 원하는 타원 (분홍색 단일 선)이 계란 챔버의 타원 표면에 잘 맞는 것이 중요합니다. 타원 맞춤이 좋지 않은 경우 원하는 표면 추출이 얻을 때까지 다른 설정을 정렬합니다.
      1. 타원의 출력 너비(≥800)와 높이(≥400)를 설정합니다. 서피스 추출을 작성할 시간 점을 설정합니다(즉, TLM 추출 길이 정의). 구형 또는 원통형 투영중 하나를 선택합니다. 필요한 경우 Z를 뒤집고 Y를 정렬합니다.
      2. 계산을 눌러 이미지라는 새 창에서 두 채널에 대 한 표면 추출을 가져옵니다. 이미지 > 조정 > 밝기/콘트라스트를 클릭하여 투영된 actomyosin 신호를 볼 수 있도록 얻은 이미지 창의 밝기와 대비를 조정합니다.
         참고: 잘못되고 최적의 타원 맞춤으로 인한 투영의 예비교는 도 6B,D에 나와 있습니다.
   10. 표면 추출이 양호한 경우 이미지(두 채널 모두 별도)를 .tiff로 저장합니다. 또한 이 특정 계란 챔버의 표면이 어떻게 추출되었는지에 대한 향후 참조를 위해 로그 창 파일을 저장합니다.
       참고: 추출된 얇은 레이어를 개발자전용으로 원래 전개된 모양으로 되돌려야 하는 경우 특히 중요한 정보입니다.
   11. 피지에서 기본 색상 코드와 채널을 병합합니다.
       참고: 필요한 경우, 아토미오신 신호로 선택한 z-stack 레이어를 투영합니다. TLM에서 수집 포커스가 시간이 지남에 따라 약간 변경될 때 선택한 z 스택 레이어의 투영이 필요합니다. 최상의 결과를 얻으려면 최대 1~2개의 z 스택 레이어를 투영합니다.
   12. 결과를 .tiff 파일로 저장합니다.
       참고: 대조군 및 지방2 돌연변이 난자 챔버의 여포 상피로부터의 미오신 II(MRLC::GFP) 신호를 나타내는 얇은 층(선택적 기저 및 정점 표면)의 대표적인 예는 도8에서 확인할 수 있다.
2. 선택적으로 추출된 조직 표면의 데이터 처리
   1. 표백제-형광 라벨의 강도 붕괴를 보상하기 위해 TLM을 보정한다.
      1. 오픈 피지. 파일 > 열기를 사용하여 TLM(예: 보충 파일3에서 TestMovie2_extraction.tif)을 엽니다. 이미지를 선택하여 엽니다.
      2. 색상 채널을 분할하고 이미지 > 색상 > 분할 채널을클릭하여 필요한 경우 16비트 이미지로 변환합니다. 이미지 > Type > 16비트를사용하여 채널을 16비트 이미지(32비트 이미지)로 변환합니다.
      3. 이미지 > 조정 > 표백 보정 > 단순 비율 > 배경 강도 0.0을사용하여 두 채널에서 표백보정을 수행합니다.
         참고: 불만족스러운 결과를 얻을 경우,이 플러그인에서 어떤 수정 방법이 가장 적합 탐색해야합니다 (예를 들어, 간단한 비율 대신 히스토그램 일치를 사용).
      4. 이미지 > 색상 > 채널 병합을 클릭하여 두 표백 보정 이미지의 채널을 병합합니다. 파일 > 저장 > Tiff를클릭하여 병합 된 이미지를 .tiff 파일로 저장합니다.
         참고: 필요한 경우 채널의 대비와 밝기를 조정합니다.
   2. TLM용 셀 마스크를 생성하는 셀 세분화
      1. 피지가 아직 열려 있지 않은 경우, 그것을 다시 엽니 다 (그리고 도움말을 클릭하여 최신 인지 확인 > 업데이트 > 변경 사항을 적용 > 확인).
      2. 아직 그렇게하지 않은 경우, 매크로 TissueCellSegmentMovie.ijm (http://adm.irbbarcelona.org/matlab/TissueCellSegmentMovie.ijm)를 다운로드합니다.
      3. 이 스크립트를 피지로 끌어 놓습니다. 표백 보정 된 파일을 엽니 다 (예를 들어, 보충 파일3에서 TestMovie2_bleach.tif, 또한 참조 2.2.1).
      4. 이미지 > 색상 > 분할 채널을 클릭하여 표백 보정 된 파일의 채널을분할합니다. 멤브레인 채널을 조정하여 이미지 > 조정 > 밝기/콘트라스트를클릭하여 명확한 셀 윤곽을 확인합니다.
      5. 선택한 TLM의 활성 세포막 채널에서 업로드된 스크립트를 실행하려면 열린 스크립트에서 실행 아이콘을 누른 다. 가우시안 흐림 효과를 1.500으로설정합니다. 셀 감지 감도를 -1로 설정하고 확인을클릭합니다. 40배 목표달성된 TLM의 경우 예상 노이즈 허용 오차를 ~8로 설정하고 확인을클릭합니다.
         참고: 좋은 셀 마스크를 얻으려면 위의 매개 변수를 변경하지 마십시오. 다른 목표의 경우 다른 매개 변수가 필요할 수 있습니다. TLM의 배경이 깨끗할수록 예상 노이즈 허용 오차가 낮아야 합니다.
      6. 생성된 셀 마스크는 분석된 TLM과 ParticleStack(G)이라는새 창에도 나타납니다. 또한 필요한 작업이라는 작은 창이 나타납니다. TLM의 셀 마스크에서 TLM 중앙에 있는 셀에만 초점을 맞추고 TLM 전체에 걸쳐 완전하고 잘 정의된 윤곽선을 제공할 수 있는 셀을 선택합니다.
      7. 선택한 셀에 인공/추가 셀 윤곽선이 포함된 경우 TLM에 필요한 작업이라는 병합 도구 창을 사용합니다. 후자의 경우 창의 지침을 따르십시오.
         참고: 어떤 부정확성이 후속 분석에 영향을 미칠 수 있기 때문에 세포 윤곽이 잘 정의되고 TLM에 있는 실제 세포막에 대응한다는 것을 확인하십시오. 원치 않는 셀 제거와 같은 추가 조정 및 변경 사항은 나중에 Surface 관리자 도구(아래 자습서에 설명)를 사용하여 수행할 수 있습니다.
      8. 중앙에 있는 셀이 실제 세포막과 잘 일치하면 FileStack을 파일 및 저장 As > Tiff다음에 .tiff 파일로 저장합니다. 앞서 섹션 1.1.3 및 1.2에서 수행된 바와 같이 Surface Manager에서 생성된 셀 마스크 및 아토미오신 분석의 로딩을 수행하기 위해 진행한다(또한 섹션 2.2.3 및 2.3에서 상세히 설명).
   3. 생성된 셀 마스크를 Surface 관리자로 로드
      1. Surface 관리자 플러그인이 이미 피지 설정에 설치되어 있는 경우 2단계로 진행합니다. 그렇지 않은 경우, Viktorinova 외^16을따르십시오. 개발자의 경우 소스 코드만¹⁵.
      2. 플러그인 > 세분화 및 표면 관리자 (3D)를클릭하여 표면 관리자를 엽니 다.
         참고: Surface 관리자 창에는 오른쪽에 여러 작업 버튼이 표시되고 왼쪽에는 빈 창이 표시됩니다. 모든 작업 단추를 보려면 높이/너비에서 창을 늘여야 할 수 있습니다. 시간 프레임은 z-슬라이스로 표시됩니다.
      3. 파일 >를 통해 표면 관리자에 해당 ParticleStack.tif 파일을 열고 열 이미지를 선택합니다 (예 : 보조 파일3에서 ParticleStack2.tif).
      4. Surface Manager에서 개요 이미지 읽기 단추를 클릭하고 자카드 인덱스를 60%로 설정합니다.
         참고: ParticleStack.tif 파일을 로드하는 데 컴퓨터 전원에 따라 최대 몇 분이 걸릴 수 있습니다.
      5. 로드되면 각 셀은 S 번호로 할당되며 Surface 관리자 창의 왼쪽부분에 나타납니다(그림 7A).
         참고: 모든 셀에 대한 윤곽선과 셀 이름을 표시하려면 Surface 관리자 창 하단에 있는 모든 표시 및 레이블 표시 확인란을 선택합니다. 셀 번호가 정확성을 확인한 후에는 이 기능을 사용하는 것이 좋습니다.
      6. 첫 번째 S 번호를 클릭합니다. ParticleStack.tif에서 가져온 셀 윤곽선이 TLM에 나타납니다. 가져온 각 S 번호에서 TLM 전체에서 셀 윤곽선 품질이 있는지 확인하고 잘못된 셀 윤곽선을 표시하는 원치 않는 셀을 제거합니다. 이렇게 하려면 셀 윤곽선을 강조 표시하고 삭제단추를 클릭합니다.
         참고: 또한 부정확한 셀 윤곽선을 수정하고 새 셀 윤곽선을 추가할 수도 있습니다. 이것은 토론 섹션에 설명되어 있습니다.
      7. 디스크에 저장 버튼을 눌러 모든 수정 된 셀을 RoiSet.zip 파일로 저장합니다.
         참고: 세션을 중단해야 하는 경우 나중에 RoiSet.zip 파일을 Surface 관리자에 로드할 수 있습니다. 다음과 같이 표면 관리자를 엽니 다: 플러그인 > 세분화 > 표면 관리자 (3D). 디스크 버튼에서 로드를 클릭하고 적절한 RoiSet.zip 파일(예: TestMovie2_RoiSet.zip)을 선택하여 해당 RoiSet.zip을 로드합니다. 로드된 셀 마스크가 로드된 TLM에 해당하는지 다시 확인합니다.
3. 표면 관리자의 아토미오신 펄스 분석
   참고: 피지를 열고 TLM 및 해당 셀 마스크가 Surface 관리자에서 열려 있는지 확인합니다. 피지가 설치되고 최신 상태이고 표면 관리자 플러그인(https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager)이 설치되었는지 확인합니다.
   1. 파일 > 열고 열 TLM을 선택 (예 : TestMovie2_bleach.tif)와 TLM을 엽니 다. 플러그인을 통해 표면 관리자 플러그인을로드 > 세분화 > 표면 관리자 (3D). 파일 >를 열고 셀 마스크(예: ParticlesStack2.tif)를 선택하여 자습서에서 만든 저장된 셀 마스크를 로드합니다(예: ParticlesStack2.tif). 해당 ROI(예: TestMovie2_RoiSet.zip)를 로드합니다.
   2. 선택한 TLM의 관심 채널로 전환합니다.
      참고: 채널을 구분하려면 TLM 주위에 표시된 색상 코드를 따릅니다.
   3. Surface 관리자에서 통계 단추를 클릭하여 평균 회색 값 슬라이스(그림7B)라는창을 가져옵니다. 시간이 지남에 따라 정의된 셀 윤곽선 내에서 주어진 분석 채널에서 actomyosin 신호의 평균/중앙값은 셀 영역 및 셀 모양과 관련된 다른 파라미터뿐만 아니라 표시됩니다.
      참고: 강도 값은 A.U.에 있습니다. 셀 영역은 픽셀 단위이며 평방 마이크로미터로 변환해야 합니다.
   4. 얻은 값을 스프레드시트 파일로 저장: 통계 창, 파일 > 로저장을 클릭합니다.
      참고: 나중에 얻은 통계 값을 다음과 같이 확인할 수 있다. 피지에서 표백제 보정 TLM을 엽니다. 표면 관리자를 엽니다. 디스크 단추에서 로드를 눌러 해당 RoiSet.zip을 TLM에 로드하고 파일을 엽니다. 셀 윤곽선이 있는 저장된 마스크가 업로드되고 셀 이름이 왼쪽 Surface 관리자 창에 나타납니다. 통계 값을 보려면 통계 단추를 클릭합니다.
      참고: 개별 세포 내 아토마이오신 신호의 수동 분석에관해서는, 조직 규모에서 세포내 아토미오신 신호의 수동 분석을 수행할 수 없다. 토론 섹션에서 강조한 바와 같이 반조직 척도에서 개별 actomyosin 신호를 분석하기 위해 최적화가 필요합니다.

결과

이 프로토콜은 과학자가 상피 조직에서 actomyosin 네트워크의 행동을 조사할 수 있게 합니다. 이것은 국소 세포 규모 (몇몇 세포)에서 actomyosin 행동의 상세한 분석이 조직 규모 (많은 세포)에서 유사한 분석과 결합될 때만 가능합니다. 그러나, 상피 조직은 종종 구부러지고 이들 조직의 얇은 층의 추출은 이전에 는 Drosophila 난자 챔버에 나타난 바와 같이 쉽게 불가능하였다 (그림 1). 여기에 제시된 프로토콜은 이러한 두 스케일 모두에서 actomyosin 동작을 분석하는 방법을 설명하는 간단한 지침을 사용자에게 제공합니다(그림 2).

이 프로토콜의 첫 번째 부분은 Surface 관리자 플러...

토론

계란 챔버의 해부 및 배양에 대한 중요한 단계 및 문제 해결

너무 많은 파리가 작은 유리병에 배치되는 경우, 플라이 푸드는 먹이 애벌레와 성인 파리가 플라이 푸드에 갇혀 점점 먹이 애벌레의 광범위한 양으로 인해 2-3 일 후 진흙 투성이를 설정할 수 있습니다. 이러한 경우, 이들의 나머지 는 신선한 음식과 새로운 유리병으로 파리를 뒤집고 자신의 수를 축소. 특히 음식에 갇힌 암컷은 제외한다.

슈나이더 믹스(SM)는 미리 제조되어야 하며~ 14일 동안 4°C에서 보관할 수 있다. 오래된 혼합물은 계란 챔버의 표면을 손상시킬 수있는 결정을 포함 할 수 있음을 유의하십시오. 항상 SM을 갓 첨가한 인슐린과 혼합하고 실온에 도달할 수 있는 충분한 시간을 허용하십시오. 이것은 감기 쇼크에 대한 계란 챔버를 보호, 이는 미세 소관의 성장과 세포 골격의 평면 정렬에 부정적인 영향을 미칠 수있는 (개발 Dr...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
슈나이더 미디엄	Gibco	21720-024	[+]-글루타민
페니실린/스트렙토마이신	Gibco	15140-122	[ +] 10.000 units/mL 페니실린 [+] 10.000 &마이크로; g/mL 스트렙토마이신
태아 소 혈청	시그마	F135	열 비활성화
인슐린 솔루션 Human	Sigma	I9278
50 mL 팔콘 튜브	Eppendorf		멸균
Millex-GV 필터	Millipore	SLGV033NS	33 mm
유리 바닥 마이크로웰 접시	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C	35 mm 페트리 접시, 14 mm 마이크로웰, No. 1.5 커버 유리
집게	A. Dumont & Fils		#55
CellMask Deep Red (세포막 염료)	Invitrogen	C10046
FM4-64 (세포막 염료)	ThermoFisher/Invitrogen	T13320
우울증 해부 슬라이드	Fisher Scientific	12-560B
Microscopic equipment
Steromicroscope	예: Zeiss		Stemi SV 6
도립 컨포칼 현미경	예: Zeiss/Olympus
스피닝 디스크 현미경	예: Zeiss/Andor
현미경/커버 유리,	예: Thermo Scientific/Menzel Glas
Cactus tool
Wironit 바늘 홀더	Hammacher	9160020
선인장 척추	Echinocactus grusonii/barrel cactus
Drosophila 원고에 사용된 스톡
AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP			자세한 내용은 Rauzi et al.: Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodeling을 참조하십시오. Nature 2010, Vol. 468, pg. 1110-1115.
AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP; fat258D/fat2103C			자세한 내용은 Viktorinova et al.: 상피 회전은 actomyosin의 평면 대칭 파괴에 의해 선행되며 세포 변형으로부터 상피 조직을 보호합니다. PLoS Genetics 2017, Vol. 13, Issue 11, pg. e1007107.