여기, 선물이 형광 단백질 유전자 결합된 괴기 하 게 명료한 photoactivatable를 포함 하는 프로토콜. 이러한 형광 단백질 키메라 photoactivation 효율성 즉, 형광, 수의 photoactivated는 PA FP 분수의 정량화를 허용 합니다. 프로토콜은 photoactivation의 다양 한 모드로 다른 photoactivation 효율성 산출을 보여준다.
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이 논문에서
요약
초록
Photoactivatable 및-컨버터블 형광 성 단백질 (PA-FPs) 세포와 단백질 앙상블의 역학을 분석 하기 위한 형광 라이브 셀 현미경에 사용 되었습니다. 지금까지, 방법은 없습니다 대량에서 계량 수 되었으며 라이브에서 PA-FPs의 얼마나 많은 표현 세포 형광을 photoactivated 있습니다.
여기, 우리가 현재 내부 통치자를 포함 하는 프로토콜, 즉, 유전자 결합 spectrally 별개 (photoactivatable) 형광 단백질, ratiometrically 모든 PA-FPs의 것에 전환 하는 셀에 표시의 일부분을 계량 형광. 이 프로토콜을 사용 하 여, 우리는 photoactivation의 다양 한 모드로 다른 photoactivation 효율성 나왔고 보여줍니다. Confocal 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM) 짧은 고 전력 photoactivation CLSM으로 적용 하는 낮은 수준의 노출 또는 widefield 조명에 의해 적용 짧은 펄스의 수백 보다 4 배 더 낮은 photoactivation 효율까지 결과. 프로토콜 GFP (펜 실바 니 아-)와 (펜 실바 니 아-) 체리 여기 궁 행 되는, 하는 동안 그것은 원칙에 적용할 수 있습니다 어떤 괴기 하 게 명료한 photoactivatable 또는 photoconvertible 형광 단백질 쌍 및 모든 실험 설정.
서론
2002 년, 첫 번째 광범위 하 게 적용 가능한 photoactivatable (PA-GFP1) 및 photoconvertible (가2) 형광 단백질 설명 했다. 자외선과, 즉, 방사선 조사 시 스펙트럼 그들의 속성을 변경 하는이 광 형광펜 형광 단백질 그들은 밝은 될 (photoactivatable 형광 성 단백질, 즉, PA FPs), 또는 (photoconvertible 그들의 색상을 변경 FPs)입니다. 날짜 하려면, 여러 가지 되돌릴 수와 돌이킬 수 없는 photoactivatable 및 photoconvertible 형광 단백질 개발된3,4되었습니다. 앙상블 또는 대량 연구, 광학 형광펜 subcellular 구획의 연결 전체 셀 또는 단백질의 역학을 공부 하 고 사용 되었습니다. 또한, 광학 형광펜 사용 단일 분자 이미징 기술이 팜5 FPALM6해상도 기반으로 합니다.
비록 중 사진화학 처리 photoact....
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프로토콜
1. 플라스 미드 건설
- 2 색 퓨전 프로브를 생성 합니다. 포유류 세포 식 벡터를 사용 하 여 ( 재료의 표참조)는 mCherry112 , PA mCherry113 제한으로 삽입 되어 있는 사이트 AgeI 및 BsrGI.
- 사용자 지정 올리고 뉴클레오티드 eGFP 및 PA eGFP A206K 돌연변이, 즉, mEGFP PA mEGFP14 사리 BamHI 단편으로 정지 codon 없이 포함 된 단위체 변종 증폭 주문. 5'-AAT TAA CAG TCG ACG ATG GTG AGC 아 그 GGC 개 그 G 3'와 C 터미널 뇌관 5'-AAT ATA TGG ATC CCG CTT GTA CAG CTC GTC 고양이 GC 3' N 맨끝 뇌관을 사용 하 고 식 벡터의 다중 복제 사이트에 삽입이 사리 BamHI 조각. 이것은 녹색과 적색 형광 단백질 사이 5 개의 아미노산 링커 RNPPV을 만듭니다. 우리 GFP fluorophore 키메라를 참조 한다-체리, PA-GFP-체리, 그리고 GFP-PA-벚꽃이 문서의 나머지 부분에 대 한....
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결과
여기에 제시 된 프로토콜 표시 photoactivated 형광 수은 형광 단백질의 분수의 비율 정량화 (그림 1). 이 분수는 photoactivation의 모드에 따라 다릅니다.
Confocal 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM) 짧은 시간 고 전력 photoactivation를 사용 하 여 일반적인 결과 그림 2 c에 표시 됩니다. 픽셀에 의해 대물 렌즈에서 측정 된 레이저 힘 titrating 후 연연 시간 및 ATOF 전송, 최대 photoactivation 효율 PA GFP가 약 8%와 PA-체리에 대 한 약 16%. PA GFP와 PA-체리의 comparably 낮은 photoactivation 효율성 동시 photoactivation 및-CLSM에.......
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토론
지금까지, 방법은 없습니다 대량에서 PA-FPs의 라이브 셀에서 표현 photoactivated 형광 하는 분수 결정에 존재. 어떤 괴기 하 게 고유한 형광 단백질 쌍 제시 프로토콜을 사용할 수 있습니다. PA FPs PA-GFP와 PA-체리는 돌이킬 수 없는 대 한 여기 exemplified, 동안이 방식은 원칙적으로 뿐만 아니라 photoconvertible 단백질에 적용 합니다. 그러나 괴기 하 게 고유한 형광 단백질,, 선택 되어야 합니다 신중 하 게 photoconvertible 형광 단백질 이동 그들의 흡수도 및 방출 스펙트럼, 예를 들면 녹색에서 빨간색 형광을 그 스펙트럼 중복을 최소화 하기 위해.
위에서 설명한 대로 제시 접근 비율입니다 상태로 중요 하 고 강도 기반입니다. 그것은 photoactivation의 다른 모드 셀에 알 수 없는 표현 레벨을 표준화 하 고 photoactivation 효율성에서 상대적인 차이 정의를 사용할 수 있습니다. 프.......
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
우리는이 프로젝트에 대 한 장비와 공간을 제공 하기 위한 Dorigo 실험실 그리고 스탠포드 대학의과 대학에서 신경 과학 이미징 서비스를 감사 하 고 싶습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| pEGFP-N1 포유류 세포 발현 벡터 | Clontech | ||
| DMEM w/o 페놀 레드 | Thermo Fisher Scientific | 11054020 | |
| 페놀 없는 트립신 Thermo | Fisher Scientific | 15400054 | |
| L-글루타민 (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| LabTek 8웰 챔버 #1.0 | Thermo Fisher Scientific | 12565470 | |
| Fugene 6 | Promega | E2691 |
참고문헌
- Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A.
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재인쇄 및 허가
