방법 논문

Biocytin 복구 및 채워진된 Hippocampal CA2 수의 3D 복원

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⸱

DOI:

10.3791/58592

⸱

2018년 11월 20일

 ,  , 
1Department of Pharmacology, University College London

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기에 설명 된 프로토콜 설명 면역 형광 분석, biocytin 복구 hippocampal CA2 수는 세포내 electrophysiological 녹음 생체 외에서, 수 있도록 신경 다음의 높은-품질 개조 특성화 고 궁극적으로 훌륭한 신경 해부학 공부를 해야.

초록

어떻게 처리 하는 대뇌 피 질의 네트워크 활동 정보는 기본 및 임상 과학 질문의 다 수 중요 합니다. 여기에 설명 된 프로토콜이이 회로의 기본 구성 요소를 식별 합니다. 대뇌 피 질 영역의 심층 연구 회로 구성 요소와 다른 과학자 들은 두뇌 획득 하는 방법에 대 한 이해에 필요한, 처리 하 고 정보 및 어떤 질병은 electrophysiological 동안에 잘못 되 면 저장 제공 궁극적으로 것 이다 그리고 형태학 상 데이터 계산 신경 네트워크 모델을 찾아보기 정보 처리의 건설에 의해 널리 사용 됩니다. 여기에 설명 된 프로토콜에 설명 합니다 어떻게 해 마 CA2 영역에 기록 biocytin 가득 세포를 복구 하 여 다음 3d에서 재구성. 또한, 프로토콜 칼슘 의무적인 단백질 또는 펩 티 드 콘텐츠 기록된 수의 데모를 설명합니다.

서론

피 질과 해 마는 이러한 복잡성을 신경의 분류 하위1,2,3,4, 그들 사이 연결의 지도5,6 의 구조 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 고이 회로 인지 기능12,13,,1415 를 지원 하는 방법을 아직도 강렬한 연구와 지속적인 토론의 주제 아래 있습니다. 예를 들어 세부 사항 및 회로의 복잡성을 이해 하 고 많은 다른 연구에서 얻은 데이터를 조정 그것 정의 하 고 구성 요소, 설명 수 친절 하지만 어떻게 논쟁에 대 한 문제에 남아 있다 다른 많은 클래스의 존재, 또는 특정 클래스에 속한 모든 신경 세포를 정의 가능 여부입니다. 전산 도구를 구축 하 고 복잡 다양 한 각도와 회로 테스트할 수 있습니다 개발된16,,1718, 하지만 이러한 노력에 중앙은 셀 유형의 상세한 연구에 대 한 필요성 그리고 그들 사이 연결의 속성. 많은 양의 성인 쥐의 피 질 지역 회로 대 한 정보는 이미 수집 된를 사용 하 여 프로토콜 설명 여기10,,1920,21, 22. "배선 다이어그램" 완전 한에서 멀리 이다, 일부 취소 패턴 또는 규칙 등장. 또한, 일부 내용은 다르지만, 이러한 규칙은 일반적인 두 포유류 종 (쥐와 고양이)와 여러 neocortical 지역에 걸쳐 인간의 피 질에 동등 하 게 적용 될 가능성이 기본 빌딩 블록의 개발을 허용. 여기에 설명 된 기술은 식별 연 접 및 postsynaptic 신경 영역을 공부 하지 않은 전에, 자세하게는 프로토콜을 사용 하 여 연결에 참여 하 여 대뇌 피 질의 회로의 기능 지도 대 한 우리의 이해를 확장 하는 데 사용 됩니다. 그 성인 뇌 조직에 우수한 조직 보존 및 놀라운 얼룩 복구 수 있습니다. CA2에 로컬 회로 및이 하위 필드 연결 속성에는 데이터, biocytin 세포내 electrophysiological 녹음 (쌍된 녹음 날카로운 microelectrodes와) 결합 하 여이 방법으로 수집 된 면역 형광 검사, 조직학 절차 및 매우 상세한 신경 개조, 이웃 캘리포니아 지역23,,2425와 직접 비교를 허용.

이 문서에서 설명 하는 기술은 자세한 신경 해부학 세포와 높은 품질의 정확한 분류와 둘 다 그들의 수지상 및 axonal 아 버, 될 수 있는 데이터의 정확한 개조를 수 년에 걸쳐 개발 되었습니다. 날카로운 전극을 사용 하 여 쌍을 이루는 녹음에서 수집한 electrophysiological 데이터와 상관 된다. 조직학 프로토콜은 보존 하는 뉴런의 열 대권 외 고 얻을 수지상 (등 쪽이) 및 axonal 버는 우수한 복구 최적화 되었습니다. 예를 들어 통 솔루션에 immersing 첫째와 둘째 오스뮴 tetroxide에 고정 후 이중 고정 기술의 원리는 가벼운 현미경 검사 법26좋은 대조를 제공 합니다. 글 고 picric 산 솔루션의 소량 항 체 침투를 강화 하 고 세포의 열 대권 외의 이전 연구27에 제안으로 보존 하 통 솔루션에 추가 됩니다. 전통적인 세제 보다는 자당, cryo-보호와 함께 동결-해 동 방법을 사용 하 여 뇌 조각의 permeabilization 또한 기록 된 셀의 자세한 형태소 분석에 대 한 조직의 최적의 보존을 제공 합니다. 또한, 특히 매우 미세 구조의 시각화는 배경, 과산화 수소 (H2O2)와 나트륨 borohydride (NaBH4) 외피와 착 색을 줄임으로써 향상 됩니다. 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP)를 니켈 염화 물 (NiCl2)를 추가 검은 색소 반응 제품을 얻기 위해 반응 또한 대비를 높입니다.

다음 프로토콜 우수한 조직 보존 및 매우 상세한 신경 3D 복원 생체 외에서세포내 기록을 확인 하는 데 사용 하는 절차를 설명 합니다. 조각 준비 설명 사용 하 여 세포내 짝된 녹음 날카로운 전극 그리고 우리의 실험실에서 사용 되는 후속 조직학 절차 이전에 보고 된28. 450-500 μ m 두꺼운 조각에서 biocytin 침 가득 셀에 적용 되는 프로토콜, 비록 동일한 프로토콜 전체 세포 기록에 따라 사용할 수 있습니다. 그러나, 얇은 슬라이스를 사용 하 여 셀의 덜 완전 한 복원 발생 합니다.

프로토콜

이 연구에서 사용 되는 모든 절차 동물 과학적인 절차 법 1986에 관해서는 영국 본사 규정에 따라 실행 되었다.

1. 단백질 또는 수 및 Biocytin 시각화 Electrophysiological 녹음 및 Biocytin 작성의 단백질 함량을 바인딩 칼슘의 결정

참고: electrophysiological 녹음의 끝에, 조각 biocytin 가득 셀을 포함 하는 조직학 절차 전에 하룻밤 고정 됩니다. 절차의 나머지 조직 손상을 방지 하기 위해 또 다른 하루에 수행 됩니다 경우 통 솔루션 다음날 아침, 0.1 M 인산 염 버퍼의 단일 변경으로 대체 됩니다. 고정 솔루션 (4 %paraformaldehyde, 0.2% 포화 picric 산 솔루션, 0.1 M 인산 버퍼 (PB)에 0.025%도 솔루션) 신선한 최상의 결과 대 한 녹음 당일에 제출 합니다.

  1. Electrophysiological 녹음의 끝에, 신중 하 게는 페인트 브러시와 함께 기록 된 셀을 포함 하는 슬라이스를 선택 하 고 포함 하는 인공 뇌 척추 액체 (실제) 냄비에.
    참고: 슬라이스 준비 및 세포내 녹음 날카로운 전극을 사용 하 여 사용 하는 프로토콜의 세부 사항이 되었습니다28위에서 설명한.
  2. 증기 두건에서 신중 하 게는 페인트 브러시와 함께 두뇌 슬라이스를 선택 하 고 좋은 품질의 필터 종이의 작은 조각에 그것을 롤. 조각에 moistened 필터 지의 다른 조각을 놓고 통 솔루션 및 상점 4 ° c.에 하룻밤 냉장고에서 5-10 mL를 포함 하는 작은 플라스틱 남 비에 젖은 필터 종이의 두 가지를 배치
  3. 증류수에 젤라틴의 솔루션을 준비 합니다. 뜨거운 접시에 비 커에 증류수 20ml를 배치 하 고 60 ° c 열 물에 젤라틴의 점차적으로 2.4 g을 추가 하 고 해산 될 때까지 기다립니다 조직 손상을 방지 하기 위해 사용 하기 전에 35-40 ° C에 냉각 허용.
  4. PB 0.1 m M의 2 mL에 통 솔루션을 바꿉니다. 페 트리 접시에 슬라이스를 놓고 어떤 과잉 조직을 메스 칼 날 버려야 합니다. 트림 된 조직 (9 cm의 직경, 1.4 c m의 높이) 페 트리 접시에, 그것은 거짓말 주름 또는 주름을 평평 하 고 건조 페인트 브러시를 사용 하 여 초과 버퍼를 제거.
  5. 따뜻한 젤라틴 솔루션 조직 커버 하 고 신속 하 게 솔루션을 냉각 냉동된 블록에 페 트리 접시를 놓습니다.
  6. 대비를 제공 하는 앵글 포 이즈 램프를 사용 하 여, 접시의 측면을 통해 모양과 조각 젤라틴 설정 때까지 좋은 붓에서 가벼운 압력을 사용 하 여 평면 유지.
    참고: 젤라틴 수 다시 녹 인 경우는 조직 평면 거짓말을 하지 않습니다. 그것은 굳은 때에 붓의 제거로 인 한 젤라틴의 표면에 어떤 불완전 든 지 몇 초 동안 표면에 가까운 램프의 전구를 이동 하 여 표면 레이어를 부드럽게 용 해 하 여 제거할 수 있습니다.
  7. 냉장고에 설정 젤라틴의 접시를 이동 하 고 30-60 분 동안 4 ° C에 두고.
  8. 작은 블록 잘라 증기 두건에서 (~ 1 x 1 cm) 메스 블레이드를 사용 하 여 접시의 젤라틴 포함 된 조직을 포함 하는, 작은 주걱을 사용 하 여 블록을 들어올려 고 신중 하 게에 4 ° C에서 30 분 이상에 대 한 슬라이스를 해결 하기 위해 사용 된 동일 하지만 신선한 통 솔루션 .
  9. 세 번 0.1 M PB의 5 mL에 젤라틴 블록을 씻어, 종이 조직 및 막대기는 vibratome에 (즉, 상단에 조직으로) 최대 블록 측면 superglue를 사용 하 여 척의 조각을 사용 하 여 그것을 건조.
  10. 필터 종이의 조각으로 과잉 접착제를 제거 하 고 블록의 모서리를 잘라 메스 블레이드를 사용 하 여 다이아몬드 모양을 떠나.
  11. 50 µ m 두께 vibratome를 사용 하 여 슬라이스를 제 하 고 10% 자당을 포함 하는 유리 유리병에 각 섹션을 신중 하 게 배치.
  12. 신중 하 게 유리병에서 섹션을 선택, 페 트리 접시의 뚜껑에 평면 배치. 해 현미경과 신선한 메스 블레이드 사용 하, 섹션 주위에서 젤라틴을 제거 하 고 신선한 10% 자당의 2 개 mL를 포함 하는 유리병에 섹션을 반환
    참고: 그것은 탈수 단계 (단계 1.37) 조직 수축 량을 줄이기 위해이 단계에서 가능한 많은 젤라틴을 제거 하는 중요 한.
  13. 곳을 알아내는-보호 잠복기 그들 10% 자당 해결책, 20% 자당-6% 글리세롤 용액에 20 분에서에서 10 분 동안 두 번 그리고 마지막으로 30% 자당-12% 글리세롤 용액에 30 분 하 여 실 온에서 0.1 M PB 기반 자당-글리세롤 솔루션에서 섹션 아래 두 번 일정 한 동요입니다.
  14. 그림 붓을 사용 하 여 종이의 작은 사각형에 평평 섹션을 놓습니다. 섹션에서 과잉 액체를 제거 하 고 신중 하 게 소포에 깡통 호 일을 접어.
  15. 30에 대 한 표면을 만지지 않고 액체 질소의 표면 가까이 소포를 잡고 s 다음 동결-해 동 다른 두 번 약 30 s. 반복에 대 한 완전히 해빙 하는 것 섹션을 수 있도록.
  16. 페인트 브러시와 모든 부분을 제거 하 고 초과 자당 씻어 일정 한 동요에서 0.1 M PB의 2 개 mL를 포함 하는 유리 병에 넣어.
  17. 파스퇴르 피 펫으로 PB를 제거 하 고 30 분 씻어 0.1 M PB의 2 mL에 섹션에 대 한 1% 수성 H2O2 의 2 mL에 섹션을 품 어 3 x 5 분.
  18. 파스퇴르 피 펫으로 0.1 m M PB를 제거 하 고 0.1 M 샌드위치에 1% 나트륨 borohydride (NaBH4)을 추가 합니다.
    참고: NaBH 수소 가스4 솔루션 제공으로 유리병, 캡 핑 하지 마십시오.
  19. 나트륨 borohydride 파스퇴르 피 펫을 제거 하 고 세척 섹션에 철저 하 게 2 mL의 0.1 M PB 5 x 5 분.
  20. 0.1 m M PB을 10% 정상 염소 혈 청 (NGS) 30 분 0.1 M 샌드위치에 바꿉니다.
  21. 염소 혈 청을 제거 하 고 마우스 단일 클로 널 및 ABC 솔루션에서 만든 토끼 polyclonal 항 체의 혼합물에 4 ° C에서 하룻밤 섹션을 품 어.
    참고: 이전 연구에서 사용 되는 기본 항 체의 목록이 Botcher 그 외 여러분 에서 표 1 에 표시 됩니다. (2014) 29.
  22. 붙일 셔 서 2 차 항 체 (자료 테이블)의 혼합물에 어둠 속에서 2 h에 대 한 섹션을 품 어.
  23. 설치 매체에는 coverslip 커버 슬라이드에 섹션을 탑재 합니다.
  24. 형광 라벨 40 X 확대 (그림 1Bb)의 이미지를 가져가 라.
  25. 형광 이미징, 후 슬라이드 PBS를 포함 하는 유리 페 트리 접시에 놓고는 coverslip를 조심 스럽게 제거 합니다. 다음에 파스퇴르 피 펫에서 PBS의 부드러운 펄스를 사용 하 여 슬라이드 섹션 세척. PBS를 포함 하는 깨끗 한 유리 유리병으로 섹션을 놓습니다.
  26. 첫째로 HRP 반응 제품을 증폭 하는 적어도 2 시간에 대 한 ABC에서 섹션 잠복기 avidin HRP 반응을 수행 합니다.
  27. 증류수 5 mL에 1 개의 정제를 추가 하 여 3, 5 diaminobenzidine (DAB) 솔루션을 준비 합니다.
  28. 3 시간 10 분 대 한 PBS와 섹션을 세척 한 다음 Tris 버퍼 두 번 10 분에 대 한 마지막 세척 후 Tris 버퍼를 제거.
  29. 신속 하 게 소량 솔루션 8% NiCl2 솔루션의 한 방울을 추가, 밖으로 혼합 하 고 신속 하 게 섹션을 통해이 솔루션의 1 mL를 추가 솔루션 플라스틱. 15 분의 DAB/NiCl2 솔루션 섹션을 품 어.
  30. DAB 솔루션 1% H2O2 의 10 µ L를 추가 합니다. 약 1 ~ 2 분에 대 한 지속적인 동요 아래 어둠 속에서 진행 해 현미경으로 채워진된 셀의 라벨 모니터링에 반응을 수 있습니다.
  31. DAB/NiCl2/H2O2 솔루션을 제거 하 여 반응을 중지 하 고 5 분 동안 두 번 Tris 버퍼 섹션을 씻어.
  32. 연기 후드, 필터 종이의 작은 원을 배양 접시에 놓고 0.1 M PB와 함께 저해할. 유리에서 한 번에 하나씩 유리병은 붓을 사용 하 여 고 종이 따라 신중 하 게 평면 배치할 섹션을 들어올립니다.
  33. 필터 종이의 다른 moistened 동그라미 부분을 커버 하 고 표면에 휴지를 부드럽게 만져 초과 버퍼를 제거 합니다.
  34. 최고의 종이를 1% 오스뮴 tetroxide 0.1 M 샌드위치에 8-9 방울을 적용, 접시 커버 그리고 적어도 30 분, 하지만 더 이상 1 시간에 대 한 증기 두건에서 유지 합니다.
  35. 페 트리 접시를 열고 상위 필터 종이 리프트. 섹션을 신중 하 게 리프트를 붓으로 한 번에 하나씩 유리 유리병에 넣어 하 고 증류수에 두 번 그들을 씻어.
  36. 오스뮴 tetroxide 폐기물의 적절 하 게 처분. 모든 일회용 장비 린스 하 고 적절 한 쓰레기통에 넣어.
  37. 평면 유리 슬라이드 coverslip에 각 섹션 섹션을 배치 합니다. 슬라이드 배양 접시에 전송, 빈 유리 병 장소와 50% 알코올로 덮개에 그것을 유지 하는 coverslip 장소. 15 분 후 솔루션에서 슬라이드를 제거 하 고 슬라이드에서 섹션을 제거 합니다. 장소 섹션 다시 슬라이드에 다음 15 분에 대 한 70% 알코올에 슬라이드를 배치 95%와 마지막으로 100% 알코올 솔루션 동일한 프로세스를 반복 합니다.
  38. 탈수 단계 증기 두건에서 통에 100% 알콜을 포함 하는 유리 유리병에 섹션을 전송. 프로필 렌 산화물 (C3H6O)과 알코올 솔루션을 대체 하 고 5 분에 대 한 세 번 씻어. 마지막 세척 다음 유리병에 프로필 렌 산화물의 ~ 2 mL를 유지 하 고 수 지 (1:1 비율)를 추가 합니다. 수 지 용 해 확인 하 고 30 분 동안 지속적인 동요 아래 섹션을 유지.
  39. 나무 막대기를 사용 하 여 에폭시 수 지를 포함 하는 알루미늄 planchette에 각 섹션을 놓고 밤새 품 어.
    참고: 섹션 섹션을 손상의 위험을 피하기 위해 24 시간 보다 더 긴 수 지에 두지 마십시오.
  40. 약 10 분에 대 한 뜨거운 접시 위에 planchette 각 데리 나무 막대기로 섹션 장소와 깨끗 한 슬라이드에 배치. 각 섹션의 방향을 유지 해 현미경을 사용 하 여 일관 된. 장소는 coverslip 부분입니다. 치료를 위한 56 ° C에서 48 h에 대 한 오븐에서 슬라이드를 놓습니다.

2. 3D 신경 복원

참고: Neurolucida 소프트웨어 사용 됩니다. 아래에 제공 된 지침만 특정 신경 재건 시스템 (자료 테이블)에 적용 됩니다. 절단에서 얻은 섹션은 현미경을 사용 하 여 복원 전에 일치 됩니다.

  1. 무대에서 슬라이드 배치 단계 클립 보안 고 신경 재건 소프트웨어를 엽니다. 인식 탭에서 클릭 하 고 라이브 이미지를 선택 합니다.
  2. 오일 렌즈 X 100을 사용 하 여 각 섹션의 두께 측정 합니다. 각 섹션의 위아래에 z 미터에 값의 메모를 만들고 섹션 두께 두 값의 차이 계산.
  3. 낮은 배율 목표를 사용 하 여 홈 셀 바디 포함 된 섹션에 초점을. 다음 100 x 목표를 사용 하 여, 세포 체에 초점 고 센터 참조 지점을 표시를 클릭 합니다.
  4. 추적 탭에서 직렬 섹션 관리자를 선택 합니다. 다음 직렬 섹션 관리자 창에서 새 섹션 만들기 (+ 아이콘)을 선택 합니다. 섹션의 수를 입력 합니다. Z 순서에 따라 각 섹션 이름을 고 단계 2.2에서 측정 컷된 두께 입력 합니다.
  5. 100 X 목표를 사용 하 여 3d에서 소마를 추적, 추적 탭에서 윤곽선 을 선택 하 고 셀 바디 컨투어를 선택 합니다. 조이스틱을 사용 하 여 셀 본문의 맨에 포커스를 이동. 현재 포커스에 있는 부품의 둘레의 주위에 클릭 하 여 포인트를 놓습니다. 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 닫기 컨투어 이 첫 번째 개요를 완료를 선택 합니다. 다른 z 위치에이 프로세스를 반복 하 여 세포 체의 아래쪽에 도달 하면 (그림 2).
    참고: 3d에서 셀 시체를 시각화 추적 탭에서 3D 시각화 선택.
  6. 100 X 목표를 사용 하 여 2D의 셀 시체를 추적 하려면 추적 탭 셀 바디의 중간에 초점에에서 신경 메뉴에서 셀 바디 를 선택 합니다. 세포 체의 둘레의 주위에 클릭 하 여 포인트를 놓습니다. 세포 체를 완료 하려면 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 셀 바디 완료를 선택 합니다.
  7. 수지상 아 버를 추적 하 모 수석 또는 꼭대기 모 수석 신경 메뉴에서 선택 합니다. 처음에 모 수석의 직경에 맞게 커서의 직경을 조정 하려면 마우스 스크롤 휠을 사용 하 여 각 모 수석에 대 한 짧은, 초기 세그먼트 추적. 추적의 직경을 조정 하는 섹션 및 마우스의 스크롤 휠을 이동 조이스틱을 사용 하 여 각 dendrites 따라 추적.
  8. 라이브 현미경 이미지와 추적의 맞춤을 확인 하 고 조정 하는 경우 필요한, 특히 조이스틱을 사용 하 여 이동 후. 추적 탭에서 정렬 추적를 선택 하 고 추적을 클릭 한 다음 올바른 위치에 클릭.
  9. 트리에서 노드에 도달 하면 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 드롭-다운 메뉴에서 Bifurcating 노드 또는 Trifurcating 노드 를 선택 합니다.
  10. 분기의 끝에 도달 하면 신경 메뉴에서 드롭 다운 메뉴에서 결말을 선택 합니다. 올바른 끝 유형, 즉선택., 높은 결말, 정상적인 종료 또는 low 종료 섹션에 걸쳐 일치를 촉진 하기 위하여.
  11. 현재 섹션의 모든 모 수석 추적 않은 기쁨 무료 탭을 선택 하 고 위 또는 완료 섹션 아래 즉시 일치 하는 섹션으로 이동 되 면 현미경에 확대를 줄일 수 있습니다.
  12. 완료 된 섹션을 일치 하는 섹션에서 dendrites 사이의 일치 지점을 식별 하기 위해 이동 탭을 클릭 하 고 일치 포인트를 선택 합니다. 일치 하는 데 필요한 포인트의 번호를 선택 (3 개 이상의 포인트는 선호) 하 고 확인을 누릅니다. 완료 된 분기의 결말에 클릭 한 다음 분기를 클릭 합니다. 각 경기 지점에 대해이 반복 합니다. 정확 하 게 일치 되도록 100 배 확대에이 프로세스를 반복 합니다.
  13. 직접 결말을 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 여 이전 섹션에 일치 분기를 추가 합니다. 분기 완료 추적된 지점 및 추적으로 앞에서 설명한 라인 결말에 추가 선택 합니다.
  14. 일단 각 섹션의 모든 모 수석을 추적 축 색 Axon 신경 메뉴에서 선택 하 여 동일한 프로세스를 사용 하 여 추적 합니다.
  15. 홈 섹션 다시 정렬 라이브 현미경 이미지로 재구성 윤곽선 추적 탭 선택에서에서 미리 정의 된 윤곽선/레이어 테두리/지역 테두리 선택한 클릭 합니다는 윤곽선을 따라 추적할 이동 합니다. 최종 오픈 컨투어를 선택 합니다. 모든 원하는 레이어 및 지역 윤곽선을 추적 합니다.
  16. 사용 하 여 3D 시각화 추적 탭에서 3 차원에서 개조를 시각화.
  17. 3D 복원 (비디오 1)의 기록 비디오, 3 차원 재구성 열고 만들기 영화를 엽니다. 파일 대상을 설정 하 고 원하는 회전 속도. 270 ° 회전을 설정 하는 것이 좋습니다. 녹음을 시작, 몇 초 동안 레코드 선택 클릭 자동 회전. 필요할 때 기록 중지 를 선택 합니다. 편집 비디오 비디오 편집 소프트웨어 (자료 테이블)와 함께.
  18. Tiff 또는 JPEG 파일로 파일을 내보내려면, 파일 선택 | 수출 | 이미지로 내보내기 추적. µ M/픽셀 비율을 선택 하 고 맞는선택 합니다. 배경 색상을 선택 하 고 파일을 선택 합니다. 파일 이름을, Tiff 또는 JPEG를 선택 하 고 저장을 누릅니다. 벡터 파일로 파일을 내보내려면, 파일을 선택 | 수출 | 벡터 파일로 내보내기 추적.
  19. 신경 재건 분석 소프트웨어를 사용 하 여 형태학 분석을 수행 하.
    1. 수지상 나무를 분석 하는 dendrogram 얻을 Neurolucida 탐색기에서 파일을 엽니다. 분석 | 구조 와 선택 Dendrogram 드롭-다운 메뉴 (그림 3)에서.
    2. 3D 복원 (분기 복잡성, 지점과 somas, 표면적의 볼륨)의 포괄적인 형태학 분석을 수행 하는 소프트웨어에서 파일을 엽니다. 보기 탭에서 모두 선택을 클릭 합니다. 분석 탭을 선택 합니다. 다음 분기 구조 분석및 구조 를 선택 합니다.

3. 문제 해결

  1. 카메라 설정을 변경 합니다. 최상의 결과 얻으려면 100 ms 보다는 더 적은 노출 시간 설정 하 고 얻을 가능한 0에 가까운 오프셋.
  2. 신경 재구성 소프트웨어는 자동으로 추적 탭에서 3D 시각화 에 3D 셀 시체로 추적된 컨투어를 표시 하지 않습니다, 하는 경우 추적 탭에서 개체 선택 을 선택, 키보드에서 Ctrl 키와 모든 그린된 윤곽선을 클릭, 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 드롭 다운 메뉴에서 셀 시체를 설정 를 선택 합니다.
  3. 개별 분기의 z 매개 변수를 조정, 트리 ( 추적 탭에서개체 선택 )를 선택 하 고 설정 하려면 마우스 오른쪽 단추 클릭 메뉴를 통해 모든 포인트의 z 조정 드롭 다운. 선택 수정 z 위치, 다음 교대 z 값 을 선택 하 고 필요한 값을 입력.
  4. 사용 하 여 '이동' ' 이동' 탭에서 추적에 큰 거리를 이동 해야 하는 때 개조 재편성
  5. 재건 과정에서 언제 든 지 추가 노드를 추가 합니다. 분기 노드 ( 추적 탭을 클릭 하는 지점에서개체 선택 )에 게, 마우스 오른쪽 단추로 클릭, 삽입 하는 선택 하 고 선택 트리에 노드 삽입을 선택 합니다. 다음 분기에 적당 한 위치를 클릭 하십시오.
  6. 복잡 한 신경 재구성 때 일치 분기를 개별적으로 추적 하 고 나중 지점의 쉽게 식별을 위해 그들을 결합. 새 섹션에 분기를 개별적으로 추적 하 고 다음 접합 될 하 고 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고, 결합, 선택 하는 분기의 결말을 가리키면 다음 결말을 가리키면이 가지 이전 섹션에 일치 분기에 연결 하는 분기를 접합 하 고 클릭 합니다 것입니다.
  7. 분기를 잘못 종류에서 추적 하는 경우 나무를 선택 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 트리 유형 변경, 선택한 올바른 트리 유형을 선택.
  8. 포인트가 올바르게 배치 하는 경우 Ctrl + Z, 수행 하거나 마지막 지점이 제거 추적 메뉴에서 실행 취소 단추를 클릭 합니다. 그러나,이 절차는 점을 제거 하려고 하기 전에 섹션에서 이동 하는 조이스틱을 사용 하는 경우 작동 하지 않습니다. 이 경우에 분기 종료 때 포인트를 제거할 수 있습니다. 제거 하 고 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고, 선택 지점 위로 마우스를 가져가면 분기 (보도 선택 개체 와 지점에 클릭), 선택 포인트를 제거 합니다.
  9. 여부는 지점 z 평면에 일치 또는 2)를 사용 하 여 측면 표시 기능 직렬 섹션 관리자에서 표시 즉시 섹션 확실 두 가지가 일치 여부 중 1)를 사용 하 여 3D 시각화 추적 탭에서 확인 하는 경우 위의 고 회색에서 현재 섹션 아래.
  10. 섹션 대칭 이동 하는 경우 이동 도구 추적 탭에서 XY 배율 조정 하는 것을 선택 하 고-1을 x 축으로 변경 합니다. 다음 올바른 Z-축 을 선택 하 고-1을 z 축으로 변경. 평소 가지를 추적 다음. 원래 방향을 했다 섹션을 이동할 때 이러한 변화를 기억 하십시오. 변화는 x-축 및 z 축 레이블 종료 지점 변경, 그래서 접합 올바른 엔딩이 사용 되 고 있습니다 때 조심 하지 것입니다.
  11. 올바른 Z-수축 단면 절단 두께 측정 탑재 두께 사이의 중요 한 차이가 있다면 수정 될 수 있습니다. 추적 탭에서 도구, 다음 Z 축을 수정, 선택 하 고 탑재 된 두께 나눈 컷된 두께의 소수 표현으로 z 축에 대 한 수축 비율을 입력 합니다.

결과

뉴런 hippocampal CA2 biocytin electrophysiological 녹음 (그림 1Ac, 광고 및 1Bc, Bd) 다음으로 가득 차 있었다. 조각 밤새 녹음을 다음 고정 하 고 신경 및 신경 세포의 형태학 특성 다음 여기에 설명 된 프로토콜을 공개 했다.

칼슘 의무적인 단백질 또는 단백질 콘텐츠 채워진된 수의 조각을 먼저 기본 항 체와 함께 다음 붙일 이라는 2 차 항 체를 배양 하 여 결정 했다. 녹음 하는 동안 수의 발사 특성 사용 기본 항 체의 선택을 쓰게 됩니다. Avidin AMCA biocytin 가득 interneuron 시각화 하는 데 사용 했다 하 고 반대로 마우스 fluorescein isothiocyanate (FITC)와 염소 안티 토끼 텍사스 레드 (TR) interneuronal 신경 (그림 1Bb) 특성을 사용.

형광 시각화 다음 HRP 프로토콜 biocytin (그림 1Ab)를 나타내기 위해 사용 되었다. CA2 수의 잘 상세한 해부학 다음 신경 재구성 소프트웨어 (그림 2 및 그림 3a)를 사용 하 여 3D에서 당겨 졌다. 기록 및 CA2에 가득 바구니 세포의 3 차원 재구성의 비디오는 비디오에 표시 됩니다. 신경 개조 수지상 및 axonal 버는 450-500 μ m 조각의 깊이 내에서 국한 되었다 하는 경우 완료 된 것으로 간주 됐다. 불 쌍 한 axonal 아 버 얼룩 축 삭 머리글자 세그먼트와 매우 인접 가지에 국한 되었다 상단 또는 하단 슬라이스 나는 얼룩에 오픈 엔딩으로 잘린된 분 지의 존재에 의해 평가 되었다. 그림 4 는 좋고 가난한 HRP 얼룩 다음 biocytin 시각화의 예를 나타냅니다.

3D 복원 (그림 3)의 형태학 분석 지점 복잡성, 소마 노출 영역 및 노출 영역 및 수지상 및 axonal 아 버의 볼륨 밖으로 수행할 수 있습니다.

figure-results-1
그림 1 : 바구니 세포의 두 종류의 신경 개조 기록 및 hippocampal CA2 영역에 채워지고 세포내 녹음에 따라 얻은 electrophysiological 데이터 상관 생체 외에서. 이 그림은 이전 연구23,24에서 수정 되었습니다. 그래서 지층 Oriens, SP 지층 Pyramidale, SR 지층 Radiatum, SLM 지층 Lacunosum Moleculare. (A) Aa: 드로잉 튜브 (1000 X)를 사용 하 여 제한 된 수지상 및 axonal 아 버와 CA2 바구니 세포의 재구성. 블랙, 있는 모 수석 그리고 축 삭 빨간색. Ab: 여기에서 설명 하는 avidin HRP 프로토콜 다음 biocytin 가득 바구니 세포의 이미지. Ac: 전압 응답 hyperpolarizing 및 depolarizing는 CA2 바구니 셀 제한 수지상 및 axonal 아 버의 현재 분사의 대표적인 추적입니다. 광고: 예 아 버 바구니 셀 연결 범위 CA2 피라미드의 날카로운 전극을 사용 하 여 기록. 복합 흥분 성의 시 냅 스 후 전위 (EPSP) 평균 3 스파이크의 열차에 대 한 응답 중 짧은 기차 우울증 명백한 표시. (B) 바: 드로잉 튜브 (1000 X)를 사용 하 여 넓은 수지상 및 axonal 버는 CA2 바구니 셀의 2D 재건. (블랙)에이 바구니 세포의 수지상 나무 CA2 영역 및 수평에 등등 CA2, CA3 영역의 SP의 모든 레이어를 통해 광선으로 확장. 한 수평 모 수석에 CA1 영역에 도달 했습니다. (빨간색)으로 축 삭 연장 CA1 고 CA3 영역. Bb:는 biocytin 가득 (AMCA 얼룩) 바구니 세포는 태양광 발전-immunopositive (FITC 얼룩) 및 CB-immunonegative (텍사스 레드 얼룩). 기원전: 전압 응답 hyperpolarizing 및 depolarizing 넓은 수지상 및 axonal 아 버와 CA2 바구니 세포의 현재 분사의 대표적인 추적입니다. Bd: 복합 EPSP 평균 보여 짧은 기차 촉진 명백한 3 스파이크의 열차에 응답 하는 동안. 이전 연구25,30에서 CA2에 기록 하는 수의 다른 유형의 예를 찾을 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 

figure-results-2
그림 2 : 3D 셀 바디 재건. (A) 세포 체의 3D 추적 세포 체를 통해 집중 하는 동안 다른 z 위치 추적 다른 윤곽선의 보기. (B) 다른 윤곽선의 3D 보기. (C) 다른 각도에서 세포 체의 3 차원 보기. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 

figure-results-3
그림 3 : 3D 신경 개조의 Morphometry 분석. (A) CA2 좁은 목 바구니 세포의 3D 개조. 수지상 각 분기 (녹색, 파란색, 빨간색 및 분홍색) 색상으로 표시 됩니다 하 고 축 삭은 밝은 파란색. (B) Dendrogram 수지상 가지의 수 고는 소마와 소마는에서 100 μ m 간격 동심 구체에 포함 된 각 세그먼트의 길이 나타내는 바구니 세포의. dendrogram에 색상 dendrites CA2 피라미드 세포 (이전 연구23에서 적응)에 대해 수행 하는 형태학 분석의 대답 (C) 예에서의에 해당 합니다. 수지상 가지의 수 CA2 피라미드 세포의 소마에서 거리에 대 한 구성 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 

figure-results-4
그림 4 : (A) 좋고 가난한 (B) HRP 얼룩의 예. (A) Biocytin 복구 CA2에 아주 잘 채워진된 interneuron 공개. 셀 바디 (CB) 스테인드 음울 하 고 명확한 윤곽선을 있다. 모 수석 파란색은 하 고 어떤 쪽이 (붉은 별 표시)을 표시 합니다. Axonal 아 버 (A)이 고 작은 boutons를 선물 한다. (B)는 가난한 수지상 및 axonal 얼룩 CA2에 2 피라미드 세포의의 예입니다. CB의 얼룩은 아무 명확한 윤곽선으로 희미 한입니다. 불 쌍 한 얼룩은 종종 관련 짧은 electrophysiological 녹음과 거의 biocytin 가득 분기의 결과입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 

비디오 1: 제한 된 수지상 아 버 (CA2 좁은 목 바구니 세포 라고도 함) 지층 pyramidale, 모든 레이어와 CA2 지층 pyramidale에 인접 한 지층 oriens 축 삭 모 수석에에서는 소마와 함께 CA2 바구니 세포의 3D 신경 재건 그리고 radiatum. 아주 몇 가지 인접 CA3 지층 oriens 고 CA3 지층 pyramidale에 도달. 이 셀 biocytin electrophysiological 녹음 다음으로 채워졌다 고 섹션 avidin HRP 여기에 설명 된 프로토콜에 따라 처리 했다. 비록 모 수석 그대로 슬라이스, 때문 조각의 깊이 내 축 삭만 복구 했습니다. 모 수석 어두운 핑크와 화이트에 축 삭에 있습니다. 레이어 및 지역 경계는 비디오의 시작 부분에 추가 되었습니다. Svenja 포크에 의해 조지아 Economides-3D 비디오 3D 개조. 동영상 단계 2.17에 명시 신경 재구성 소프트웨어와 함께 기록 하 고 비디오 편집 소프트웨어와 함께 편집 했다. 동영상에 링크:30. 이 비디오를 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

사용 하는 솔루션구성/지침
고정 솔루션4% paraformaldehyde 0.2% 포화 picric 산 솔루션, 0.1 M 인산 버퍼 (PB)에 0.025%도 솔루션
0.1 M 인산 버퍼 pH 7.6증류수의 900 mL를 100 mL의 1 M 인산 염 버퍼 재고 추가
인산 염 (PBS) pH 7.4/7.5 버퍼링0.1 M 인산 염 버퍼, KCl과 NaCl의 8.76 g 990 mL 증류수를 0.2 g의 10 mL을 추가
TRIS 버퍼 pH 7.5분해 트리 스 염 산 및 증류수 50 mL에 트리 스 기지의 1.66 g 5.72 g. 증류수 1 L를 확인 하십시오.
버퍼링된도 및 paraformaldehyde 통 솔루션4% paraformaldehyde 0.2% 포화 picric 산 솔루션, 0.1 M 인산 염 버퍼에서 0.025%도 솔루션.
ABC 솔루션솔루션 ABC 키트에서 사용 하기 전에 적어도 30 분을 만들 수. 2.5 ml PBS의 솔루션의 1 방울과 솔루션 B의 1 방울을 추가 합니다.
Durcupan 에폭시 수 지:20 냄비 만들기 위해:의 구성 요소, 구성 요소 B의 20 g, C의 0.6 g 및 컴포넌트의 D-0.4 g 20 g
필터 종이의 원형으로 접시를 취재 하 여 유출에서 균형을 보호 합니다. 신중 하 게 상기 비율에서 tripour 비 커에는 시 약의 무게. 적극적으로 두 개의 나무 막대기를 사용 하 여 적어도 5 분 교 반에 의해 철저 하 게 혼합. 혼합물은 균일 한 밀도 어두운 갈색 색깔 될 것입니다. 가능한 많은 기포를 제거 하는 10 분의 최대 ~ 50 ° C에서 오븐으로 비 커를 놓습니다. 참고: 수 지 두고 10 분 Decant 이상 오븐에서 비 커 수 지 플라스틱 남 비 또는 5 mL 주사기로, 그들의 날짜 및 사용에 대 한 준비-20 ° C 냉동 고에 저장 하는 경우 치료를 시작 합니다.

표 1: 솔루션의 테이블입니다. 

토론

Electrophysiological 녹음에서 생체 외에서 (그림 1 Ac,d 및 Bc, d) 조직화 학적인 결합 및 immunohistochemical 절차 세부 형태, 칼슘 바인딩 단백질 콘텐츠를 사용 및 성숙한 대뇌 피 질의 수의 정체성 밝혀 기록. CA2 영역에서이 기술을 처음으로 지역 회로의 연구 허용 한 CA1 또는 CA3에서 이전에 설명 하지 않는 했다 수의 서브 클래스 공개: 넓은 수지상 및 axonal 아 버 바구니 세포 (그림 1B), bistratified 세포와 SP SR 수입니다.

여기에 설명 된 프로토콜은 보존 하는 뉴런의 열 대권 외 고 얻을 수지상 (등 쪽이) 및 axonal 버는 우수한 복구 최적화 되었습니다. 중요 한 단계 가벼운 현미경 검사 법26 대비 향상을 이중 고정 기술의 사용 등도 picric 산 솔루션 항 체 침투를 강화 하 고는 신경 보존을 통 솔루션을 추가 열 대권 외의27 부드러운 동결-해 동 permeabilization osmication 및 수 지 포함 z-비행기 수축28을 줄일 수 있지만 미세 구조의 더 나은 보존을 제공 합니다. 또한, 매우 미세 구조 (예를 들어 작은 boutons와 축 삭 괜 찮)의 시각화 잠복기 섹션 H2O2 와 NaBH4 배경 얼룩을 줄이기 위해 향상 됩니다. 대비는 HRP 반응에 NiCl2 의 추가 함께 또한 증가 수 있습니다.

여기서 설명 하는 조직학 절차 재현성 및 신뢰성 측면에서 우수한 결과 제공 합니다. 그러나, electrophysiological 녹음 기간 biocytin/형광 얼룩, 가난한 axonal 얼룩과 일반적으로 관련 된 짧은 녹음의 품질을 결정 합니다. 프로토콜 (사용 하 여 전체 셀 패치 클램핑 대 날카로운 전극 세포내 녹음) 녹음의 선택 또한 biocytin 보존 및 미세 해부학의 보존에 영향을 미칠 수 있습니다.

어려움에 발생 하는 동안 감사는 여기에 설명 된 조직학 처리 및 100 배 확대 (축 삭의 복잡도 따라 1-4 주간)에서 재구성 하는 데 걸린 시간 동안 미세 구조를 보존, 제공 하는이 메서드는 돌기 및 axonal 직경의 정확한 표현입니다. 그러나 적은 biocytin 라벨을 요구 하는 프로토콜의 사용은 이해할 수 있다,, 이들은 종종 훌륭한 axonal 분기의 명확한 시각화 배제. 세제, Avidin-HRP biocytin 및 항 체, 공개 항목을 홍보 하는 종종 두꺼운 부분에 필요 하지만 미세 구조를 혼란 시킬 수 있다. 신경 검색 지속적으로 반자동 방식의 재건, 하지만, 지금은 하 고 수동 재구성으로 특히, biocytin HRP axons 금31남아 있습니다.

매우 상세한 신경 개조, 특히 정확한 도면 axonal boutons 및 노드, 존재 또는 부재 myelin의와 더 일반적으로 정확한 축 삭 직경의 표현으로 완전 한 axonal 아 버의 그림을 따라 변경의 길이, interneurone의 다른 종류의 정확한 식별에 대 한 정보를 추가 제공. 위에서 설명한 기술을 신경 electrophysiological 속성, 및 연결의 특정 종류와 관련 된 상세한 단기적인가 소성에 상호 관련 된 데이터를 제공 합니다 많은 수는 특정 클래스에 정확히 맞지 않을 수도 있습니다, 비록 신경 개조, 배선 다이어그램, CA2 영역, 예를 들어 자세히 공부 수 있도록

정밀한, 상세한 구조는 종종 전산 모델 간소화 됩니다. 반면, 미래에 중요 한 증명할 수 있는 정보의 손실 발생 합니다. 병렬 시 냅 스 데이터와 상세한 3D 복원의 분석 조건의 더 interneuronal 분류에 대 한 추가 수 있습니다. 데이터 공개 저장소에 고 modellers 계산 축 삭 직경 및 myelination 활동 전위 전파에 산발적 변경의 결과 탐구 하는 데 사용 될 수 있습니다.

공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

이 연구는 노바 티 스 제약 (바젤) 및 의료 연구 위원회 교수 알렉스 톰슨, 생명 공학 및 생물 과학 연구 위원회 (BBSRC-BB/G008639/1), 생리 적인 사회, 유럽 연합의 수 여에서 자금 받았다 수평선 2020 프레임 워크 프로그램 연구 및 혁신 특정 부여 계약 번호 720270에서 (인간의 두뇌 프로젝트 SGA1)에 대 한 특정 권한 부여 계약 번호 785907에서 (인간의 두뇌 프로젝트 SGA2). 우리는 매우 감사 교수 알렉스 톰슨에 자금 확보, 다른 대뇌 피 질의 영역에 프로토콜을 설정 하 고 그녀의 지속적인 지원을 위해이 프로젝트에 대 한. 연구소-회원 복구 프로토콜을 최적화 하는 데 도움이 및 CA2 뉴런을 재건 기여는 인정 하 고 기꺼이: J. Deuchars, H. Pawelzik, D. I. 휴즈, A. P. 베 니, K. Eastlake, H. Trigg, N. A. Botcher.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Avidin-7-amino-4-methylcoumarin-3-acetic acid (Avidin-AMCA) 항체- 20.8 mg/mL 벡터 연구소A2008
바이오싸이틴  ≥ 98% (TLC)SigmaB4261
3,5 디아미노벤지딘(DAB) 정제, 5mLSigmaD4293
Durcupan 에폭시 수지 ASigma44611
Durcupan 에폭시 수지 BSigma44612
Durcupan 에폭시 수지 CSigma44613
Durcupan 에폭시 수지 DSigma44614
에탄올, puriss. p.a., absolute, ≥ 99.8 %시그마32221
젤라틴시그마48723
글루 타르 알데히드 용액, 등급 I, H2< / sub>O시그마G5882
글리세롤, &ge에서 25 %; 99% 시그마G5516
염소 혈청시그마G9023
염소 안티 마우스 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)- 14.3 mg/mL시그마F2653
염소 안티 토끼 텍사스 레드(TR)- 3.3 mg/mL인비트로겐T2767
과산화수소, 30% 용액시그마H-1009
이멀젼 오일, 점도 1.250 cSt (점등)SigmaI0890
염화니켈(NiCl2 . 6H2O)Sigma N5756
오스뮴 테트록사이드, 전자 현미경용, H2O 에서 4%;Sigma75632
파라포름알데히드, 시약 등급, 결정질 SigmaP6148
피크르산, 물에 적신 ≥ 98%Sigma197378
인산염 버퍼 1 MSigmaP3619
프로필렌 옥사이드 (C3H6O), 99%Alfa Aesar 30765
나트륨 테트라하이드로보레이트VWR27885.134
수크로오스피셔 사이언티픽S/8600/53
트리즈마 하이드로클로라이드, ≥ 99.0%SigmaT5941
Trizma 베이스, ≥ 99.9%SigmaT6066
Vectashield 안티페이드 마운팅 미디엄, , 굴절률 1.45 벡터 연구소H-1000
Vectastain Elite ABC HRP 키트벡터 연구소PK6100
장비 사용 
VibratomeAgar Scientific
C4A 컵 알루미늄 플란체트 GA-MA 및 어소시에이츠, INC.
라이카 DMR 현미경 Leica Microsystems
X-Cite 120PC Q  형광 광원 엑셀리타스 테크놀로지스 
라이카 DFC450 디지털 현미경 카메라 라이카 마이크로시스템즈 
Rapidograph 기술 드로잉 펜 0.18mm 런던 그래픽 센터
0.18 mm 라피도그래프 닙런던 그래픽 센터
라피도그래프 기술 드로잉 펜 0.25mm 런던 그래픽 센터
0.25mm rapidograph 펜촉런던 그래픽 센터
Neurolucida 시스템 PC 워크 스테이션, 무대, 카메라 및 joystic을 포함한 XYZ 무대 제어Microbrighfield (MBF) Bioscience
Neurolucida 소프트웨어 버전 2017Microbrighfield (MBF) Bioscience
CorelDRAW 그래픽 Suite X5Corel
비디오 편집 소프트웨어 Adobe Premiere Pro
유리 바이알 14mLFisher scientific 

참고문헌

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