산 성 침 용 법을 사용 하 여 전체 신장의 네 프 론의 수 추정

요약

전체 신장 네 프 론의 추정치는 네 프 론의 수와 신장 및 심혈 관 질환의 향상 된 위험 사이에 역 연관이 있기 때문에 임상적으로 그리고 실험적으로 중요 합니다. 본 원에서, 전체 신장의 네 프 론의 신속 하 고 신뢰할 수 있는 추정치를 제공 하는 산 성 침 용 방법을 사용 하는 것이 입증 된다.

초록

네 프 론 엔 다 우먼 트는 개인이 태어난 네 프 론의 총 수를 말하며, 인간에서의 신장은 임신 36 주에 완료 되 고 출산 후에는 새로운 네 프 톤이 형성 되지 않습니다. 네 프 론 번호는 출생 후 시점에서 측정 된 네 프 론의 총 수를 지칭 한다. 유전과 환경적 요인 모두 네 프 론의 엔 다 우먼 트와 수에 영향을 미친다. 특정 유전자 또는 요인이 신 기원과 네 프 론의 손실이 나 종말의 과정에 영향을 미치는 방법을 이해 하는 것은 더 낮은 네 프 인 엔 다 우먼 트 또는 수를 가진 개인은 신장 또는 심혈 관 질환을 개발의 높은 위험에 있을 것으로 생각 됩니다. 사람의 일생 동안 환경 노출이 어떻게 네 프 론의 숫자에 영향을 미치는지 이해 하는 것은 미래의 질병 위험을 결정 하는 데에도 중요 합니다. 따라서, 전체 신장 네 프 론의 수를 신속 하 고 안정적으로 평가 하는 능력은 신 기원 또는 네 프 랭 손실을 촉진 시키거나 증진 시키는 기전을 더 잘 이해 하기 위한 기본적인 실험적 요구 사항 이다. 여기서, 우리는 Damadian, 샤이 리 및 Bricker에 의해 설명 된 절차에 기초 하 여 전체 신장의 네 프 론의 추정을 위한 산 침 용 법을 약간의 수정과 함께 설명 한다. 산 성 연 화 방법은 네 프 론의 빠르고 신뢰할 수 있는 추정치를 제공 합니다 (사 구체를 계산 하 여 평가 됨) 그 중 5% 내에서 더 고급을 사용 하 여 결정, 이기는 하지만 비싼, 자기 공명 영상과 같은 방법. 더욱이, 상기 산 침 용 법은 많은 수의 샘플 또는 실험 조건에서 네 프 론의 개수를 평가 하는 우수한 고 처리량 방법 이다.

서론

네 프 론의 기본 구조와 신장¹의 기능 단위입니다. 구조적으로, 네 프 론의 사 구체 (모세 혈관과 세포)는 보 먼의 캡슐 내에 위치 하 고 신장 세관, 근 위 세관, Henle의 루프 및 수집 덕트로 종결 되는 말단 세관으로 구성 됩니다. 기능적으로, 네 프 론의 역할은 물과 전해질의 여과 및 재흡수와 폐기물의 분 비입니다. 일반적으로, 신장은 마우스와 쥐²와 같은 여러 종에서 출생 직후 인 간에 서 임신 36 주에 완료 됩니다. 네 프 론 엔 다 우먼 트는 개인이 태어난 네 프 론의 총 수를 말하며, 반면 네 프 론 수는 출생 후³년에 언제 든 지 측정 된 네 프 론의 총 개수입니다. 용어 네 프 론의 숫자와 사 구체 숫자는 종종 같은 의미로 사용 됩니다. 네 프 론의 사 구체 1 개만 있기 때문에, 사 구체 수의 평가는 네 프 온 수를 추정 하는 중요 한 대리 이다.

네 프 론의 엔 다 우먼 트와 네 프 론의 수치는 네 프 론의 자질과 심혈 관 질환의 발병 률이 증가 하는 네 프 론의 숫자와의 연관성을 입증 한 것으로 임상적 관심을가지고 있다^{4,5 ,8},¹⁰,⁹,¹³ ,¹¹,^{12 15}. 부검에서 신장의 연구 결과에 근거 하 여, 브 레너는 고혈압 환자 들이 노 몰 하는 사람들¹⁶보다 낮은 총 수의 네 프 론을 제시 했다는 것을 관찰 했습니다. 따라서, 브 레너는 네 프 론의 수와 인생에서 나중에 고혈압을 개발의 위험 사이에 역 관계가 있다는 가설. 브 레너는 또한 네 프 론 수의 감소가 남아 있는 네 프 톤에 의해 보상 되었다는 것을 가설 했다. 신장에서 정상적인 여과 속도를 유지 하기 위해, 잔여 네 프 톤은 사 구체 표면적 (사 구체 비 대)을 증가 시 킴으로써, 신장 기능^{4 에 대 한 네 프 론의 부작용을 완화 하는 작용을 합니다 ,16}.

단기, 사 구체 비 대에서 보호 하는 동안, 장기에, 증가 나트륨과 유체 유지에 이르게, 증가 세포 외 유동성 볼륨, 그리고 동맥 혈압 증가, 더 증가의 악순환으로 이어지는 사 구체 모 세관 압력, 사 구체 하이퍼 여과, 네 프 론의 흉터 (경화 증) 및 부상^4,16.

네 프 론의 추정치 또는 개수를 구하는 것은 몇 가지 실험적 이점을 제공 합니다. 1)이는 신 기원 과정에 관한 정보를 제공 하며,이는 배아 또는 모계 태아 환경의 특정 유전자 또는 인자에 연결 될 수 있으며, 2) 심장 혈관 질병을 가진 네 프 론의 수의 협회가 있으며, 따라서, 네 프 론의 추정치는 미래의 심혈 관 위험을 예측 하는 데 사용 될 수 있는 가능성이 있다^2,17,^{18, 19 , 20 , 21 , 22}. 모계 태아 환경 외에도 몇몇 질병은 동맥 경화 증, 당뇨, 고혈압, 심지어 정상적인 노화를 포함 하는 네 프 론의 수와 신장 기능에 직접적으로 영향을 미치기 때문에^{2,9, 10},^11,12,²¹. 따라서, 전체 신장 네 프 론의 평가는 사람의 삶과 결과 효과의 과정을 통해 신 기원 (즉, 네 프 론의 엔 다 우먼 트) 및 네 프 번에 영향을 미치는 유전 및 환경적 요인을 모두 이해 하는 것이 중요 합니다 신장 기능 및 심혈 관 건강에.

현재 네 프 론의 판정 및 정량화에 사용할 수 있는 몇 가지 방법이 있으며, 각각의 장점과 한계를가지고 있습니다.²⁴,²⁵, 29,^{27 ,29,30}. 전체 신장 네 프 론 수를 결정 하기 위한 정교한 방법에는 전위/fractionator 방법, 자기 공명 영상^25,26등의 입체 방법이 포함 된다. 전체 신장 네 프 론의 수를 결정 하기 위한 금-표준으로 간주 되는 경우가 많으며, dissector/fractionator 방법은 비용과 시간이 많이 소요 됩니다. 자기 공명 영상 처리 및 프로세싱의 최근의 발전과 개선은 각각의 네 프 론의 카운트를 개별적으로 하는 도구를 제공 한다. 그러나 자기 공명 이미징은 시간 소모적 일 뿐만 아니라 매우 비쌉니다. 또한, dissector/fractionator 방식과 자기 공명 영상 모두 첨단 기술 전문 지식이 필요 하므로 대부분의 연구 실험실에서 이러한 방법의 사용을 제한 합니다.

네 프 론의 숫자를 결정 하는 대부분의 방법은, 그들은 구조적으로 쉽게 식별 할 수 있기 때문에, 사 구체 식별을 기반으로 카운트 또는 추정치를 확인 합니다. 본 논문에서, 전체 신장에서 네 프 론의 수를 추정 하는 산 성 침 용 방법은도²⁷과 설명 된다. 상기 산 침 용 법은 전위/fractionator 방법 및 자기 공명 영상과 같은 다른 방법 들 보다 빠르고, 안정적 이며, 현저히 저렴 하다. 더욱이, 상기 산 침 용 법은 자기 공명 영상 (²⁶)을 사용 하 여 결정 된 것 들의 범위 내에 있는 것으로 보고 되는 네 프 론의 매우 반복 가능한 추정값을 제공 한다.

프로토콜

아래 나열 된 소모품 및 시 약은 한 번의 마우스에서 전체 신장의 네 프 론의 수, 즉 두 개의 신장에 대 한 결정입니다. 쥐에 대 한 산 성 침 용 방법의 사용에 대 한 수정은 별표로 식별 됩니다. 모든 실험 프로토콜은 실험실 동물의 관리 및 사용을 위한 건강 가이드의 국립 연구소를 본, 미시시피 대학 의료 센터에서 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 되었다.

1. 신장 분리 절차

1. 마우스 (또는 다른 종)의 무게를 측정 하 고이 소에 어 루 레인 (5%-8%)으로 안락사 과다 복용 또는 pentobarbital (150 밀리 그램/kg 복 강 내 주사).
2. 마우스가 안락사 되 면, 중간 선을 따라 미세 수술가 위를 사용 하 여 복 강을 엽 니 다.
3. 내장을 조심 스럽게 들어 올리고 지방 생식을 복 강의 오른쪽으로 올립니다. 총 해 부에 의해, 왼쪽 신장을 분리. 미세 수술가 위를 사용 하 여 왼쪽 신장 동맥과 정 맥을 자르고 왼쪽 신장을 조심 스럽게 제거 하 고 (마우스 번호/식별자) 형광체 완충 식 염 수를 포함 하는 계량 보트에 신장을 배치 합니다 (PBS).
4. 오른쪽 신장에 대 한 절차를 반복 합니다.
5. 각각의 계량 보트에서 각 신장을 제거 하 고 PBS로 미리 적신 수술 거 즈에 놓습니다.
6. 수술 거 즈에 신장을 남겨, 신속 하 게 모든 부착 된 비 신장 조직 제거 (예: 신장 지방 또는 부 신 동맥) 신장 캡슐의 제거에 의해 다음. 각각의 신장을 개별적으로 계량 하 여 실험실 노트북에서 왼쪽과 오른쪽 신장의 무게를 개별적으로 기록 합니다.

2. 균질 화, 배양 및 변형 절차

1. 각 신장이 무게 되 면, PBS의 각 계량 보트를 배수 하 고 적절 하 게 표시 된 계량 보트에 다시 신장을 배치 합니다. 깨끗 한 면도날을 사용 하 여 신장을 반으로 자르고 세로로 자릅니다. 각 신장의 절반을 아래로 향하게 하 고 각 반쪽을 2mm 또는 더 작은 조각으로 자릅니다.
2. 같은 레이저 블레이드를 사용 하 여 조심 스럽게 잘게 자른 신장 조각을 수집 하 고 표시 된 15ml 원뿔 튜브 (마우스 번호/식별자를 왼쪽 대 오른쪽 신장)에 넣습니다.
3. 새로운 면도날을 사용 하 여 반대 신장에 대 한 절차를 반복 합니다. 잘게 자른 신장을 별도의 표지 된 15ml 원추형 튜브에 넣습니다.
4. 통풍이 잘되는 증기 후드에서 각 15ml 원추형 튜브에 6 M 염 (HCl) 산 5Ml를 추가 하십시오.
5. 캡을 원추형 튜브로 교체 하 고, 신장/HCl 혼합물을 부드럽게 교 교 하 고, 15Ml 원추형 튜브를 37 ° c에서 90 분 동안 설정 된 예 열 된 수조에 넣고, 쥐 신장에는 120 min을 넣습니다.
6. 모든 조직이 HCl 산에 노출 되는 것을 보장 하기 위해 인큐베이션 동안 15 분 마다 각 15Ml 튜브를 짧게 교 번 한다.
7. 18g 바늘을 5ml 주사기 (쥐에 대 한 10ml 주사기)에 넣고 주사기 플런저를 조심 스럽게 제거 합니다. 주사기를 흄 후드의 50 원추형 튜브 (튜브 #1)에 넣습니다.
8. 수조에서 신장/HCl 용액을 제거 하 고 티슈 용액을 주사기의 열린 끝에 붓고 15ml 원뿔형 튜브를 시험관 랙에 따로 둔다. 조심 스럽게 플런저를 교체 하 고 서서히 플런저를 밀어 바늘을 통해 용액을 압출 하 고 튜브 #1.
9. 15ml 원추형 튜브를 5 mL의 PBS 용액으로 씻으십시오. 15ml 원추형 튜브에 PBS를 소용돌이 시켜 남아 있는 모든 신장 조직을 가용 화 하도록 한다.
10. 다시 말하지만, 18g 바늘을 포함 하는 5 mL 주사기에서 플런저를 조심 스럽게 제거 하 고 15ml 원추형 튜브의 내용물을 주사기의 열린 끝에 붓는 다. 조심 스럽게 플런저를 교체 하 고 튜브 #1에 플런저를 부드럽게 밀어 주사기를 플러시. 이 과정을 2 배 반복 합니다 (총 3 배).
11. 21g 바늘을 새로운 5Ml 주사기 (* 10ml의 쥐 용 주사기)에 넣고 주사기 플런저를 조심 스럽게 제거 합니다. 새로운 50-mL 원추형 튜브 (튜브 #2)에 부착 된 21g 바늘로 주사기를 놓습니다.
12. 21-G 바늘을 포함 하는 주사기의 열린 끝에 튜브 #1 내용물을 붓는 다. 조심 스럽게 플런저를 삽입 하 고 주사기 플런저를 부드럽게 눌러 주사기를 세척 하 고 압출 용액을 튜브 #2에 놓습니다.
13. 5 mL의 PBS 용액을 사용 하 여 세척 튜브 #1. 나머지 신장 조직을 가용 화할 수 있도록 튜브 #1에 PBS를 소용돌이.
14. 다시, 18g 바늘을 포함 하는 5 mL 주사기에서 플런저를 조심 스럽게 제거 하 고 튜브 #1 내용물을 주사기의 열린 끝에 붓는 다. 조심 스럽게 플런저를 교체 하 고 부드럽게 플런저를 아래로 밀어 주사기를 플러시, 튜브 #2에 솔루션을 압출. 이 과정을 2 배 반복 합니다 (총 3 배).
15. 튜브 #2에 최대 50 라인까지 PBS를 추가 하 여 최대 50 mL의 튜브 #2 총 부피를 가져옵니다.
16. 신장 조직 용액을 로커 플레이트의 튜브 랙에 포함 하는 배양 관 #2 4°c에서 하룻밤 동안 설정 된 냉장고 (최소 8-10 시간).

3. 사 구체 계산 및 네 프 론의 외삽 수

1. 냉장고에서 튜브 #2를 제거 하 고 균질 한 용액을 만들기 위해 튜브를 여러 번 살짝 반전 하 여 펠 레로 모 조직을 소생 시킵니다. 처리 후 5 d 내에서 사 구체를 계산 하는 것이 좋습니다.
2. 조심 스럽게 12 웰 플레이트의 하나의 우물에 신장 용액의 µ L을 500. 이 2 배를 반복 하 여 각 매 취 액을 별도의 우물에 두어 신장 당 세 개의 웰이 있고 삼중 분석을 수행 합니다.
3. 신장 용액을 포함 하는 3 개의 웰 각각에 500 µ L의 PBS를 추가 하 여 1:1 희석 하십시오.
4. 반전 현미경을 사용 하 여, 잘 당 사 구체 수를 세어. 계수는 각 웰의 하단에 배치 된 16 개의 개별 섹션 그리드를 사용 하 여 지원 됩니다. 각 그 리딩 된 섹션 당 사 구체 수를 세어 다음 그리드 당 수를 합산 하 여 웰 당 사 구체 총 수를 얻습니다. 사 구체는 그들의 구형 구조에 의해 쉽게 식별할. 추가 식별자에는 혈액으로 채워진 모세 혈관으로 인 한 붉은 색조 뿐만 아니라 개별 사 구체 신체에 부착 된 상태를 유지 하는 사전 또는 사후 세 동맥 포함 되어 있습니다 (그림 1).
5. 사 구체의 총 수를 추가 3 개의 우물의 각각에 대해 계산 후 신장 용액 500 µ L 당 사 구체의 평균 수에 대해 세 가지로 나누어. 웰 당 평균 사 구체 수의 분산이 10%를 초과할 경우, 신장 용액의 균질 한 성질에 세심 한 주의를 기울여 네 프 론의 계수 절차를 반복 합니다. 사 구체는 신장 당 사 구체 평균 수에 대 한 웰 타임즈 100에 계산 된 수를 곱합니다. 총 네 프 론의 수는 신장 당 또는, mg 또는 조직의 g 당 신장 체중을 사용 하 여 발현 될 수 있다.

결과

다음은 고혈압의 확립 된 마우스 모델과 연령과 관련 된 만성 신 장병의 유전 쥐 모델에서 전체 신장 네 프 론의 대표적인 추정치입니다. 사전 또는 사후 arteriolar 또는 관 형 구조물을 부착 하거나 포함 하지 않은 구형 구조와 같은 사 구체를 식별 하는 주요 특성은 산 침 용 법에 새로운 것을 강조 합니다 (그림 1).

제 1 실험 예에 있어서, 총 네 프 론의 숫자는 14 일 동안 비 히 클 (염 분) 또는 안 지 오 텐 신 II를 포함 하는 쥐 (남성 C57BL 6 주)에서 측정 하였다. 차량 주입 마우스에서, 네 프 론 수는 산 성 침 용 법을 이용 하 여 결정 된 대로 신장 당 12411 ± 248 네 프 톤 이었다 (도 2). 이러한 추정값은...

토론

좋은 실험 기법으로, 산 침 용 방법은 전체 신장의 네 프 론의 수를 추정 하는 데 이상적입니다. 신장은 산에 용 해 되지만, 사 구체는 크게 그대로 유지 하 고 쉽게 식별, 개별 사 구체 계산 상대적으로 쉽고 간단 하 게. 산 성 침 용 기법은 특히 여러 가지 이유로 유리 하다. 첫째, 산 성 침 용 법은 비용과 물리적 노력의 측면에서 상대적으로 적은을 필요로 하는 신속 하 고 편리한 방법입니다. 산 성 침 용 법을 수행 하는 데 필요한 모든 시 약과 소모품은 대부분의 기본 실험실에서 쉽게 구할 수 있으며, 사 구체 계산을 위한 도립 현미경에 대 한 접근이 유일한 주요 요구 사항입니다. 비용 측면에서, 산 침 화 방법은 동물 당 단지 몇 백 달러 비용을 추정 하 고,이는 자기 공명 영상과 같은 전체 신장 사 구체 카운팅의 다른 방법과 관련 된 비용에 비해 많은 경우, 스캔 시간 및 기술 전문성의 동물 당 수천 달러에 이르기까지 다양 할 수 있습니다.

둘째, 상기 산 침 용 법은...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Isoflurane 마취	Abbott Laboratories	05260-05
Isoflurane 기화기 시스템 및 유량계	Braintree Scientific	VP I	의료용 산소 공급 장치
포함 라이카 도립 현미경 DMIL LED	라이카 마이크로시스템	DMIL LED	모든 제작 적합한
디지털 수조	Fisher Scientific	2239	모든 제조사 적합한
ToughCut Fine 수술 용 가위	Fine Science Tools	14058-11	25mm 절삭 날, 11.5cm 길이; 팁 : 날카롭고 날카롭습니다. 팁 모양: 직선
마이크로 해부 겸자 4 1/4 in.	Biomed Res Instruments, Inc	10-1760	곡선 팁
플렉시글라스 보드 5 인치 x 7 인치.	모든 출처 적합	n/a	모든 제작 또한 적합한
육각형 폴리스티렌 계량 접시	Fisher Scientific	02-2002-100	모든 제작 또한 적합한
면도날	Fisher Scientific	12-640	단일 모서리 탄소강 0.009
거즈 스폰지 4 x 4 in. 8 플라이	Fisher Scientific	MSD-1400250
10x 농축 인산염 완충 식염수(PBS)	Sigma Aldrich	P5493-4L	은 1배로 희석합니다.
6 N 하이드로콜린산 용액	Sigma Aldrich	3750-32
15 mL 원추형 원심분리기 튜브	Fisher Scientific	14-959-70C	모든 제작
50 mL 원추형 원심분리기 튜브	Fisher Scientific	14-959-49A	모든 제작 또한 적합한
일회용 5 mL 주사기	Cole Palmer	EW-07944-06	모든 제작 또한 적합한
18G1.5 일회용 바늘	Fisher Scientific	14-826-5D	모든 제조사 적합
21G1.5 일회용 바늘	Fisher Scientific	14-826-5B	모든 제조사
12-웰 다중 웰 세포 배양 플레이트 뚜껑 Cole	Palmer	#FW-01959-06	모든 제조사
적합 폴리프로필렌 모듈식 시험관 랙	Cole Palmer	#EW-06733-00	15 및 50 mL 코니컬 튜브 수용 가능; 모든 것이 또한 적합합니다.