전이성 대 장 암 환자에서 순환 예측에 관한 사용자 정의 패널의 검출

요약

우리는 암 환자에서 플라즈마 샘플에 예측에 관한 (miRNAs) 순환의 식 수준을 평가 하는 프로토콜을 제시. 특히, 우리는 순환 미르 추출 및 반전 녹음 방송에 대 한 상용 키트를 사용 합니다. 마지막으로, 우리는 실시간으로 미리 발견된 프로브 사용자 지정 접시를 사용 하 여 24 선택한 miRNAs의 패널 분석.

초록

거기는 증가 액체 생 검 암 진단, 예 후 및 치료 모니터링에 대 한 관심이 임상 연습을 위한 안정적이 고 유용 생체에 대 한 필요성을 만들기. 여기, 선물이 추출, 프로토콜 반전 녹음 하 고 환자 대 장 암 (CRC)의 플라즈마 샘플에서 miRNAs 순환의 식 수준 평가. microRNAs (miRNAs)는 변환 수준에서 대상 유전자의 표정을 통제 하 고 중요 한 역할의 physiopathology에서 프로 및 안티 신생 함수를 포함 하는 길이 18-25 뉴클레오티드의 비 코딩 RNAs의 클래스 다양 한 기관입니다. miRNAs는 혈 청 및 플라즈마, 암 진단, 예 후 및 치료 결정에 대 한 생체 순환 고 모니터링 그들을 렌더링 같은 생물 학적 체액에 안정. 미르 추출 순환 유기 및 열 기반 방법론 관련 된 신속 하 고 효과적인 방법을 사용 하 여 수행 되었다. MiRNA retrotranscription, 고려에서 3' 5 ' 뒤에 임의의 미르 사전 증폭 성숙한 miRNAs의 어댑터의 결 찰 polyadenylation 멀티 단계 절차를 사용 했습니다. 우리 정량 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (qRT-PCR)에 의해 시험 될 24-미르 사용자 패널을 선택 하 고 배열 사용자 지정 접시에 미르 프로브를 발견. 우리는 실시간 PCR 시스템에서 실행 되는 qRT-PCR 플레이트를 수행. 정규화에 대 한 가사 miRNAs (3.2) 대 GeNorm 소프트웨어를 사용 하 여 선정 됐다. 데이터 식을 스위트 소프트웨어 (v 1.1)을 사용 하 여 분석 했다 고 통계 분석을 수행 했다. 메서드는 안정적이 고 기술적으로 강력한 것을 입증 하 고 플라즈마 혈 청 등 액체 샘플의 바이오 마커 수준 평가에 도움이 될 수 있습니다.

서론

CRC 나타냅니다 3 가장 자주 악성 종양 및 암 관련 된 죽음은 전세계의 4 번째 원인 진단. 날짜 하려면, bevacizumab (B), 혈관 내 피 성장 인자 (VEGF), cetuximab (C) 또는 panitumumab (P), 단일 클론 항 체 표 피 성장 인자 수용 체 (EGFR)에 대 한 감독에 대 한 감독 단일 클론 항 체 승인에 대 한 첫 번째 라인 치료 (CT) 화학요법 식이요법과 함께.

K-RAS 및 N-RAS 유전자에 있는 돌연변이 유일한 임상적으로 유용한 생체 혜택 EGFR 기반 시작 안티 코네티컷에서 같다 적어도 환자 식별 가능 비록 B 기반 CT에 대 한 응답의 예측은 생체에 대 한 검색을 여러 연구를 실시 했습니다, 아직 임상 실습¹에서 사용 하기 위해 안정적이 고 효과적인 약물의 상당한 부족이 이다.

miRNAs는 대상 유전자의 번역을 통제 하 고 embryogenesis와 발암을 포함 하 여 수많은 physiopathological 프로세스에서 중요 한 역할을 하는 작은 RNAs (18-25 뉴클레오티드 길이에서). 이 분자는 혈장/혈 청, 소변,가 래, 비-침략 적 샘플링

프로토콜

참고: 모든 소독된 연기 후드 좋은 연구실 관행 (GLP)에 따라 다음 단계를 수행 합니다.

1. 플라즈마 수집 및 저장

1. 3 mL K3E EDTA 튜브에 주변 혈액 샘플을 수집 합니다.
2. 1880 x g 15 분 동안에 실내 온도에 튜브 원심
3. 450 µ L의 aliquots에서 표면에 뜨는 플라즈마를 복구 합니다.
4. 사용까지-80 ° C에서 샘플을 저장 합니다.
   참고: 말 초 혈 관 컬렉션의 2 시간 안에 처리 합니다. 튜브에서 플라즈마를 복구할 때 림프 구 레이어를 방해 하지 마십시오.

2. 플라즈마 샘플 (자료 테이블)에서 miRNAs 순환의 추출

1. 모든 필요한 솔루션을 준비 하 고 녹여 추출 단계에 대 한 샘플.
   1. 2 x denaturating 솔루션 2-mercaptoethanol의 375 µ L을 추가 하 고 잘 혼합.
   2. 추가 ACS 학년 100% 에탄올의 21 mL 미르 세척 솔루션에 어 믹스 잘 합니다.
   3. 세척 솔루션 2/3....

결과

진행 성 자유로운 생존 (PFS) 관련 신생 관련 순환 miRNAs의 패널 분석, 전반적인 생존 (OS) 및 객관적인 응답 속도 (오 어) 52 mCRC 중부 B 기반으로 환자 치료에 플라즈마 샘플에서 이러한 바이오 마커의 평가 기술적인 어려움 때문에 도전 이다. 우리는 환자 혈장 샘플, 반전 녹음 방송 및 사전 증폭에서 미르 추출 설립된 메서드를 사용합니다. 제조업체의 지침에 따라과 추출 단계에서 특히 요구 하는 몇 가지 수정만 우리가 성공적으로 우리의 모든 대상 환자 인구 (그림 2)를 평가 한다.

특히, 우리 2 분석 플라즈마 샘플/환자, 기준선과 치료 수정 미르 식 환자 결과와 연관.

우.......

토론

miRNAs는 작은 비 코딩 RNAs (18-25 뉴클레오티드 길이에서) 그들의 목표 메신저 RNA의 3' UTR 지역 바인딩 및 억제 및 그것을 타락 하는 것은 가능. 그들은 따라서 변환 수준에서 유전자 식 레 귤 레이 터를 간주 될 수 있습니다. 지난 10 년간, 몇몇 miRNAs 암 개시 및 개발, 진단, 예 후 및 치료에 대 한 유용한 임상 바이오 마커 들을 만들고 상관 되어 있다. RNases에 의해 보호, miRNAs은 혈액, 혈장, 혈 청, 소변과 타 액, 임상 연습¹⁰에 그들의 잠재적인 유용성에 성장 관심사를 주도하 고 있다 같은 생물 학적 체액에서 안정적 형태로 존재 한다.

그럼에도 불구 하 고, 순환 miRNAs의 평가 과제 이며 샘플 수집, 대상 추출, 플랫폼 선택 및 글로벌 표준화에 관한 어려움은 과학 지역 사회 내에서 뜨겁게 논쟁된 주제.

샘플 수집 및 저장에 대 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Rnase-free Safe-lock 1.5 mL 튜브	Eppendorf	0030 123.328
Rnase-free Safe-lock 2 mL 튜브	Eppendorf	0030 123.344
Rnase-free 20 µ L 팁	Starlab	S1123-1810
Rnase-free 200 µ L 팁	Starlab	S1120-8810
Rnase-free 1,000 µ L 팁	Starlab	S1122-1830
mirVana PARIS RNA 및 네이티브 단백질 정제 키트	Thermo Fisher	AM1556
TaqMan Advanced miRNA cDNA 합성 키트	Thermo Fisher	A28007
100% 에탄올 anidrous ACS 등급	Carlo Erba 시약	414605
2-메르캅토-에탄올	Sigma-Aldrich	M3148
TaqMan Fast Advanced Master Mix	Thermo Fisher	4444558
TaqMan Advanced miRNA Assays	Thermo Fisher	A25576
7500 Real-Time PCR System	Applied Biosystems	4406984
0.2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1,000 µ L 실험실용 피펫,
벤치탑 마이크로 원심분리기
, Vortex
, 벤치탑 가열 블록
흄 후드
0.2 mL PCR 튜브

, ,