전이성 대 장 암 환자에서 순환 예측에 관한 사용자 정의 패널의 검출

요약

우리는 암 환자에서 플라즈마 샘플에 예측에 관한 (miRNAs) 순환의 식 수준을 평가 하는 프로토콜을 제시. 특히, 우리는 순환 미르 추출 및 반전 녹음 방송에 대 한 상용 키트를 사용 합니다. 마지막으로, 우리는 실시간으로 미리 발견된 프로브 사용자 지정 접시를 사용 하 여 24 선택한 miRNAs의 패널 분석.

초록

거기는 증가 액체 생 검 암 진단, 예 후 및 치료 모니터링에 대 한 관심이 임상 연습을 위한 안정적이 고 유용 생체에 대 한 필요성을 만들기. 여기, 선물이 추출, 프로토콜 반전 녹음 하 고 환자 대 장 암 (CRC)의 플라즈마 샘플에서 miRNAs 순환의 식 수준 평가. microRNAs (miRNAs)는 변환 수준에서 대상 유전자의 표정을 통제 하 고 중요 한 역할의 physiopathology에서 프로 및 안티 신생 함수를 포함 하는 길이 18-25 뉴클레오티드의 비 코딩 RNAs의 클래스 다양 한 기관입니다. miRNAs는 혈 청 및 플라즈마, 암 진단, 예 후 및 치료 결정에 대 한 생체 순환 고 모니터링 그들을 렌더링 같은 생물 학적 체액에 안정. 미르 추출 순환 유기 및 열 기반 방법론 관련 된 신속 하 고 효과적인 방법을 사용 하 여 수행 되었다. MiRNA retrotranscription, 고려에서 3' 5 ' 뒤에 임의의 미르 사전 증폭 성숙한 miRNAs의 어댑터의 결 찰 polyadenylation 멀티 단계 절차를 사용 했습니다. 우리 정량 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (qRT-PCR)에 의해 시험 될 24-미르 사용자 패널을 선택 하 고 배열 사용자 지정 접시에 미르 프로브를 발견. 우리는 실시간 PCR 시스템에서 실행 되는 qRT-PCR 플레이트를 수행. 정규화에 대 한 가사 miRNAs (3.2) 대 GeNorm 소프트웨어를 사용 하 여 선정 됐다. 데이터 식을 스위트 소프트웨어 (v 1.1)을 사용 하 여 분석 했다 고 통계 분석을 수행 했다. 메서드는 안정적이 고 기술적으로 강력한 것을 입증 하 고 플라즈마 혈 청 등 액체 샘플의 바이오 마커 수준 평가에 도움이 될 수 있습니다.

서론

CRC 나타냅니다 3 가장 자주 악성 종양 및 암 관련 된 죽음은 전세계의 4 번째 원인 진단. 날짜 하려면, bevacizumab (B), 혈관 내 피 성장 인자 (VEGF), cetuximab (C) 또는 panitumumab (P), 단일 클론 항 체 표 피 성장 인자 수용 체 (EGFR)에 대 한 감독에 대 한 감독 단일 클론 항 체 승인에 대 한 첫 번째 라인 치료 (CT) 화학요법 식이요법과 함께.

K-RAS 및 N-RAS 유전자에 있는 돌연변이 유일한 임상적으로 유용한 생체 혜택 EGFR 기반 시작 안티 코네티컷에서 같다 적어도 환자 식별 가능 비록 B 기반 CT에 대 한 응답의 예측은 생체에 대 한 검색을 여러 연구를 실시 했습니다, 아직 임상 실습¹에서 사용 하기 위해 안정적이 고 효과적인 약물의 상당한 부족이 이다.

miRNAs는 대상 유전자의 번역을 통제 하 고 embryogenesis와 발암을 포함 하 여 수많은 physiopathological 프로세스에서 중요 한 역할을 하는 작은 RNAs (18-25 뉴클레오티드 길이에서). 이 분자는 혈장/혈 청, 소변,가 래, 비-침략 적 샘플링²에 사용할 강력한 생체 그들을 렌더링 등 생물 학적 체액에서 매우 안정 된. 우리 식별 하기 위한 신생 통로에 관련 된 miRNAs의 패널을 사용 하 여, B 기반 CT 처방으로 치료 새로운 전이성 CRC (mCRC)를 가진 환자에 있는 임상 결과 예측할 수 있는 biomarkers를 순환.

52의 시리즈 분석 무작위로 예비 multicenter 내 B 기반 CT로 치료 하는 mCRC 환자 단계 III 예 심 "이탈리아 재판에 고급 대 장 암" (ITACa). 현재 프로토콜 로컬 윤리 위원회에 의해 승인 되었다 (Comitato Etico 지역 Vasta e Istituto Scientifico Romagnolo 당 소호 스튜디오 e 라 Cura 데이 Tumori (IRST) IRCCS, no. 674) 19^회 2007 년 9 월에. 모든 환자는 혈액 샘플 수집 하기 전에 동의 했다. 각 환자에 대 한 정 맥 혈액 샘플 기준선 미르 식 및 환자 결과 관하여 치료 하는 동안 그것의 변조 치료 전과 (8 주) 후 첫 번째 임상 평가에서 수집 되었습니다.

문학의 검색을 통해 우리는 인간 플라스마에서 감지 것으로 알려져 있다 21 miRNAs 신생 프로세스와 상관을 선택: 있다-미르-107, 미르-126-3 p는-미르-145-5 p, 있다-미르-194-5 p, 있다-미르-199a-5 p, 있다-미르-200b-3 p, 있다-미르-20b-5 p 은-미르-21-5 p,-미르-210-3 p,-미르-221-3 p,-미르-24-3 p, 있다-미르-27a-3 p, 있다-미르-29b-3 p, 있다-미르-335-5 p, 있다-미르-424-5 p, 있다-미르-497-5 p, 있다-미르-520 d-3 p, 있다-미르-92a-3 p, 있다-미르-17-5 p는-미르-155-5 p. 우리는 또한-미르-223-3 p를 선택 하 고 있다-미르-484 생 정규화^3,,45,6, 및 cel-미르-39 세 정규화에 스파이크도 C. 선 충 에서 정화. 모든 데이터 정규화 2 ̂ ̄(ΔΔCt) 메서드를 사용 하 여 수행 했다.

순환 miRNAs의 검출 분자 플라즈마에 매우 낮은 수준에서 존재 하 고 그들의 증폭은 화학적 도전 그들의 짧은 순서를 부여 하기 때문에 몇 가지 기술적인 어려움을 선물 한다. 이러한 이유로, 우리는 페 놀과 유기 추출 및 유리 섬유 열 기반 방법론을 고려 하는 절차를 선택. 미르 추출 순환 액체 생 검의 분야에서 뜨거운 주제 이며 우리가 선택 중 가장 신뢰할 수 있는 표시는 상업 키트 복구 된 수익률^7,8의 품질과 금액. 우리는 반대 하는 프로토콜을 선택 miRNAs의 선택도 향상 시키기 위해 5'과 3 ' 성숙한 miRNA의 많은 꼬리에서 어댑터 추가 및 반응의 특이성에 의해 속기.

방법의 견고성을 감안할 때, 우리는 미리 발견 프로브 RT-PCR 중복에서 각 샘플을 평가 대 한 사용자 지정 접시를 설계 하 고 그림 1에서 보듯이 각 배지 내의 2 환자를 분석.

프로토콜

참고: 모든 소독된 연기 후드 좋은 연구실 관행 (GLP)에 따라 다음 단계를 수행 합니다.

1. 플라즈마 수집 및 저장

1. 3 mL K3E EDTA 튜브에 주변 혈액 샘플을 수집 합니다.
2. 1880 x g 15 분 동안에 실내 온도에 튜브 원심
3. 450 µ L의 aliquots에서 표면에 뜨는 플라즈마를 복구 합니다.
4. 사용까지-80 ° C에서 샘플을 저장 합니다.
   참고: 말 초 혈 관 컬렉션의 2 시간 안에 처리 합니다. 튜브에서 플라즈마를 복구할 때 림프 구 레이어를 방해 하지 마십시오.

2. 플라즈마 샘플 (자료 테이블)에서 miRNAs 순환의 추출

1. 모든 필요한 솔루션을 준비 하 고 녹여 추출 단계에 대 한 샘플.
   1. 2 x denaturating 솔루션 2-mercaptoethanol의 375 µ L을 추가 하 고 잘 혼합.
   2. 추가 ACS 학년 100% 에탄올의 21 mL 미르 세척 솔루션에 어 믹스 잘 합니다.
   3. 세척 솔루션 2/3를 ACS 학년 100% 에탄올 40 mL를 추가 하 고 잘 혼합.
   4. 플라즈마 aliquot 실 온에서 해 동 하 여 다음 추출 단계를 시작 하실 수 있습니다.
2. 유기 추출
   1. RNase 무료 2 mL 튜브에 플라즈마 샘플의 400 µ L를 전송 합니다.
   2. 2 x denaturating 솔루션의 400 µ L을 추가 하 고 vortexing에 의해 혼합 짧게 원심.
   3. 1 nM 스파이크에서의 4 µ L을 추가 하 고 vortexing에 의해 혼합 짧게 원심.
   4. 산 페 놀-클로 프롬의 800 µ L를 추가 합니다.
   5. 60 s를 15 분에 대 한 최대 속도 (≥10, 000 x g)에서 원심 분리기와 동.
   6. 신선한 튜브를 위 수성 단계를 전송 합니다. Interphase는 방해 하지 마십시오. 참고 볼륨 복구 및 폐기 비 acqueous 단계를 포함 하는 관.
      참고: 솔루션을 변성 시키기 x 2는 4 ° C에 저장 되며이 온도에서 응고 될 수 있습니다. 사용 하기 전에 따뜻한 37 ° c, 10-15 분 위해 때때로 agitating 솔루션 조심 포함 하는 산 성 페 놀-클로 프롬, 혼합물의 위에 속 인 다 acqueous 버퍼 하지 아래 단계를 철회 하는 것. 차입 솔루션 또는 95 ° c 물 nuclease 무료 예 열 열 솔루션 (샘플 + 10% 초과 당 100 µ L)의 적절 한 볼륨을 주의 해야 합니다.
3. 작은 RNA 농축
   1. 2.2.6 단계에서 수성 단계로 에탄올 100%의 1/3 볼륨을 추가 하 고 철저 하 게 혼합.
   2. 각 샘플에 대 한 신선한 컬렉션 튜브에 필터 카트리지를 넣으십시오.
   3. 필터 카트리지 및 30에 대 한 10000 x g 에서 원심 분리기로 단계 2.3.1과 에탄올에서 lysate의 최대 700 µ L를 전송 s.
   4. 경우 > 왼쪽, 혼합물의 700 µ L는 filtrate에 신선한 튜브 고 반복 단계 2.3.3; 모든 혼합 필터 카트리지 통과 될 때까지 반복 합니다.
   5. 통해 흐름의 전체 볼륨을 측정 합니다.
   6. 여과 하 여 철저 하 게 혼합 에탄올 100%의 2/3 볼륨을 추가 합니다.
   7. 신선한 수집 관에서 두 번째 필터 카트리지를 놓습니다.
   8. 카트리지에 샘플 볼륨의 최대 700 µ L를 전송 하 고 흐름 통해 30 s. 폐기를 위해 10000 x g 에서 원심.
   9. 2.3.8 단계를 반복 하 여 모든 혼합 필터 카트리지를 통과 했다.
   10. 필터 카트리지를 미르 세척 솔루션 1의 700 µ L을 적용 하 고 흐름 통해 15 s. 폐기를 위해 10000 x g 에서 컬렉션 튜브 필터 카트리지를 원심. 동일한 컬렉션 튜브에 필터 카트리지를 놓습니다.
   11. 통해 흐름 필터 카트리지 및 분리기 필터 카트리지 10000 x g 에서 컬렉션 튜브 세척 솔루션 2/3의 500 µ L 15 미 삭제 신청. 신선한 수집 튜브에서 필터 카트리지를 놓습니다.
   12. 신선한 수집 튜브에서 필터 카트리지를 놓고 세척 솔루션 2/3의 2.3.11 500 µ L 단계를 반복 합니다. 통해 흐름 무시 하 고 신선한 컬렉션 튜브에 필터 카트리지를 전송.
   13. 1 분 동안 10000 x g 에서 필터 카트리지와 튜브 원심
   14. 신선한 1.5 mL 컬렉션 튜브로 필터 카트리지를 전송 하 고 데워 (95 ° C) 차입 솔루션 또는 nuclease 무료 물 100 µ L를 추가 합니다.
   15. 30에 대 한 10000 x g 에서 원심 분리기 miRNAs 복구-80 ° c.에 저장 하는 s
       참고: 흰색 침전 세척 솔루션 2/3에에서 형성 수 있습니다. 이것은 초과 EDTA 솔루션에서 출시입니다. Pipetting 단계 동안 이러한 결정을 그리기 하지 마십시오.

3. 수행 반전 녹음 방송 그리고 미르 사전 증폭 (자료 테이블)

1. Polyadenylation 반응 수행
   1. 짧게 소용돌이 회전 원심 분리기 아래 내용을 다음 얼음, 모든 시 약을 녹여. 또한, 해 동 50% 말뚝 8000, 실내 온도 도달할 수 있도록.
   2. 0.5 mL 원심 분리기 튜브, 반응 각 샘플에 대 한 칵테일의 3 µ L의 최종 볼륨을 얻는 반응 혼합을 준비 합니다. 다음 볼륨 플러스 10% 초과 볼륨을 사용 하 여 각 시 약에 대 한.
   3. 추가 RNase 무료 물 1.7 µ L, 10 배 많은 버퍼의 0.5 µ L, 0.5 µ L의 10mm ATP, 그리고 마지막으로 0.3 µ L 5 U / µ L PolyA 효소.
   4. 짧게 소용돌이 원심 회전 칵테일 믹스 다운과 내용을.
   5. 반응 판 또는 반응 관의 각 음에 2 µ L의 샘플을 전송 하 고 칵테일 반응의 3 µ L를 추가 합니다. 짧게 소용돌이 회전 원심 분리기 다운과 내용을.
   6. 열 cycler에 접시/튜브를 놓고 다음 단계를 수행 합니다.
   7. 45 분 (polyadenylation 단계) 37 ° C에서 품 어.
   8. 10 분 (정지 반응), 65 ° C에서 4 ° c.에 다음 보류와 품 어
2. 결 찰 반응을 수행 합니다.
   1. 각 샘플 및 초과에서 볼륨의 10%에 대 한 다음 볼륨 원심 분리기 튜브에 반응 혼합을 준비 합니다.
   2. RNase 무료 물 0.4 µ L, DNA 리가 버퍼, 결 찰 어댑터 x 25의 0.6 µ L, 50%의 4.5 µ L x 5의 3 µ L 추가 말뚝 8000 그리고 RNA 리가의 마지막 1.5 µ L.
   3. 짧게 소용돌이 원심 회전 칵테일 믹스 다운과 콘텐츠.
   4. 많은 미행 제품에 포함 된 각 잘/반응 관에 믹스의 10 µ L를 추가 합니다. 1 분에 1900 rpm에서 접시 통 또는 짧게 vortexing 및 내용 아래로 회전 혼합.
   5. 다음 설정 가진 열 cycler에 접시/반응 관 장소: 부 화 다음으로 60 분 동안 60 ° C에서 4 ° c.에서 개최
      참고: 50% 말뚝 8000 높은 점성 이다. 실내 온도에, 발음 하 고 천천히 분배 사용 합니다. 각 포부와 분배 단계 후 10 plugger 잡고 아래로 흐름에 시 약을 허용 하는 s.
3. 반전 녹음 방송 반응을 수행 합니다.
   1. 원심 분리기 튜브, 각 샘플 및 초과에서 볼륨의 10%에 대 한 다음 볼륨에에서 반응 혼합을 준비 합니다.
   2. 3.3 µ L의 RNase 무료 물, RT 버퍼, dNTP 믹스 (각 25 mM)의 1.2 µ L, 보편적인 RT 뇌관, x 20의 1.5 µ L x 5의 6 µ L RT 효소 혼합 x 10의 마지막 3 µ L를 추가 합니다.
   3. 짧게 소용돌이 원심 회전 칵테일 믹스 다운과 내용을.
   4. 각 잘/반응 관 결 찰 제품을 포함 하 게 믹스의 15 µ L를 추가 합니다. 1 분에 1900 rpm에서 접시 통 또는 짧게 vortexing 및 내용 아래로 회전 혼합.
   5. 다음 설정 사용 하 여 열 cycler에 접시/반응 튜브를 배치 합니다.
   6. 15 분 (반전 녹음 방송) 42 ° C에서 품 어.
   7. 5 분 (정지 반응), 85 ° C에서 4 ° c.에 다음 보류와 품 어
      참고: RT 제품-20 ° C에서 저장 될 수 있습니다 하 고 최대 2 개월까지 안정적으로 유지 됩니다.
4. 미르-앰프 반응 (자료 테이블)을 수행 합니다.
   1. 각 샘플 및 초과에서 볼륨의 10%에 대 한 다음 볼륨 원심 분리기 튜브에 반응 혼합을 준비 합니다.
   2. RNase 무료 물 17.5 µ L, 2 x 미르 앰프 마스터 믹스의 25 µ L 및 미르 앰프 뇌관 믹스 x 20의 2.5 µ L를 추가 합니다.
   3. 짧게 소용돌이 원심 회전 칵테일 믹스 다운과 내용을.
   4. 각 샘플에 대 한 새로운 반응 플레이트 또는 반응 관의 각 음에 반응 혼합의 45 µ L을 전송 합니다. 각 잘 반응 관에 RT 제품의 5 µ L를 추가 합니다. 1 분에 1900 rpm에서 접시 통 또는 짧게 vortexing 및 내용 아래로 회전 혼합.
   5. 열 cycler에 접시/반응 튜브를 놓고 표 1에서 같이 실행 합니다.

4. 실시간 PCR을 수행

1. 각 cDNA 샘플 1:10 0.1 x TE 버퍼에 희석.
2. 각 샘플에 대 한 웰 스/복제의 수를 계산 합니다. 다음 볼륨 원심 분리기 튜브에 반응 혼합 초과에서 볼륨의 10%를 추가 하는 각 샘플에 대 한 준비.
3. RNase 무료 물 4 µ L, 2 x 빠른 고급 마스터 믹스 (자료 테이블)의 10 µ L와 희석된 cDNA의 마지막으로 5 µ L를 추가 합니다.
4. Vortexing에 의해 혼합 하 고 간단히 내용을 아래로 회전 원심.
5. 각 잘 밀봉 하는 접시 고 짧게 원심 반응 혼합의 19 µ L를 전송 합니다.
6. RT-PCR 시스템에 열 프로토콜 (표 2)를 수행 합니다.

결과

진행 성 자유로운 생존 (PFS) 관련 신생 관련 순환 miRNAs의 패널 분석, 전반적인 생존 (OS) 및 객관적인 응답 속도 (오 어) 52 mCRC 중부 B 기반으로 환자 치료에 플라즈마 샘플에서 이러한 바이오 마커의 평가 기술적인 어려움 때문에 도전 이다. 우리는 환자 혈장 샘플, 반전 녹음 방송 및 사전 증폭에서 미르 추출 설립된 메서드를 사용합니다. 제조업체의 지침에 따라과 추출 단계에서 특히 요구 하는 몇 가지 수정만 우리가 성공적으로 우리의 모든 대상 환자 인구 (그림 2)를 평가 한다.

특히, 우리 2 분석 플라즈마 샘플/환자, 기준선과 치료 수정 미르 식 환자 결과와 연관.

우...

토론

miRNAs는 작은 비 코딩 RNAs (18-25 뉴클레오티드 길이에서) 그들의 목표 메신저 RNA의 3' UTR 지역 바인딩 및 억제 및 그것을 타락 하는 것은 가능. 그들은 따라서 변환 수준에서 유전자 식 레 귤 레이 터를 간주 될 수 있습니다. 지난 10 년간, 몇몇 miRNAs 암 개시 및 개발, 진단, 예 후 및 치료에 대 한 유용한 임상 바이오 마커 들을 만들고 상관 되어 있다. RNases에 의해 보호, miRNAs은 혈액, 혈장, 혈 청, 소변과 타 액, 임상 연습¹⁰에 그들의 잠재적인 유용성에 성장 관심사를 주도하 고 있다 같은 생물 학적 체액에서 안정적 형태로 존재 한다.

그럼에도 불구 하 고, 순환 miRNAs의 평가 과제 이며 샘플 수집, 대상 추출, 플랫폼 선택 및 글로벌 표준화에 관한 어려움은 과학 지역 사회 내에서 뜨겁게 논쟁된 주제.

샘플 수집 및 저장에 대 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Rnase-free Safe-lock 1.5 mL 튜브	Eppendorf	0030 123.328
Rnase-free Safe-lock 2 mL 튜브	Eppendorf	0030 123.344
Rnase-free 20 µ L 팁	Starlab	S1123-1810
Rnase-free 200 µ L 팁	Starlab	S1120-8810
Rnase-free 1,000 µ L 팁	Starlab	S1122-1830
mirVana PARIS RNA 및 네이티브 단백질 정제 키트	Thermo Fisher	AM1556
TaqMan Advanced miRNA cDNA 합성 키트	Thermo Fisher	A28007
100% 에탄올 anidrous ACS 등급	Carlo Erba 시약	414605
2-메르캅토-에탄올	Sigma-Aldrich	M3148
TaqMan Fast Advanced Master Mix	Thermo Fisher	4444558
TaqMan Advanced miRNA Assays	Thermo Fisher	A25576
7500 Real-Time PCR System	Applied Biosystems	4406984
0.2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1,000 µ L 실험실용 피펫,
벤치탑 마이크로 원심분리기
, Vortex
, 벤치탑 가열 블록
흄 후드
0.2 mL PCR 튜브