3 차원 동적 문화 시스템과 다층된 중간 엽 줄기 세포 시트의 건설

Summary

이 문서에는 유리한 줄기 세포 재산으로 다층된 줄기 세포 시트를 건설 하기 위한 효율적이 고 실현 가능한 방법을 제공 합니다.

Abstract

줄기 세포 치료 보여줍니다 유망한 재생성 하는 손상 된 장기 및 조직, 미래 및 셀 시트 기술 낮은 세포 보존 및 대상 영역 내에서 가난한 생존을 향상 시키기 위해 개발 되었습니다. 그러나, 생체 외에서 건설 과정 중 줄기 세포 bioactivity를 유지 하 고 셀 시트 내의 셀 금액 증가 대 한 솔루션은 절실히 필요 합니다. 여기,이 프로토콜은 유리한 줄기 세포 bioactivity와 최적의 운용성 다층된 셀 시트를 만들기 위한 메서드를 제공 합니다. Decellularized 돼지 심장 (DPP) 셀 시트 발판으로₂ (PLA₂) decellularization 메서드 phospholipase에 의해 준비 되 고 쥐 골 수 중간 엽 줄기 세포 (BMSCs) 절연 및 시드 셀으로 확장. 임시 다층된 셀 시트 구조는 RAD16를 사용 하 여 건설-나 펩타이드 하이드로 겔. 마지막으로, 셀 시트 동적 관류 시스템을 3 차원 (3D) 구조를 안정화할와 교양 그리고 셀 시트는 48 시간 문화에 체 외에얻을 수 있었습니다. 이 프로토콜 다층된 줄기 세포 시트를 건설 하기 위한 효율적이 고 실현 가능한 방법을 제공 하 고 셀 시트 유리한 줄기 세포 치료 제품으로 미래에 개발 될 수 있습니다.

Introduction

줄기 세포 치료; 많은 질병에 대 한 효과적인 치료로 보고 되었습니다. 그러나, 낮은 세포 보존 및 대상 영역 내에서 가난한 생존 기존의 줄기 세포 주입을 다음과 같은 중요 한 문제 남아 있다. 이 문제를 해결 하려면 조직 공학 과학자 셀 시트 기술 개발. 그대로 세포 외 매트릭스 monolayered 셀 시트 온도 응답 문화 접시¹을 사용 하 여 첫째로 준비 되었다 그리고 그것의 후속 연구 보고 줄기 세포 보존 및 infarcted는 내 생존의 중요 한 개선 지역^2,3. 방법 중에서 다층된 셀 시트 구성 보고 되었습니다 셀 생존과 셀 시트 치료 효과^3,4를 개선 하기 위한 효과적인 전략으로. 그 이후, 과학자 들은 셀 금액, 줄기 세포 속성 및 셀 시트의 기계적 성질을 향상 시키기 위해 다른 셀 시트 공법을 개발 했습니다. 지금까지 특정 유형의 셀 시트 건설 되 고 심근 경색⁵, 연골 부상⁶, 치료에서 공부 하 고 피부 상처^....

Protocol

모든 줄기 세포 및 동물 실험 절차 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 국가 가이드의 윤리 지침에 따라 실시 되었고 제 남 대학교 동물 관리 및 사용 위원회 (광저우, 중국)에 의해 승인.

1. PLA₂ Decellularization와 DPP 발판의 준비 방법¹⁴

주: PLA₂ decellularization 방법의 회로도 대 한 그림 1A 를 참조 하십시오.

1. 100 mL 200 U/mL PLA₂ 솔루션의 준비. 탄산 버퍼 솔루션의 198 mL에 0.5 g의 나트륨 deoxycholate 및 PLA₂ 의 2 개 mL를 추가 합니다. 이 솔루션의 준비 후 24 시간 안에 사용 되어야 한다.
2. 도살에서 신선한 돼지 심장 막 (FPP)을 얻습니다 그리고 1 시간 이내 실험실 돌아갑니다.
   참고:는 FPP 저장 되어야 한다 4 ° C에서 수송 하는 동안. 단계 1.2 1.10 온도 제어 물 욕조에 지속적인 동요와 함께 실시 한다.
3. 철저 하 게 세척 1% 페니실린-스 10 ....

Results

다층된 줄기 세포 시트 건설의 회로도 그림 1에 표시 됩니다. PLA₂ decellularization 메서드에 의해 셀 시트 발판을 준비 하는 것은 첫 번째 단계입니다. 발판을 바탕으로, RAD16-1 펩 티 드 히드로와 줄기 세포를 혼합 하 여 임시 3D 셀 구조는 건설 한다. 유리한 줄기 세포 bioactivity와 최적의 기계적 강도 다층된 셀 시트를 얻으려면 셀 시트 동적 관류 시스템에 양식입니다. 동적 영양 공급에서 줄기 세포는 증식 하 고 다층된 셀 시트 셀 연락처 설정 허용 되 고 ~ 24-72 최종 안정 다층된 셀 시트 제품을 얻을 수 있습니다-시간 재배.

이 경우에, 셀 시트 발판 DPP PLA₂ decellularization 방법에 의해 준비 된다. .......

Discussion

현재 프로토콜 다층된 MSC 시트를 생성 하는 효율적인 방법을 보고 합니다. 이 셀 시트는 최적의 기계적 강도, 높은 셀 시드 밀도, 및 유리한 줄기 세포 bioactivity를 전시 한다. 예를 들어 BMSCs를 사용 하 여, 3 차원 셀 구조는 신속 하 게 구성 RAD16-나 펩타이드 하이드로 겔. 동적 관류 시스템에서 경작 되 고, 후 다층된 BMSC 시트 성공적으로 획득 하 고는 BMSCs 줄기 세포 표식의 높은 식 유지.

임시 다층된 셀 구조를 건설 하는 것은 프로토콜의 중요 한 단계입니다. RAD16-난 상업 히드로 펩 티 드, 그리고 1% 아미노산 및 99% 물으로 구성 됩니다. 여러 연구 보고이 펩 티 드 히드로 ECM 자연을 모방 수 있습니다 줄기 세포 증식과 생존^15,,1617에 대 한 도움이 됩.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
포스포리파제 A2	Sigma-Aldrich	P6534
나트륨 데옥시콜레이트	Sigma-Aldrich	D6750-100G
인산 완충제	Gibco BRL	89033
페니실린 스트렙토마이신 / 암포테리신	Gibco BRL	15640055
완충기 중탄산염	Sigma-Aldrich	C3041
테이블 농축기	Changzhou Aohua Instrument Co.
KT20183 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)	Corning Cellgro	10-014-CVR
남미 태아 소 혈청	Gibco BRL	10270-106/P30-3302
L-글루타민	코닝 셀그로	25-005-CI
0.25% 트립신/2.21 mM EDTA	코닝 셀그로	25-053-CI
바이오 안전성 캐비닛	에스코, 싱가포르	AC2-2S1
항온 인큐베이터	Esco, Singapore	CLS-170B-8
원심분리기 튜브	Corning	430790
EP 튜브	Axygen	31617934
원심 기계	TOMOS	1-16R
설탕	시그마-알드리치	S9378-500G
푸라 매트릭스	BD	354250
동적 관류 배양 시스템	Minucells 및 Minutissue	D-93077
연동 펌프	Ismatec	IPC N8
펌프 튜빙	Ismatec	Nr.1306
MINUSHEET 1300	레겐스부르크		티슈 캐리어 부품
MINUSHEET	레겐스부르크		동적 관류 시스템
MINUSHEET 0006	레겐스부르크		가스 교환 장비
MINUSHEET 0002	레겐스부르크		500 mL 유리병
MINUSHEET 1301			관류 배양 용기