3 차원 동적 문화 시스템과 다층된 중간 엽 줄기 세포 시트의 건설

요약

이 문서에는 유리한 줄기 세포 재산으로 다층된 줄기 세포 시트를 건설 하기 위한 효율적이 고 실현 가능한 방법을 제공 합니다.

초록

줄기 세포 치료 보여줍니다 유망한 재생성 하는 손상 된 장기 및 조직, 미래 및 셀 시트 기술 낮은 세포 보존 및 대상 영역 내에서 가난한 생존을 향상 시키기 위해 개발 되었습니다. 그러나, 생체 외에서 건설 과정 중 줄기 세포 bioactivity를 유지 하 고 셀 시트 내의 셀 금액 증가 대 한 솔루션은 절실히 필요 합니다. 여기,이 프로토콜은 유리한 줄기 세포 bioactivity와 최적의 운용성 다층된 셀 시트를 만들기 위한 메서드를 제공 합니다. Decellularized 돼지 심장 (DPP) 셀 시트 발판으로₂ (PLA₂) decellularization 메서드 phospholipase에 의해 준비 되 고 쥐 골 수 중간 엽 줄기 세포 (BMSCs) 절연 및 시드 셀으로 확장. 임시 다층된 셀 시트 구조는 RAD16를 사용 하 여 건설-나 펩타이드 하이드로 겔. 마지막으로, 셀 시트 동적 관류 시스템을 3 차원 (3D) 구조를 안정화할와 교양 그리고 셀 시트는 48 시간 문화에 체 외에얻을 수 있었습니다. 이 프로토콜 다층된 줄기 세포 시트를 건설 하기 위한 효율적이 고 실현 가능한 방법을 제공 하 고 셀 시트 유리한 줄기 세포 치료 제품으로 미래에 개발 될 수 있습니다.

서론

줄기 세포 치료; 많은 질병에 대 한 효과적인 치료로 보고 되었습니다. 그러나, 낮은 세포 보존 및 대상 영역 내에서 가난한 생존 기존의 줄기 세포 주입을 다음과 같은 중요 한 문제 남아 있다. 이 문제를 해결 하려면 조직 공학 과학자 셀 시트 기술 개발. 그대로 세포 외 매트릭스 monolayered 셀 시트 온도 응답 문화 접시¹을 사용 하 여 첫째로 준비 되었다 그리고 그것의 후속 연구 보고 줄기 세포 보존 및 infarcted는 내 생존의 중요 한 개선 지역^2,3. 방법 중에서 다층된 셀 시트 구성 보고 되었습니다 셀 생존과 셀 시트 치료 효과^3,4를 개선 하기 위한 효과적인 전략으로. 그 이후, 과학자 들은 셀 금액, 줄기 세포 속성 및 셀 시트의 기계적 성질을 향상 시키기 위해 다른 셀 시트 공법을 개발 했습니다. 지금까지 특정 유형의 셀 시트 건설 되 고 심근 경색⁵, 연골 부상⁶, 치료에서 공부 하 고 피부 상처⁷.

줄기 세포 이식 전에 bioactivity 손상된 조직 재생에 새로운 영향 그리고 다른 셀 시트 건설 전략 줄기 세포에 다른 효과가지고. 한 손으로, confluent 셀 시트, 고밀도 줄기 세포만 이루어져 고 자연 세포 외 매트릭스 스태킹 monolayered 셀 시트⁸ 하거나 자기 조직 공학 기법⁹를 사용 하 여 얻을 수 있습니다. 다른 한편으로, 연구원은 적절 한 기계적 강도 제공 하 여 세포 성장^10,11,12, 허용 되도록 영양 밀도 시드 낮은 줄기 세포 지원 다른 건설 기계 개발 공급. 그러나, 이러한 방법에도 불구 하 고 다층된 셀 시트 구조 내에서 낮은 효율적인 영양 공급 체 외에 건설 기간 동안 주요 관심사 남아 있습니다. 따라서, 효율적이 고 실현 가능한 셀 시트 건설 시스템이 급히 필요 합니다.

이 프로토콜 multilayeredmesenchymal 줄기 세포 (MSC) 셀 시트를 준비 하는 단계를 설명 합니다. 이 건설 시스템에서 셀 시트 기계적 강도 DPP에 의해 제공 됩니다. 이 비 계에 따라, 3D 셀 구조 건설 수 있습니다 신속 하 게 RAD16와 함께-난 펩 티 드 히드로, 동적 관류 시스템 문화 다층된 셀 시트 3D 셀 시트 구조를 안정화 하 고 충분 한 영양을 제공 하기 위해 사용 된다 셀에 대 한 공급입니다. 이 시스템을 사용 하 여, 다층된 BMSC 시트 성공적으로 준비 하 고 쥐 심근 경색 모델¹³에 대 한 최적의 치료 효과 전시.

프로토콜

모든 줄기 세포 및 동물 실험 절차 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 국가 가이드의 윤리 지침에 따라 실시 되었고 제 남 대학교 동물 관리 및 사용 위원회 (광저우, 중국)에 의해 승인.

1. PLA₂ Decellularization와 DPP 발판의 준비 방법¹⁴

주: PLA₂ decellularization 방법의 회로도 대 한 그림 1A 를 참조 하십시오.

1. 100 mL 200 U/mL PLA₂ 솔루션의 준비. 탄산 버퍼 솔루션의 198 mL에 0.5 g의 나트륨 deoxycholate 및 PLA₂ 의 2 개 mL를 추가 합니다. 이 솔루션의 준비 후 24 시간 안에 사용 되어야 한다.
2. 도살에서 신선한 돼지 심장 막 (FPP)을 얻습니다 그리고 1 시간 이내 실험실 돌아갑니다.
   참고:는 FPP 저장 되어야 한다 4 ° C에서 수송 하는 동안. 단계 1.2 1.10 온도 제어 물 욕조에 지속적인 동요와 함께 실시 한다.
3. 철저 하 게 세척 1% 페니실린-스 10 ° Cfor 10 분에 500 mL 비 커에 포함 된 인산 염 버퍼 솔루션 (PBS)의 200 mL와 FPP 2 x이이 단계를 반복 합니다.
4. FPP는 2 개의 층으로 분할 하 고 집게와가 위 지방 조직 제거 합니다.
   참고: 모든 20 분의 지방 조직을 제거 하는 동안 PBS의 50 mL를 추가 하 여 젖은 FPP 유지.
5. 가 위는 FPP 10 x 10 cm² 조각으로 모양. 워시 200ml 탄산 버퍼 솔루션 (CBS)의 2 배가이 단계를 반복 하는 10 분에 대 한 1% 페니실린-10 ° C에서 500 mL 비 커에 스를 포함와 FPP.
6. 순수한 물에는 FPP를 전송 하 고 12 h 10 ° C에서 그것을 담가.
7. 200 U/mL PLA₂ 와 6 h 37 ° C에서 0.5% (w/v) 나트륨 deoxycholate 솔루션을 포함 하는 CBS의 50 mL 10 x 10 cm² 샘플을 담근 다.
8. 이 단계 2 x 10 분 반복 10 ° C에서 1% 페니실린-스를 포함 하는 CBS와 샘플을 씻으십시오.
9. 200 U/mL PLA₂ , 2 h 37 ° C에서 0.5% (w/v) 나트륨 deoxycholate 솔루션을 포함 하는 CBS의 50 mL에 각 샘플을 담근 다.
10. 워시 샘플 2 h. 반복 10 ° C에서 1% 페니실린-스를 포함 하는 CBS와 10 x에 대 한이 단계 적어도. 샘플 평면 접시에 놓고 55 ° c.에 오븐을 일정 한 온도에서 일정 무게를 건조
    참고: 샘플 완전히 건조 해야 합니다. 무게 DPP 샘플 마다 10 분 하 고 반복 하는 3 배 또는 무게까지 더 이상 변경.
11. 판형으로 각 DPP 샘플 10.5 m m 직경 원형으로 모양. 살 균 밀봉된 봉투에 각 DPP를 팩.
12. 감마 방사선 (kGy 25)에 의해 DPP 샘플을 소독. 사용 하기 전에 4 ° C에서 DPP 샘플을 저장.
    참고: 모든 샘플은 4 ° c.에 6 달까지 동안 저장 될 수 있다

2. 셀에 대 한 준비 시트 건설

1. 오토 클레이 브 모든 악기와 121 ° C에서 조직 캐리어 구성 요소 1.5 mL 원심 튜브, 겸 자를 포함 하 여 30 분, 집게가 위, 이빨에 대 한 흑인 기지 (조직 캐리어 구성 요소), 그리고 백색 긴장 반지 (조직 캐리어 구성 요소).
2. 무 균 10% 자당 해결책의 20 mL를 준비 합니다. 자당의 2 세대 무게와 초순 물 18 mL에 자당 분해. 30 분 또는 0.22 μ m 필터 필터 솔루션에 대 한 121 ° C에서 10% 자당 해결책 압력솥.
3. 고압 가스를 포함 하 여 30 분 동안 121 ° C에서 동적 관류 시스템 장치 교환 장비, 500ml 유리병, 관류 문화 컨테이너 및 연결 튜브.
4. 압력가 마로 소독 기기 및 조직 캐리어 구성 요소를 준비 합니다. 문화 접시에 조직 캐리어의 검은 기본 부분을 넣어.
5. 말린된 DPP 비 계를 선택 하 고 검은 기지의 중심에 그것을 넣어. 민 비 계에 흰색 긴장 반지를 넣고 조직 캐리어에 그것을 해결.
   참고: 확인 발판은 완전히 조직 캐리어에 고정 블랙 기지와 흰색 긴장 반지 사이 차이가 있다. 그렇지 않다면 조직 캐리어를 분리 하 고 다시 발판을 해결.
6. 재 위한 DPP 발판에 문화 매체의 100 µ L를 추가 합니다.
   참고: 발판 조직 캐리어에 잘 고정 하지 않습니다, 경우 문화 매체 문화 접시에 침투 됩니다.
7. 37 ° C 배양 기에는 비 계를 넣고 15 분 동안 담가 수 있습니다.

3. 셀 시트 건설에 대 한 셀의 준비

참고:이 프로토콜은 100 mm 접시를 사용 하 여 세포 배양. 다층된 셀 구조 건설의 회로도 그림 1B 를 참조 하십시오.

1. BMSCs¹³를 격리 합니다.
   참고:이 메서드는 다중된 MSC 셀 시트를 건설 하기 위한 설계 되었습니다. 쥐 BMSCs이이 프로토콜에 사용 됩니다. BMSCs는 전체 골 부착 방법을 사용 하 여 격리 되며는 BMSCs 확장 된 시험관에 충분 한 셀 크기를.
   1. 고압 121 ° C에서 30 분, 집게,가 위, 이빨된 집게, 등 악기. 2 mL 주입 주사기와 BMSC 문화 매체 (Dulbecco의 수정이 글의 중간 [DMEM], 10% 태아 둔감 한 혈 청, 1% 글루타민, 및 1% 페니실린-스)를 준비 합니다.
   2. 자 궁 경부 척추 전위에 의해 3 주 된 남성 Sprague-Dawley (SD) 쥐를 안락사. 100 mL 비 커 5 분에 75% 알코올 솔루션의 동물을 담근 다.
   3. 비 커에서 동물을가지고 고 작업 테이블에 발생 하기 쉬운 장소. 집게와가 위는 동물의 뒷면에 피부를 incise. 피부와 근육 조직을 노출 허벅지 화관을 격리 합니다.
   4. 허벅지 화관을 분리 하 고 30 mL PBS의 50 mL 원심 분리기 튜브에서에 넣어. 1 개의 관으로 두 허벅지 화관을 놓습니다. 원심 분리기 튜브 조직을 철저 하 게 씻어 소용돌이. 2 x이이 단계를 반복 합니다.
   5. 가 위는 화관의 양쪽 끝을 잘라 고 골 수 구멍을 노출.
   6. BMSC 문화 매체의 2 개 mL를 주입 주사기와 발음. 골 수 구멍에 바늘을 삽입 하 고 문화 매체와 골 수 밖으로 플러시. 한 100 m m 문화 접시에 모든 두 허벅지 화관 밖으로 플러시.
   7. 각 100 m m 문화 요리 문화 접시에 배양의 2 개 mL를 추가 합니다. 문화 요리 72 h에 대 한 정적 문화와 37 ° C 배양 기에 넣어.
   8. 인큐베이터에서 문화 접시를 꺼내. 신선한 문화 매체의 6 mL에는 상쾌한을 바꿉니다.
   9. 기본 BMSCs 현미경으로 관찰 합니다. 이것 다음, 모든 5-7 d는 BMSCs 통로.
2. 인큐베이터에서 세포를 가져가 라. 현미경으로 세포를 관찰 하 고 셀 시트 건설에 대 한 적합 한 셀을 선택 합니다. BMSCs에 도달 80%-90% 합류, 시드 셀으로 셀을 선택할 수 있습니다.
3. 문화 요리에서 문화 매체를 제거 합니다. 부드럽게 따뜻한 PBS의 2 mL로 세포 세척. 문화 요리에서 모든 PBS를 제거 하 고 확실히 더 액체 남아. 접시에 0.25 %trypsin (또는 다른 출신과 솔루션)의 2 개 mL를 추가 하 고 3 분 동안 37 ° C에서 품 어.
4. 문화 매체의 2 개 mL를 추가 하 여 트립 신 효과 중지 하 고 부드럽게 씻어 접시에서 셀. 새로운 15ml 원심 분리기 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 합니다. Centrifugate 225 x g 5 분에 셀.
5. 제거는 상쾌한. 10% (w/v) 자당 솔루션의 3 mL와 함께 셀 resuspend
   참고: 다음 단계에서 균일 한 셀-히드로 혼합물을 얻기 위하여 세포를 씻어 10% (w/v) 자당 솔루션 사용 됩니다.
6. 세포 현 탁 액의 10 µ L 발음과 hemocytometer와 셀 번호. 다음 단계에 필요한 볼륨을 계산 합니다. 한 셀 시트, 3 백만 BMSCs 사용 됩니다.
7. 3 백만 세포를 추출 하 고 새로운 15ml 원심 관으로 그들을 전송. 5 분에 대 한 225 x g 에서 셀 원심
8. 제거는 상쾌한. 10% (w/v) 자당 해결책의 1 mL와 함께 셀 resuspend 1.5 mL 원심 분리기 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 합니다.
   참고: 셀 하이드로 겔 혼합물을 준비 도움이 됩니다 1.5 mL 원심 튜브를 사용 하 여.
9. 원심 260 xg 에서 셀에 대 일 분 완전히 제거는 상쾌한 셀 앙금을 얻을.

4. 준비는 BMSCs는 RAD16의-나 펩 티 드 히드로 혼합물

주: 다층된 셀 구조 건축의 설계도 대 한 그림 1B 를 참조 하십시오.

1. 1.5 mL 원심 관에 10% (w/v) 자당 솔루션의 20 µ L를 추가 합니다. 부드럽게 resuspend는 BMSCs 하 고 균일 한 현 탁 액.
   참고:는 물의 resuspension 동안 모든 거품을 생성 하지 않습니다.
2. RAD16의 20 µ L 추가-난 펩 티 드 하이드로 겔 현 탁 액의 상단에. 부드럽게 저 어는 RAD16-나 피 펫 팁과 펩 티 드와 셀 서 스 펜 션. 세포 현 탁 액 및 히드로 함께 혼합 되어, 부드럽게 플라스틱 혼합물 몇 번.
3. 조직 캐리어에서 DPP 발판에 밖으로가 고 부드럽게 피 펫 팁 문화 매체를 발음.
   주: DPP 비 계는 완전히 셀 하이드로 겔 혼합물을 추가 하기 전에 리하이드레이션 된 확인 하십시오.
4. 혼합물을 발음 하 고 균등 하 게 DPP 비 계에 그것을 추가.
   참고: 혼합물의 전체 볼륨에 대 한 될 것 이라고 40-50 µ L. 발판의 외부에는 센터에서 한 번에 혼합 10 µ L을 추가 하는 것이 좋습니다.
5. 조직 캐리어의 하단에 문화 매체의 1 mL를 추가 합니다. 5 분 동안 37 ° C 배양 기에서 셀 시트를 넣어.
6. 인큐베이터에서 셀 시트를 꺼내. 부드럽게 문화 접시에 배양의 4 mL를 추가 하 고 셀 시트를 담가. 정적 문화의 2 h 37 ° C 배양 기에서 셀 시트를 넣어.

5. 동적 문화 시스템을 사용 하 여 3 차원 다층된 셀 시트의 생체 외에서 문화

참고: 3D 동적 시스템의 회로도 그림 1C 참조.

1. 연동 펌프, 가스 교환 장비, 500ml 유리병, 관류 문화 컨테이너 및 연결 튜브를 포함 하 여 동적 관류 시스템을 준비 합니다. 그림 2와 같이 동적 관류 시스템을 조립.
2. 문화 매체의 200 mL 소독 유리 병에 추가 합니다. 문화 컨테이너의 챔버에 셀 시트를 삽입 합니다.
   참고: 셀 시트의 상부 표면 방향에 주의.
3. 조직 컨테이너에 문화 매체의 3 개 mL를 추가 하 고 컨테이너를 닫습니다. 인큐베이터에서 동적 관류 시스템을 넣고 펌프를 시작. 연동 펌프의 유량 8 mL/분 문화에로 설정 셀 시트 48 h에 대 한 동적 관류 시스템.

6. 취득 다층된 MSC 셀 시트

1. 고압 기기 및 조직 캐리어 구성 요소 1.5 mL 원심 관, 이빨된 집게, 집게, 등 30 분 동안 121 ° C에서.
2. 컨테이너에 문화 매체의 공급 중지 유리 병에서 입력된 덕트를 당겨.
   참고: 때 문화 컨테이너 비어 연동 펌프를 중지 합니다.
3. 문화 컨테이너에서 셀 시트를 꺼내와 문화 접시에 그것을 넣어.
4. 한 집게를 사용 하 여 조직 캐리어를 고정 하 고 다른 이빨된 집게를 사용 하 여 검은 기지에서 흰색 긴장 반지를 구분. 마지막으로, 다중된 BMSCs 셀 시트를 구하십시오.
5. 짧은 보존에 대 한 각 셀 시트는 집게와 원심 1.5 mL 튜브에 전송 수 있습니다. 민 비 계 원심 튜브의 내부 벽에 붙어 있어야 한다 고 셀 시트 전파 한다 원심 분리기 튜브에 가능한 한 많이 밖으로.
6. 부드럽게 셀 시트 몰입할 원심 관에 문화 매체의 1 mL를 추가 합니다. 원심 관의 뚜껑을 닫고 4 ° c.에 셀 시트 저장
   참고: 셀 시트 이식 하거나 최대한 빨리 분석 되어야 한다. 4 h 이내 셀 시트를 사용 하는 것이 좋습니다.

결과

다층된 줄기 세포 시트 건설의 회로도 그림 1에 표시 됩니다. PLA₂ decellularization 메서드에 의해 셀 시트 발판을 준비 하는 것은 첫 번째 단계입니다. 발판을 바탕으로, RAD16-1 펩 티 드 히드로와 줄기 세포를 혼합 하 여 임시 3D 셀 구조는 건설 한다. 유리한 줄기 세포 bioactivity와 최적의 기계적 강도 다층된 셀 시트를 얻으려면 셀 시트 동적 관류 시스템에 양식입니다. 동적 영양 공급에서 줄기 세포는 증식 하 고 다층된 셀 시트 셀 연락처 설정 허용 되 고 ~ 24-72 최종 안정 다층된 셀 시트 제품을 얻을 수 있습니다-시간 재배.

이 경우에, 셀 시트 발판 DPP PLA₂ decellularization 방법에 의해 준비 된다. ...

토론

현재 프로토콜 다층된 MSC 시트를 생성 하는 효율적인 방법을 보고 합니다. 이 셀 시트는 최적의 기계적 강도, 높은 셀 시드 밀도, 및 유리한 줄기 세포 bioactivity를 전시 한다. 예를 들어 BMSCs를 사용 하 여, 3 차원 셀 구조는 신속 하 게 구성 RAD16-나 펩타이드 하이드로 겔. 동적 관류 시스템에서 경작 되 고, 후 다층된 BMSC 시트 성공적으로 획득 하 고는 BMSCs 줄기 세포 표식의 높은 식 유지.

임시 다층된 셀 구조를 건설 하는 것은 프로토콜의 중요 한 단계입니다. RAD16-난 상업 히드로 펩 티 드, 그리고 1% 아미노산 및 99% 물으로 구성 됩니다. 여러 연구 보고이 펩 티 드 히드로 ECM 자연을 모방 수 있습니다 줄기 세포 증식과 생존^15,,1617에 대 한 도움이 됩...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
포스포리파제 A2	Sigma-Aldrich	P6534
나트륨 데옥시콜레이트	Sigma-Aldrich	D6750-100G
인산 완충제	Gibco BRL	89033
페니실린 스트렙토마이신 / 암포테리신	Gibco BRL	15640055
완충기 중탄산염	Sigma-Aldrich	C3041
테이블 농축기	Changzhou Aohua Instrument Co.
KT20183 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)	Corning Cellgro	10-014-CVR
남미 태아 소 혈청	Gibco BRL	10270-106/P30-3302
L-글루타민	코닝 셀그로	25-005-CI
0.25% 트립신/2.21 mM EDTA	코닝 셀그로	25-053-CI
바이오 안전성 캐비닛	에스코, 싱가포르	AC2-2S1
항온 인큐베이터	Esco, Singapore	CLS-170B-8
원심분리기 튜브	Corning	430790
EP 튜브	Axygen	31617934
원심 기계	TOMOS	1-16R
설탕	시그마-알드리치	S9378-500G
푸라 매트릭스	BD	354250
동적 관류 배양 시스템	Minucells 및 Minutissue	D-93077
연동 펌프	Ismatec	IPC N8
펌프 튜빙	Ismatec	Nr.1306
MINUSHEET 1300	레겐스부르크		티슈 캐리어 부품
MINUSHEET	레겐스부르크		동적 관류 시스템
MINUSHEET 0006	레겐스부르크		가스 교환 장비
MINUSHEET 0002	레겐스부르크		500 mL 유리병
MINUSHEET 1301			관류 배양 용기