고해상도 무늬 Biofilm 증 착을 사용 하 여 pDawn-Ag43

요약

유전자 인코딩된 표면 접착 구조물의 광 자극을 사용 하 여 높은 해상도와 대장균 박테리아 biofilms 임의의 공간 패턴에 입금 하는 방법을 설명 합니다.

초록

공간 구조와 패턴 박테리아 biofilms에서 중요 한 역할을 재생합니다. 여기 높은 공간 해상도에서 임의의 공간 패턴으로 대장균 biofilms 경작에 대 한 접근 방법을 설명 합니다. 기술은 유전자 인코딩된 optogenetic 구문을 사용 하 여-pDawn-Ag43-그 푸른 빛에 의해 광 자극에 대장균 에서 biofilm 형성 커플. 우리는 pDawn Ag43 박테리아를 사용 하 여 패턴된 biofilms 경작 필요한 광학 설정 및 프로토콜 준비 pDawn Ag43와 대장균 을 변형 하는 과정 선발. 이 프로토콜을 사용 하 여, 25 μ m 아래 공간 해상도 biofilms 다양 한 표면에 소, 깨끗 한 객실 시설, 또는 표면 전처리 필요 없이 동봉 된 챔버를 포함 하 여 환경 패턴 수 있습니다. 기술은 편리 하 고 가변 제어할 biofilm 패턴화 biofilm 구조의 효과 조사 하는 응용 프로그램에서 사용 하기 위해 적절 한입니다. 더 넓게, 그것은 또한 생체 재료, 교육, 및 바이오-예술에서 잠재적인 응용 프로그램 있다.

서론

Biofilms, 미생물의 표면에 부착 된 사회 이며 그들의 강한 구조-기능을 위해 유명 하다. 공간 형상과 biofilms의 패턴화 재생 중요 한 역할 전체 커뮤니티 기능 (와 반대로)¹. 작은 길이 조정 biofilm 구조에 참여-수십 미크론²순서-어려운 문제를 패턴화 하는 biofilm의 가변 및 편리한 컨트롤. 여기 우리는 biofilms 광학 조명에 따라 정확 하 게 패턴된에서 임의의 형상 되도록 허용 하는 프로토콜을 보여 줍니다.

여기에 제시 된 프로토콜 사용 하 여 pDawn-Ag43³, Ag43의 식 운전 하 여 대장균 박테리아에 biofilm 형성 광학 조명에 커플 optogenetic 구문 (는 adhesin 유전자 표면 접착 biofilm에 대 한 책임 대형) pDawn⁴ (광학 조명에 의해 제어 transcriptional 규칙)의 통제. 방법은 사용 하기 편리 하 고 다양 한에 패턴 biofilms 환경, 동봉된 (투명 한) 문화 챔버를 포함 하 여 표면 수 있습니다. 드롭릿 기반 증 착⁵ 또는 표면 prepatterning/치료⁶, 등 기존 세포 증 착 방법에 비해 pDawn Ag43 뒤틀림 또는 클린 룸 시설을 필요 하지 않습니다. 그리고 그 이상의 재료를 필요로 하지 않습니다. 일반적인 미생물학 실험실을 사용할 수 있습니다. 그것은 자연스럽 게 기존에 microcolonies의 공간 크기를 접근 25 μ m 아래 공간 해상도 패턴 수 biofilms². 전반적으로,이 기술은 biofilm 구조는 다음 세균성 지역 사회⁷microecology를 공부 하는 많은로 조작 하는 기능을 제공 합니다. 또한, 패턴된 biofilms 유용한 바이오^8,9하는 편리한 플랫폼을 제공할 수 있습니다. 이 문서에서 우리 biofilms pDawn Ag43를 사용 하 여 패턴에 필요한 기본적인 프로토콜을 토론 하 고 잠재적인 수정 및 메서드에 관련 문제 해결.

프로토콜

1. pDawn-Ag43 세균성 긴장의 준비

1. PDawn-Ag43 (그림 1)의 E. 콜라이 긴장에 변환.
   1. LB 국물 문화 관 (~ 250 rpm, 37 ° C에서 떨고 인큐베이터)에서 1 박의 50 μ g/mL spectinomycin (파운드 + 사양)와 보완에 긴장을 접종 하 여 (플라스 미드 저장소에서 얻을 수) pDawn-Ag43 플라스 미드를 호스팅 복제 스트레인 성장. 그런 다음 miniprep 키트를 사용 하 여 순화 pDawn Ag43 플라스 미드¹⁰수확.
   2. 패턴화 될 관심의 E. 콜라이 긴장을 선택 합니다. 지금까지, pDawn-Ag43 MG1655³ , BW25113에서 작동 하도록 검증 되었습니다.
   3. 만든된 프로토콜을 사용 하 여 유능한 생성 (예를 들어, 화학적으로 유능한¹¹ 또는 electrocompetent¹²) 선택의 E. 콜라이 긴장 (예, MG1655).
   4. PDawn-Ag43 플라스 미드는 유능한 박테리아^11,12, 1 h 회복과 접시 파운드 + 사양 한 천 배지에서 다음 변환. 37 ° c.에 하룻밤 성장 식민지 허용
2. 스토어 pDawn Ag43 변형 긴장.
   1. PDawn-Ag43는 파운드에서의 단일 식민지 예방 + 파운드에 한 천 배지를 사양 + 문화 관에서 국물을 사양 고 지 수 단계 (OD600 ~0.4-0.8) (~ 250 rpm, 37 ° C)에서 떨고 인큐베이터에서 성장.
   2. 곳을 알아내는-튜브 25% 글리세롤 냉장고 재고를 50% 살 균 글리세롤의 1 mL와 문화의 1 mL를 혼합 하 여 장기-80 ° C에서 pDawn Ag43 변형 긴장을 저장 하는 주식을 준비 합니다. -80 ° C 냉장고에 이것을 저장 합니다.
   3. ¹² pDawn Ag43에서 변형 변형 및 변환 과정¹¹ 반복 추가 플라스 미드 (예를 들어, 형광 기자 플라스 미드) 변형 될, 유능한 세포^11,를 만들 필요가 있는 경우 ^, 필요에 따라 추가 플라스 미드에 대 한 ¹² .
      참고: electroporation⁸를 사용 하는 경우 수는 cotransform 여러 플라스 미드 (를 포함 하 여 pDawn-Ag43) 동시에; 그러나, 동시 변환을 권장 하지 않습니다 화학 변환 방법을 사용 하 여 대형 (> 10 kB) pDawn-Ag43의 변환 효율성은 감소 것을 의미.

2. 조명 박테리아에 대 한 프로젝터 광학 설치의 준비

1. 케이블, 휴대용 프로젝터 피팅 하 고 세균 인큐베이터, 내부 작동을 전달 하기 위한 불투명 벽과 구멍 세균 인큐베이터를 가져오고 노트북 프레 젠 테이 션-투영 (참조 테이블의 소프트웨어를 갖춘 재료). 선택할 때 프로젝터 및 인큐베이터는 프로젝터의 최소 초점 거리 보다 작으면 인큐베이터의 내부 높이 확인 합니다.
2. 상승, biofilm 문화 챔버가 천장에 연결 (그림 2) 직접 인큐베이터 안에 프로젝터 가리키는 조리개와 함께 아래에 놓습니다.
3. 수직 포스트에 연결 된 광학 브레드보드 기본으로 설정을 구성 하 여 장소에 프로젝터 수정 차례로 가로 게시물에 어떤 나사에 연결 프로젝터 (그림 2). 참고가이 설정 프로젝터/사용 가능한 부품에 따라 수정할 수 있습니다. 궁극적으로, 주요 요구 사항이입니다 프로젝터 위쪽으로 가리키는 조리개와 인큐베이터, 아래쪽 단단하게 고정 됩니다.
4. 인큐베이터 안에 프로젝터는 노트북을 통해 디스플레이 케이블 (예를들면, HDMI) 연결 합니다.
5. 경우는 표면-특히 천장-반사 (예를 들면, 금속 광택된 표면), 인큐베이터의 내부는 어두운 매트 표면 반사를 최소화 하기 위해 함께 그들을 커버.
6. 테이프를 사용 하 여 빈 '더미' 문화 접시 인큐베이터의 천장에 연결할. 프로젝터, 문화 접시; 연결할 여러 허용 방법 있다, note 문화 실, 조명 발생의 투명 한 바닥 표면 적용 되지 않습니다 확인 하십시오.
7. 초점 비행기 아래쪽 표면에 biofilm 문화 요리 (예를 들어, 잘 플레이트)의 인큐베이터 (그림 2)의 천장에 연결 된 일치 되도록 초점 손잡이 선회 하 여 프로젝터의 초점을 조정 합니다. 프로젝터는 문화 접시의 바닥에 날카로운, 비-모호한 이미지를 밝게 한다. 투영은 최적화 되었습니다 일단 '더미' 문화 접시를 제거 합니다.
8. 최대 블루 조명 전체 시야를 밝히는 프로젝터를 직접 노트북 소프트웨어를 사용 하 여 (예를 들어, RGB = [0, 0, 255]) 전체 블루 슬라이드를 제시 하 여.
9. 매칭 머리 인큐베이터 천장에 배치 하 고 해당 전원 측정기 빛 파장 460 nm 보정에 강도 읽고 여 광 파워 미터를 사용 하 여 프로젝터 조명 강도 측정 합니다. 연결 하 고 사용 하는 특정 전원 측정기에 대 한 매칭 보정에 지시를 따릅니다.
   1. 주변광을 줄일 (예를 들어, 방 조명, 해제 하거나 인큐베이터 광원에서) 조명 강도 측정을 하기 전에 가능한 만큼 많이.
10. 프로젝터 조리개에 조정 가능한 중립적인 밀도 필터를 사용 하 여 조명 강도 조정 합니다. 블루 빛 예상된 지역 중심의 조명 강도 50 μW/c m²를 읽습니다 때까지 파워 미터에 의해 측정 된 조명 강도 조절 하는 필터를 회전 합니다.
    참고: 소프트웨어 끝에 파란색 RGB 값을 사용 하 여 조명 강도 조정할 수 있지만 사용 하 여 필터를 조명된 vs 사이 시스템의 광학 대조를 극대화의 장점이 파란색 RGB 가치를 극대화 하는 동안. 어두운 지역.
11. 노트북에 프레 젠 테이 션/프로젝터 소프트웨어를 사용 하 여 임의의 패턴을 그릴 하 고 프로젝터를 사용 하 여 보육의 천장에 이러한 패턴을 표시 합니다.
    참고: 최대 블루 조명으로 그린 한다 Biofilm 형성 지역 (예를 들어, RGB = [0, 0, 255]), 아무 조명 biofilm 형성 비 지역 (예를 들어, RGB = [0, 0, 0]).

3. 꽃무늬 Biofilms 경작

1. 조명, 이전 pDawn Ag43 박테리아, 그들은 안정적으로 조명 (그림 3A)에 대 한 후반 지 수 성장 단계에서 유도 된다 그래야 글리세롤 냉장고 재고에서 시작을 준비 합니다.
   1. 글리세롤 재고에 파운드 + 사양 한 천 배지에서 pDawn Ag43 긴장을 행진. 성장 하는 식민지를 허용 하룻밤 (37 ° C).
      참고: 여기에서 조명 문화 단계까지, 셀에에서 머물 수 있도록 어둠 최대한-주변 조명 (예를 들어, subdilution에 대 한)에서 짧은 기간 동안 사용할 수 있습니다.
   2. 파운드에서 한 천 배지에서 pDawn Ag43 박테리아의 식민지 예방 + 국물 사양 성장 하 고 문화 (~ 16 h ~ 250 rpm, 37 ° C에서 떨고 인큐베이터)에서 고정 단계로 하룻밤.
   3. Subdilute 파운드와 1:1,000의 비율로 문화 + 국물 사양 (예, 신선한 파운드 + 사양의 1 mL에 1 μ의 숙박 문화를 추가).
   4. Subdiluted 문화 후반 지 수/초기 고정 단계 (OD ~ 1.0, 떨고 인큐베이터에서 ~ 6 h ~ 250 rpm, 37 ° C)까지 성장 하는 것을 허용 한다.
   5. 성장 하는 문화를 기다리는 동안 준비와 1 x M63 소금, 1mm MgSO₄, 포도 당 0.2%, 0.1 %casamino 산, 물에서 50 μ g/mL spectinomycin M63 미디어 (구성 부품은 멸 균 확인).
   6. M63 미디어 50 μ g/mL spectinomycin 보충 1: 100의 비율로 후반 지 수 상 문화를 subdilute. 그런 다음, biofilm 문화 접시에 희석 소개 (예를 들어, 잘 격판덮개로 희석된 샘플 플라스틱).
      참고:이 1: 100 subdilution에 필요한 볼륨 사용 되 고 문화 요리에 따라 달라 집니다 (예를 들어, 6-잘 폴리스 티 렌 잘 접시 [비-조직-문화 치료], 한 샘플을 사용 하는 경우 필요로 문화의 20 μ M63 + 사양의 2 개 mL를 추가 합니다 6 잘 플레이트의 표준 잘 볼륨은 ~ 2 mL).
2. 샘플은 지금 조명에 대 한 준비, 테이프 표면 접시의 바닥에는 조명을 위한 투명 아래에서 프로젝터에 의해 보장 인큐베이터의 천장에 문화 접시.
   참고: 인큐베이터의 천장 반사, 길 잃은 조명을 최소화 하는 보장 하기 위해 중요 하다.입니다. 길 잃은 조명 또한 감소 될 수 있다 문화 찬으로 블랙 벽 격판덮개를 사용 하 여 비록이 엄격 하 게 필요 하지 않습니다-같은 접시를 사용 하는 경우 확인 하단 표면 투명.
3. 밤새 인큐베이터 (16 h 없이 떨고, 37 ° C에서)에 문화에 biofilms를 허용 합니다. 참고 일부 프로젝터 높은 온도에서 덜 안정 되. 경우, (예를 들어, 30 ° C), 낮은 온도에서 문화 염두에 두고 부 화 시간, E. 콜라이 긴장에 따라 증가 할 수 있습니다 유지.

4. 영상 Biofilms 꽃무늬

1. 밤새 성장의 biofilm 샘플 후 인큐베이터에서 문화 접시를 제거 합니다. 접시 위의 액체 매체에서 분산 planktonic 박테리아로 서 어디 그것은 조명 되어, biofilm 박테리아의 하단 표면에 부착 된 있을 것 이다.
2. Planktonic 셀 (예를 들어, 부드럽게 한 피 펫과 발음으로) 문화 접시에서 액체 미디어를 제거 하 여 삭제 합니다.
3. 샘플 2 린스 부드럽게, PBS에 pipetting으로 나머지 planktonic 세포 (그림 3B)를 제거 하는 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 솔루션 x 뒤 포부.
4. 셀 태그 붙일 경우 직접 형광 현미경 검사 법¹³ (예, 넓은 필드¹³, 3 차원 confocal¹⁴, 등)를 사용 하 여 샘플 이미지.
   참고: 형광 biofilms 수 또한 유지 자경 설치 매체를 사용 하 여. Biofilm 샘플 미디어를 장착 한 방울을 적용, 아래, 모든 거품을 잡으려고 하지 돌보는 유리 coverslip로 그것을 커버 하 고 하룻밤 이미징 하기 전에 강화 있습니다.
5. 사용 하는 세균성 세포 붙일 태그가 지정 되지 이미징 이전 크리스탈 바이올렛 얼룩 기법¹⁵ biofilm 대비 향상을 (그림 3B)를 적용 합니다.

5. 프로토콜 수정/대안

1. 다른 표면에 pDawn Ag43 박테리아를 성장.
   1. 유리 또는 폴 리 디 메 틸 실록 산 (PDMS) 쿠폰 (예, coverslips 또는 PDMS의 얇은 스트립) 세균 샘플/조명의 추가 전에 잘 접시에 놓고 따라 동일한 프로토콜 이전과 패턴 pDawn ag43 biofilms에 유리 하 고 PDMS입니다.
2. 투명 하 고, 동봉 된 문화 내부 pDawn Ag43 박테리아를 성장.
   1. PDMS 위한 문화 챔버 형을 생성 합니다.
      1. 기본적인 문화 챔버, 하드, 직사각형 프리즘 (프리즘 PDMS 몰드 캐스팅 되 면 문화 챔버 역할에 캐비티를 될 것입니다) 평평한 표면에 부착 하 여 금형을 생성 합니다. Note 더 복잡 한 문화 챔버 형 소프트 리소 그래피¹⁶를 사용 하 여 날조 될 수 있다.
   2. PDMS 몰드에 붓는 고 치료할 수 있도록 PDMS 캐비티 캐스팅 (자세한 소프트 리소 그래피 프로토콜 정돈의 과학 교육 데이터베이스¹⁶참조).
   3. 치료, 후 어떤 초과 PDMS 트림, 구멍/문화 챔버로 입구/출구 채널 펀치 하 고 평평한 표면 위에 PDMS 표면 사이 구멍을 떠나 단단히 눌러 평평한 표면 (예를 들어, 유리/폴리스 티 렌)에 캐비티를 채권 및 biofilm 문화 약 실로 PDMS 천장입니다.
      참고: 더 영구적인 결합 플라즈마 치료¹⁶ 에 따라 사용할 수 있습니다, 하지만 칩 다음 되지 않습니다 재사용.
   4. PBS 버퍼 (그림 3C)와 문화 챔버/린스에 세균 샘플을 소개 (대신 피 펫) 무딘 팁 바늘 주사기를 사용 하 여 앞으로 문화 프로토콜을 따릅니다.
      1. 일시적으로 보 세 구멍을 사용 하는 경우를 액체 에/아웃 캐비티 내부 유리/폴리스 티 렌 표면에서 unbonded 되지 않습니다 수 있도록 챔버의 유일한 부정적인 압력을 사용 합니다.
3. 영화 포토 마스크를 사용 하 여 구조적된 조명에 대 한 pDawn Ag43 박테리아를 성장.
   1. 영화 포토 마스크 프린터/인쇄 서비스와 호환 CAD 소프트웨어를 사용 하는 biofilm 패턴 디자인. 다른 곳에서 포토 마스크 필름 디자인은 지역에 biofilm 인쇄할 수 의미는 명확 하 고 검정/불투명 이어야 한다입니다. 완료 되 면 프린터/인쇄 서비스에 포토 마스크 파일을 전송 하 고 실제 포토 마스크의 반환을 기다리고 있습니다.
   2. 최대 블루 조명 전체 시야를 밝히는 프로젝터 지시 (예를 들어, RGB = [0, 0, 255]) 노트북 소프트웨어를 사용 하 여.
   3. 더 큰 영화 포토 마스크, 테이프 biofilm 문화의 하단에 직접 그것은 야간 조명 (그림 3D)에 대 한 세균 샘플 소개 전에 접시에서 관심 영역을 잘라. 이전과 biofilms 문화 고 이미징 이전 경작 후에 포토 마스크를 제거 합니다.

결과

PDawn Ag43 박테리아 biofilms 프로젝터 조명 (폴카 도트 패턴을 조명 하는 프로젝터 설정), 폴리스 티 렌 잘 판 패턴을 생성 하기 위해 사용 되었다 그림 4A에서 볼, 크리스탈 명시 야 현미경을 통해 몇 군데 대조 대리인, 및 빨간 형광 단백질 표현 박테리아를 사용 하 여 형광 현미경으로 보라색 얼룩. 형광 biofilm 샘플 수 또한 될 몇 군데 confocal 현미경 검사 법¹⁴ 3 (그림 4B) 차원에서 biofilm의 이미지를 사용 하 여. 그림 4C,에서는 우리 꽃무늬 biofilm 샘플을 제공 하는 영화 포토 마스크를 사용 하 여 가능한 고해상도 패터 닝을 보여줍니다. 마지막으로, 그림 4D 4E에 동봉 된 PDMS 문화 실 뿐만 아니라 유리 및 PDMS 표면에 모방의 예 설명-이 보여주는 다양 한 유형의 환경 pDawn Ag43 패턴을 적용할 수 있습니다.

그림 1: pDawn Ag43 박테리아 (프로토콜 섹션 1)의 준비. 호스트 스트레인 복제, 관심, E. 콜라이 긴장에 변형 및 세균 냉장고 재고 만들기에서 pDawn Ag43 플라스 미드 정화 하는 포함 한다 pDawn Ag43 박테리아 빛 규제 biofilm 형성의 능력을 준비 장기 스토리지입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2: biofilm 샘플 조명 (프로토콜 섹션 2)에 대 한 광학 설치의 준비. 광학 설정 세균 인큐베이터 안에 지 내게 하며 컴퓨터 연결 프로젝터 조명 biofilm 샘플 구성 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3: 패턴화 biofilms (프로토콜 섹션 3)에 대 한 프로토콜 문화. (A) 이전 조명에, pDawn-Ag43 박테리아 그들은 안정적으로 적절 한 성장 단계에서 유도 된다 그런 패턴 사전 준비가. (B) 후 하룻밤 조명 성장, 꽃무늬 biofilm 액체 매체에 있는 planktonic 셀 함께 문화 접시의 바닥에 있을 것입니다 그리고 몇 가지 추가 처리 한 후는 biofilm 이미징에 대 한 준비. (C) 접시를 잘 하는 대신, biofilms 성형된 PDMS 구멍 같은 동봉된 문화 실에서 배양 수 있습니다. 이 경우에, 샘플을 소개 하 고 챔버의 액체를 플러시 무딘 팁 바늘에 연결 된 주사기를 사용할 수 있습니다. (D) 프로젝터 기반 조명 패턴을 대신, 패턴 또한 생성할 수 biofilm 문화 챔버의 바닥에 직접 영화 포토를 찍고. 이 경우에, 전체 분야에 걸쳐 파란 빛을 밝히는 프로젝터 설정 되어야 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4: pDawn Ag43를 사용 하 여 패턴 biofilms의 대표적인 결과. 모든 결과 MG1655 대장균 호스트 스트레인을 사용 하 여 얻은 했다. (A) pDawn Ag43 박테리아 biofilms 프로젝터 조명 (폴카 도트 패턴을 조명 하는 프로젝터 설정), 폴리스 티 렌 잘 판에 패턴을 생성 하는 데 사용 했다 명시 야 현미경으로 크리스탈 바이올렛 얼룩과 통해 몇 군데는 대비 에이전트, 그리고 레드 형광 단백질 표현 박테리아를 사용 하 여 형광 현미경 검사 법. (B) 형광 biofilm 샘플은 biofilm의 3 차원 이미지를 얻기 위해 confocal 현미경 검사 법으로 몇 군데 있습니다. (C) 고해상도 biofilms 꽃무늬 biofilm 샘플을 제공 하는 영화 포토 마스크와 패턴 수 있습니다. (D) Biofilms 유리 및 PDMS 표면에 모방 될 수 있다. (E) Biofilms 동봉된 문화 실에서 모방 될 수 있습니다. 이 그림은 이전 작업³에서 적응 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

문제	잠재적인 원인/솔루션
트래버스 호스트 스트레인-아니 식민지에 pDawn-Ag43	플라스 미드 농도 낮은-분석기에 플라스 미드 농도 선택 합니다. PDawn-Ag43의 전형적인 miniprep는 적어도 100 ng/μ; 양보 해야 사용 하 여 10-100 ng 변환에 대 한
체크/리 메이크 유능한 세포: 유능한 셀 변환 효율 10 이상 있어야 ^6 cfu / µ g pUC19-하지 않을 경우, 리 메이크 유능한 세포 같은 표준 플라스 미드를 사용 하 여 확인
잘못 (수준) 항생제 파운드 천 배지-에 선택에 대 한 50 μ g/mL spectinomycin를 사용할 수 있는지 확인
프로젝터 조명 끄기 / 일관성을 하룻밤 밝혀 졌	같은 문제가 있는 소프트웨어를 사용 하지 않도록 설정: 자동 하룻밤 소프트웨어/운영 체제 업데이트, 야간 블루 빛 필터
프로젝터는 과열 될 수 있습니다.-프로젝터 동안 낮은 온도 설정된 인큐베이터 설정 (예: 30 ° C에 37 ° C 대신)-참고 프로젝터로 열 세트 포인트 넘어 인큐베이터 과열 수 있습니다.
이러한 프로젝터 전자에 영향을 미칠 수 있습니다 인큐베이터에서 습도의 불필요 한 소스 제거
없음/낮은 수준의 biofilm의 야간 조명, 아니 planktonic 세포 성장 후도 형성 (즉 액체 분명 하다)	잘못 (수준) 항생제-50 μ g/mL spectinomycin를 사용할 수 있는지 확인
모든 것이 제대로 M63 제조 법에 추가 확인
야간 조명, planktonic 셀만 후 형성 된 biofilm의 No/낮은 수준 (즉, 액체는 흐린)	체크 빛 수준, 프로젝터 해야 될 조명 μW/50cm에 블루 빛 ^460 nm 파장에서 2
박테리아는 이전에 M63 추가 파운드 subdilution 단계 1:1000 후 짧은/긴 시간에 대 한 성장 시키는 시도
파운드 격판덮개에 박테리아를 restreak, 야간 고정 단계 문화를 생성 하는 신선한 식민지에서 시작
프로젝터는 하룻밤 지속적으로 노력 하 고 있다-참조 확인 포인트 위
퍼지 biofilm 패턴, 배경 잡음의 높은 수준	광학 조명 시스템에서 길 잃은 빛을 감소, 인큐베이터의 내부에 반사 표면 커버
(반대로 프로젝터 기반) 포토 마스크 기반 구조적된 조명 사용을 고려합니다
프로젝터 제대로 biofilm 문화 챔버의 하단 표면에 초점을 맞춘 확인

표 1: 공통 문제 해결입니다.

토론

Biofilm 구조 제어를 허용 하는 연구 도구에 대 한 필요성에 비추어 우리는 pDawn-Ag43 optogenetic 구문을 사용 하 여 박테리아 biofilms 패턴화를 위한 사용 하기 쉬운 프로토콜을 제시 했습니다. 이 기술로 대장균 biofilms 광학 25 μ m 아래 공간 해상도 함께 동봉 된 챔버를 포함 하 여 다양 한 표면 환경에 꽃무늬 될 수 있습니다.

전반적으로,이 프로토콜 세분화 될 수 있습니다 4 개의 주요 섹션으로: pDawn Ag43 박테리아의 준비 (1), (2) 광학의 준비 및 문화 설정 하드웨어, (3) 사전 조명 세균성 성장 단계, 및 (4) 후 조명 린스와 영상입니다.

섹션 1의 중요 한 부분은 관심의 E. 콜라이 긴장으로 pDawn Ag43 플라스 미드의 성공적인 변환. 이 높은-품질 순화 된 플라스 미드를 분리 하 고 생성 하는 변환에 대 한 높은-품질 유능한 세포에 의해 촉진 된다 (표 1, 문제 해결).

섹션 2의 중요 한 부분을 조명 강도 50 μW/cm² 460 nm 파장에 조정 되 고 프로젝터 제대로 biofilm 샘플 높이에 초점을 맞춘 프로젝터 설정의 최적화입니다. Note이 프로토콜에서 우리는 거꾸로 조명 설정 어디 프로젝터 빛나는 빛 아래에서, 위쪽으로 향해 biofilm 샘플 설명. 이 설정의 장점은 빛만 해야 한다는 biofilm 형성 표면에 도달 하기 전에 문화 접시의 바닥을 통해 여행. 조명 빛은 성장 과정 중 흐리고 planktonic 셀으로 가져옵니다 biofilm 표면 위에 액체 매체를 통해 여행 하는 의미에서. 이러한 우려 뿐만 아니라 그것은 또한 예를 들어 인큐베이터의 내부에 반사 표면을 취재 하 여 광학 설정 가능한 만큼, 길 잃은 빛을 최소화 하는 것이 중요-이 선명한 꽃무늬 biofilms를 얻을 하는 데 도움이. 관련된 메모에서 선명 biofilm 패턴 또한 조명 패턴 (그림 3D, 그림 4C)를 제어 하는 포토 마스크를 사용 하 여 얻을 수 있습니다. 문제 해결을 요구 하는 일반적인 문제는 컴퓨터 소프트웨어 뿐만 아니라 프로젝터 신뢰성 문제는 biofilm 성장 (예, 30 ° C) 낮은 온도에서 배양 하 여 최소화 될 수 있다, 더 높은 온도 (예, 37 ° C)에서 포함 하는 운영 체제 업데이트 또는 하룻밤 성장 (표 1) 중에 필터링 하는 푸른 빛을 발생 합니다. 그것은 또한 중요 하, 프로젝터 및 인큐베이터 모델 사용, 따라는 것도 가능한 프로젝터에서 생성 된 열 인큐베이터 설정 수정 해야 할 수 있는 온도 보다 높은 실내 온도에서 발생 합니다.

전에 그들은 조명에 의해 유도 된다 제 3의 중요 한 부분 안정적이 고 반복 가능한 세균 샘플을 얻는 이다. 이러한 이유로 것이 좋습니다 한 천 배지에서 그들을 밖으로 줄이 다음 되도록 박테리아 조명/유도 반복에 후반 지 수 성장 단계에서 액체 문화 단계를 사용 하 여 pDawn Ag43 박테리아의 클론 식민지를 방식 으로입니다.

마지막으로, 제 4의 중요 한 부분을 철저 하 게, 하지만 또한 부드럽게 씻어 프로토콜; 패턴화 biofilm 후 남은 planktonic 셀은 따라서, PBS와 여러 부드러운 린스 단계를 수행 하는 것이 좋습니다.

셀 패턴^5,에 대 한 기존 기술에 비해⁶, 패턴에 따라 pDawn Ag43 광학 biofilm를 사용 하려면 항목의 합리적으로 낮은 장벽에가지고 소, 깨끗 한 객실 시설, 복잡 한 필요 하지 않습니다. 화학, 또는 표면 전처리, 패턴 제작 기술로 일반적으로 관련 된 높은 해상도 (25 μ m)와 수은 아직. 메서드를 사용 하면 진 식¹⁷을 제어 하기 위한 세균성 사진 평판에 대 한 이전 작업을 확장 합니다. 현재, pDawn-Ag43 플라스 미드 복제, pUC 기반 근원 사용 하지만 pDawn와 Ag43는 둘 다 다른 (그람 음성) 세균성 종에 호환 대장균, 제한 됩니다. 유전자 기술 잠재적으로 소개 하는 다른 세균 종 빛 규제 biofilm 형성에 대 한 사용할 수 있으며, 미래 연구에 대 한 가능한 방향을 나타냅니다. 기술은의 또 다른 잠재적인 한계 그것 약한 네이티브 biofilm 형성 (예, MG1655 대장균) 긴장에 biofilm 형성을 증가 시켜 작품 이다. 그러나, 강력한 네이티브 biofilm 형성 된 종자는 제외 패턴된 biofilm 형성 여기; pDawn-Ag43 설명 된 대로 사용 하 여 조명 조건에 biofilms 양식 아직 optogenetic 기술을 여전히 biofilm 형성 조절에 적용 가능한 증명할 수 있습니다. 우리는 다른 문맥에서 biofilm 패터 닝의 대체 방법을 통해 광 c-디-GMP 변조¹⁸등, 사용할 수 있습니다는 주의.

전반적으로, pDawn-Ag43 기반 패터 닝 하는 기능¹ 에 biofilm 구조의 영향을 조사 하 고, 따라서, biofilm 패턴화 가변 제어에서 혜택을 수 있는 응용 프로그램에서 사용 하기 위해 적절 한 될 것입니다-특히 관련 강조 하기 위해 예 biofilms²미생물 생태학의 연구 이다. 미래 방향 패턴된 바이오^8,9 또는 구조적된 세균성 지역 사회를 만드는 포함 됩니다. 대체이 액세스할 수 있는 프로토콜의 또한 애플리케이션으로 바이오 아트¹⁹, 공식 및 비공식 생명 과학 교육^20,,2122뿐만 아니라 분명히 미적 가능성, 주어진 있다. 교육의 관점에서 여기에 설명 된 프로토콜 많은 관련 기술 (세균성 문화, 변환, 광학/optogenetics)를 결합 한 제품 이며 또한 하였으므로 연장 (예를 들어, 마이크로 포함).

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DH5alpha/pDawn-Ag43	Addgene	107742	DH5alpha 클로닝 균주 pDawn-Ag43 플라스미드 - 플라스미드
MG1655 E. coli	Coli Genetic Stock Center - Yale University	CGSC #6300	MG1655를 본 논문의 대표적인 결과에서 관심 있는 E. coli 균주로 사용함
RFP 발현 플라스미드	iGEM biobricks	J04450-pSB4K5bb	형광 세균을 얻기 위한 많은 옵션이 존재합니다 - 플라스미드를 사용하는 경우, 백본이 pDawn-Ag43
Plasmid miniprep kit	Qiagen	27104
LB 국물 분말	Affymetrix	75852	물에 20 g/L를 추가하고, 오토클레이브를 추가하고, 50 &mu를 추가합니다. 멸균 LB + spec LB 한천 분말을 얻기 위해 g / mL spectinomycin
	Affymetrix	75851	물에 35 g / L를 추가하고, 오토 클레이브, 50 &mu를 추가합니다. g/mL 스펙티노마이신, 페트리 접시에 붓고 멸균 LB+사양 플레이트를 얻습니다
페트리 접시	Fisherbrand	431760
스펙티노마이신 염산염 펜타하이드레이트	abcam	ab141968	물에 1000x 스톡 50mg/mL 만들기, 필터 살균 및 필요에 따라 매체로 희석
글리세롤	Sigma-Aldrich	G5516	물과 1:1 비율로 혼합, 오토클레이브 또는 필터로 살균하여 50% 글리세롤 획득
M63 매체 염 5X 용액	Bio-world	705729	cas-amino acids, glucose 및 MgSO4를 첨가하고 멸균수 Casamino acids를 첨가하여 1X 염 농도로 가져옵니다
	Amresco	J851	20 %를 물에 저장하고, 여과 살균 및 보충제로 M63에 첨가 (최종 농도 0.1 %)
D- 포도	Sigma-Aldrich	G8270	20%의 재고를 물에 넣고, 여과하여 살균하고 M63에 보충제로 첨가하십시오 (최종 농도 0.2%)
. 마그네슘 황산	염 Sigma-Aldrich	M7506	물에 1 M 재고를 만들고, 오토클레이브를 사용하여 M63에 보충으로 첨가하십시오 (최종 농도 1 mM)
Crystal violet	Acros 유기물	212120250	사용하기 전에 물에 0.1%로 희석
자체 경화 장착 매체(Shandon immumount)	Thermo Scientific	9990402	형광 이미징을 위해 장기간 샘플을 보존하는 데 사용합니다
산염 완충 식염수(PBS) 용액	Gibco	10010023	분말/정제 6웰 플레이트로 제조된 PBS도 사용할 수 있습니다
	Fisherbrand	351146	대표적인 결과를 위한 생물막 배양 접시로 사용
PDMS 키트	Dow	SYLGARD 184	소프트 리소그래피를 사용하여 밀폐된 마이크로 챔버 캐비티를 만드는 데 사용할 수 있습니다
1 mL 주사기	BD 주사기	309659	밀폐된 마이크로 챔버를 사용한 액체 취급에 사용
무딘 팁 바늘	CML 공급	901-23-050	1mL 주사기에 부착
실험실 테이프	Fisherbrand	15-901	인큐베이터 천장에 배양 챔버를 부착하는 데 사용
박테리아 인큐베이터	Sheldon Manufacturing	SMI6	인큐베이터의 내부 높이가 프로젝터를 천장에 초점을 맞출 수 있을 만큼 충분히 높은지 확인
휴대용 프로젝터	Ivation IV-PJ-PRO-4-1		많은 휴대용 프로젝터 모델이 존재하며, pDawn-Ag43은 LED/레이저 기반을 포함한 여러 모델로 테스트되었으며, 450-460nm 중심 파장 범위의 청색광 채널
브레드보드 베이스	ThorLabs	MSB6	베이스는 프로젝터를 고정하기 위한 광학 설정을 위한 베이스 - 다른 많은 설정 가능, 인큐베이터 바닥에 프로젝터를 단단히 고정하고 위쪽을 가리키기만 하면 됩니다.
광학 포스트	ThorLabs	TR8	2 개의 포스트 필요 - 하나는 브레드 보드 베이스에서 수직으로 확장되어 설정, 다른 하나는 직각 클램프를 통해 수평으로 부착
광학 포스트 직각 클램프	ThorLabs	RA90	수직 및 수평 포스트
연결 마운팅 베이스	ThorLabs	BA1S	광학 브레드 보드 베이스와 수직 포스트
연결 1/4"-20 나사	ThorLabs	SH25S050	수직 포스트를 마운팅 베이스에 부착, 마운팅 베이스를 브레드보드 베이스에 부착
1/4"-20 고정 나사	ThorLabs	SS25E63D	삼각대 나사 구멍을 통해 수평 포스트를 프로젝터에 연결
광학 파워 미터	Newport	840	프로젝터 조명 강도를 측정하기 위해 파워 미터 감지기와 함께 사용 - 많은 파워 미터 모델이 존재하며 확장 가능한 감지기를 사용하면 측정
이 용이해집니다.광학 파워 미터 감지기	Newport	818-UV	파워 미터에 연결 (위) - 청색광이 가시 범위 내에 있으므로 UV 감지기가 반드시 필요하지 않음
조정 가능한 ND 필터	K & F 개념	SKU0689	조정 가능한 (회전) 중립 밀도 필터 - 프로젝터 조리개 위에 배치
프레젠테이션 - 프로젝터 소프트웨어	Microsoft	Powerpoint	그림 / 프리젠 테이션을 허용하는 모든 소프트웨어는
CAD 소프트웨어로	Autodesk	AutoCAD	포토마스크 설계에 사용되며 많은 마스크 인쇄 서비스가 AutoCAD 파일과 호환됩니다.
필름 포토마스크	Fineline Imaging	해당 없음	고해상도(>30000DPI) 필름 포토마스크 인쇄를 위한 많은 포토마스크 프린터 서비스가 존재합니다