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방법 논문

풍부 하 고 확장 하는 자성 나노 입자와 희귀 한 항 원 특정 T 세포

10.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/58640

⸱

2018년 11월 17일

 , 
1Department of Biomedical Engineering, School of Medicine, Johns Hopkins University, 2Institute for Cell Engineering, School of Medicine, Johns Hopkins University, 3Institute for Nanobiotechnology, Johns Hopkins University, 4Department of Pathology, School of Medicine, Johns Hopkins University

이 논문에서

요약

항 원 특정 T 세포는 특성 또는 그들의 매우 낮은 주파수로 인해 치료에 활용 하기 어렵다. 우리이 세포를 풍부 하 게 항 원 특정 T 세포에 바인딩할 수 있는 자석 입자를 개발 하는 프로토콜을 제공 하는 여기, 그리고 그들에 게 몇 가지 확장 특성 및 치료에 대 한 배.

초록

우리는 모두 풍부 하 고 항 원 특정 T 세포를 확장 하는 도구를 개발 했습니다. 이 B) 항 원 특정 응답의 역학 조사, A) 항 원 특정 T 세포의 존재를 검출 하는 C) 이해에 같은 경우에 도움이 될 수 항 원 특정 응답 자가 면역 질병 상태에 영향을, 어떻게 D) demystify 이기종 항 원 특정 T 세포, 또는 전자에 대 한 응답) 치료에 대 한 항 원 특정 셀을 사용합니다. 도구 자성 입자에에 따라 우리 항 원 특정 및 T 셀 co-stimulatory 신호, 켤레는 우리가 인공 항 원 제시 세포 (aAPCs)으로 기간. 따라서, 기술 생산 간단 이기 때문에, 그것은 쉽게 채택 될 수; 다른 실험실에 의해 따라서, 우리의 목적을 여기 제조와는 aAPCs 사용 자세하게에서 설명 이다. 우리는 aAPCs를 항 원 특정 및 co-stimulatory 신호를 연결 하는 방법, 항 원 특정 T 세포에 대 한 풍부 하 게 그들을 활용 하는 방법 및 항 원 특정 T 세포를 확장 하는 방법을 설명 합니다. 또한, 우리는 엔지니어링 디자인 고려 사항 항 원 특정 T 세포 특성화와 우리의 경험의 실험 및 생물 정보에 따라 강조 표시 됩니다.

서론

많은 immunotherapies의 증가 함께 특성화 및 면역 반응을 제어할 수 있을 필요가 있다. 특히, 적합 한 면역 반응 특이성 및 셀의 내구성 때문에 관심사의 이다. 최근, 공상 항 원 수용 체 T 세포 치료 암 치료; 대 한 승인 되었습니다. 그러나, 항 원 수용 체는 일반적인 세포 표면 항 원 CD19, 특정 암1항 대신 떨어져 근거한 다. 특이성, 넘어 immunotherapies 제어, 그리고 제한 된 암이 나 자가 면역 내 동적 면역 반응을 이해의 부족에서 또한 겪을 수 있다.

항 원 특정 응답을 공부 하는 과제 중 하나는 그들의 매우 낮은 주파수, 예를 들어., 항 원 특정 T 세포는 모든 10의 14 106 T 세포2,3. 따라서, 조사는 T 세포가 존재 하거나, 셀 중 농축 하 고 확장 될 필요가 그들의 신호 증폭 될 필요가. 그것은 비싼 고 항 원 특정 셀의 확장에 초점을 현재 기법을 사용 하 여 피더 세포를 유지 하기 어렵다입니다. 항 원 특정 T의 신호 증폭에 초점 현재 기술을 세포, 효소 연결 된 immunospot (ELISPOT) 분석 결과 처럼, 다시 그 T 세포4의 사용 제한. 마지막으로, 낮은 감도 때문에 종종 이러한 두 기술이 필요 항 원 특정 열거형에 대 한 결합.

이러한 문제를 해결 하는 자기 나노 입자 기반 인공 항 원 제시 세포 (aAPC)5,6,7,8개발 했습니다. aAPC와 항 원 특정 신호 펩 티 드 로드 중요 한 조직 적합성 복잡 한 (pMHC)-co-stimulatory 분자-functionalized 수예., 안티 CD28 항 체-둘 다 풍부 항 원 특정 T 세포 그리고 그 후 (그림 1) 그들의 확장을 자극. 따라서 입자는 비용 효율적인 상용 제품을 수 모두 항 원 특정 stimulations를 충족 하도록 사용자 정의 아직 실험 및 환자 표준화 수 있다. 농축 및 확장 수행 항 원 특정 CD8 + T 세포의 수천 배 확장 수백에서 결과 처리 하 고 주파수에서 발생할 수 있습니다 최대 60% 단지 1 주일 후 특성 또는 대형의 치료 사용 셀의 수입니다. 여기, 우리는 나노 aAPCs, 나노 속성 선택에 몇 가지 중요 한 디자인 고려 사항을 확인 하는 방법을 설명 하 고에서 분리 하 고 확장 하는 희귀 한 항 원 특정 CD8 + T 세포에이 입자를 활용 하 여 몇 가지 전형적인 결과 보여 줍니다.

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프로토콜

모든 마우스는 존스 홉킨스 대학의 기관 검토 위원회에 의해 승인 지침 당 유지 되었다.

1. 원하는 항 원 펩 티 드 순서 Dimeric 중요 한 조직 적합성 복잡 한 면역 글로불린 융합 단백질 (MHC-Ig)를 로드 합니다.

참고: H-2 Kb를 사용 하는 경우: Ig, 다음 따라 단계 1.1; 상세한 프로토콜 H 사용 하는 경우-2Db:Ig, 다음 따라 단계 1.2에서 상세한 프로토콜.

  1. 활성 펩 티 드 순서에 H-2 Kb의 로드: Ig.
    1. 필요한 버퍼를 준비 합니다. 이온된 수에 150 mM NaCl 및 15 m m 나2CO3 의 솔루션을 만드는 다음 11.5에 pH를 조정 하 여 변성 버퍼를 준비 합니다. 이온된 수에 250 mM Tris HCl의 솔루션을 만드는 6.8에 pH를 조정 하 여 renaturation 버퍼를 준비 합니다.
      참고: 일반적으로, 그것은 필요 합니다 약 5 mL의 변성 및 renaturation 버퍼 1 mg의 H-2 Kb: Ig.
    2. H-2 Kb 변성: 향상 된 펩 티 드 바인딩 수 있도록 Ig. H 2 Kb를가지고: 0.5-2 사이 Ig 농도 mg/mL 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)와 함께. 다음 H 2 Kb 희석: 5-10 볼륨 변성의 해당 버퍼와 15 분 동안 실내 온도에 알을 품을 수 있도록 100-200 µ g/mL의 최종 농도에 Ig.
    3. 펩 티 드의 50 어 금 니 과잉 추가 순서 (보통 주식 펩타이드 보관-80 ° C에서 1 m m)에 H-2 Kb: Ig 솔루션.
      참고: 일반적으로 펩 티 드 항 원 해야 합니다 10% 내에서 녹 디 메 틸 sulfoxide (DMSO) 다음 천천히 녹는 남아 PBS에 추가. 아미노산 순서에 따라 DMSO의 양을 증가 해야 합니다.
    4. Renature H-2 Kb: 펩 티 드와 서. 펩 티 드의 직후가지고 솔루션 pH 7.4의 renaturation 버퍼를 추가 하 여. 4 ° c.에서 48 h에 대 한 품 어 중화 솔루션을 허용
    5. 집중 하 고 펩 티 드 로드 H-2 Kb 세척: Ig. 50 kDa 분자량 컷오프 (MWCO), 원심 집중 장치를 사용 하는 펩 티 드 로드 H-2 Kb를 씻어 제조업체의 지시에 따라: Ig 솔루션 3 회 PBS를 가진 집중 1 mg/mL 이상 그리고 계량 한 분 광 광도 계에 집중.
  2. 활성 H로 펩 티 드 순서의 로드-2Db:Ig.
    1. 필요한 버퍼를 준비 합니다. 이온된 수에 131 m m 구 연산, 150 m NaCl, m 및 124 밀리미터 나2HPO4 의 솔루션을 만드는 다음 6.5에 pH를 조정 하 여 변성 버퍼를 준비 합니다. 이온된 수에 120 mM Tris HCl의 솔루션을 만드는 8.8에 pH를 조정 하 여 renaturation 버퍼를 준비 합니다.
      참고: 일반적으로, 그것은 필요 합니다 약 5 mL renaturation 버퍼의 1 mL 및 변성 버퍼의 H의 1 밀리 그램-2Db:Ig.
    2. H 변성-향상 된 펩 티 드 바인딩 수 있도록 2Db:Ig. H를가지고-2Db:Ig 농도 0.5-2의 최종 농도를 mg/mL PBS와 함께. 그런 다음 희석 H-2Db:Ig 변성 버퍼의 5-10 볼륨 해당 100-200 µ g/mL의 최종 농도에.
    3. 펩 티 드의 50 어 금 니 과잉 추가 순서 (보통 주식 펩타이드 보관-80 ° C에서 1 m m) H-2Db:Ig 솔루션 1 h 37 ° c.에 대 한 알을 품을 수 있도록
    4. Β2 microglobulin와 renature H 추가-펩 티 드와 2Db:Ig. Β2 microglobulin의 2-fold 어 금 니 과잉을 추가 합니다. 그런 다음 renaturation 버퍼를 추가 하 여 7.4의 pH에 솔루션을가지고. 4 ° c.에 24 h에 대 한 품 어 중화 솔루션을 허용
    5. 집중 하 고 펩 티 드 로드 H 세척-2Db:Ig. 50 kDa MWCO, 원심 집중 장치를 사용 하는 펩 티 드 로드 H-2 Kb 씻어 제조업체의 지시에 따라: Ig 솔루션 3 회 PBS, 1 mg/mL 이상에 집중 하 고 계량은 농도 분 광 광도 계에.

2. MHC 펩 티 드 복합물 및 자성 나노 입자의 표면에 Co-Stimulatory 분자 나노 인공 항 원 제시 세포를 켤레. 입자 크기 및 응용 프로그램에 따라 세 가지 방법 중 하나를 사용 합니다.

참고: 다른 기술의 수 입자의 표면에 단백질을 단백 결합을 사용할 수 있습니다. 3 별도 접근 본, 설명: 아민 코팅 입자 (단계 2.1), N-hydroxysuccinimide (NHS)-코팅된 입자 (단계 2.2)와 반대로 biotin 코팅 입자 (2.3 단계). 이러한 프로세스 두 논문 출판된6,7의 방법 섹션에서 자세히 설명도 있다. 재고 aAPC 입자의 불 임을 유지 하기 위해 살 균 솔루션 biosafety 증기 두건에서 모든 단계를 수행 합니다.

  1. 항 원 특정 물질로 신호 아민 코팅 자석 입자 (그림 2)에 코트. 이 과정은 100에 대 한 설명 nm, 아민 코팅 superparamagnetic 나노 입자.
    참고: 아민 코팅된 입자의 표면에 항 체를 연결에 대 한 자세한 프로토콜에서 찾을 수 있습니다 https://www.micromod.de/en/technotes-2.html, Technote 201 어떻게 thiolate에 항 체 및 maleimide 공액 functionalize 설명 합니다. 입자와 202 maleimide 기능 그룹과 아민 코팅 입자를 functionalize 하는 데 필요한 프로세스를 설명 합니다. 여기 약간의 수정만 MHC Ig 및이 입자에 연결 된 co-stimulatory 신호에 대 한 강조 표시 됩니다.
    1. Thiolate Traut의 시 약 (Technote 201)와 항 체.
      1. PBS-ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 버퍼 (0.1 m M PBS 및 100 mM EDTA) x 10을 준비 합니다. 1시 10분에서 항 체를 PBS-EDTA 버퍼 x 10을 추가 항 체에 추가 하는 무료 thiols의 산화를 방지 하기 위해 비율.
      2. 20 어 금 니 과잉 Traut의 시 약 (2-iminothiolane)의 항 체를 추가 하 고 혼합과 실 온에서 2 h에 품 어. Thiol 그룹에 아민 그룹을 변환 하기 때문에 호흡을 피하기 위해 화학 증기 두건 내 Traut의 시 약 (건조 분말)을 측정 합니다.
      3. 3 회 원심 집중 장치를 사용 하 여 50 kDa MWCO와 함께 PBS-EDTA 버퍼 x 1와 철저 하 게 세척 하 고 사용 하 여 항 체 솔루션의 농도 측정 하는 500 µ L. 마지막 볼륨까지 집중 제조업체의 지시에 따라 한 분 광 광도 계입니다.
    2. 마그네틱 나노에 아민 기능적인 그룹 maleimide 그룹 sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)를 사용 하 여 변환 cyclohexane-1-카복실산 (Sulfo SMCC, Technote 202).
      1. 1시 10분에 PBS-EDTA 버퍼 x 10 항 체에 추가 입자에 비율.
      2. 1 mg/mL의 농도에서 resuspend에 이온된 수와 소용돌이 Sulfo SMCC 디졸브. Maleimide 그룹에 아민 그룹을 변환 하기 때문에 호흡을 피하기 위해 화학 증기 두건 내 Sulfo SMCC (건조 분말)을 측정 합니다.
      3. 0.016 nmol 모든 평방 밀리미터의 표면적은 입자의 Sulfo SMCC 솔루션을 추가 합니다. 100 nm 입자의 1 밀리 그램, 0.3 mg Sulfo SMCC의 사용 하 여. 실 온에서 1.5 h에 대 한 반응을 수 있습니다.
      4. PBS-EDTA 버퍼 3 번 사용 하 여 자기장 자석 열 x 1와 입자를 세척 하 고 PBS-EDTA 버퍼 x 1의 500 µ L에서 resuspend.
        참고: 200 보다 작은 입자를 사용 하는 경우 nm, 같은 100 nm 입자 여기에서 설명한 가장 가능성이 영구 자석 되지 것입니다 세척 하거나 집중 목적에 대 한 입자를 충분히 강력. 따라서, 작은 입자를 씻어 자기장을 증폭 하는 자기 열 강자성 분야의 구성을 사용 합니다.
    3. Thiolated 항 체 (Technote 201)와 maleimide 기능성된 입자 반응.
      1. 유리 섬광 유리병에 입자를 추가, 미니 자석 볶음 바 추가, 그냥 자기 볶음 판 위에 인치 놓고 자석 입자 솔루션의 혼합을 유도 합니다.
      2. 혼합 솔루션에 dropwise thiolated 항 체 (입자의 모든 1 밀리 그램에 대 한 항 체의 0.5 밀리 그램)를 추가 합니다. 하룻밤 실 온에서 반응 수 있습니다.
      3. 1 x PBS 버퍼 3 번 자기장을 사용 하 여 세척 하 고 1x PBS의 500 µ L에서 resuspend. 레이블을 지정 하 고 최대 6 개월까지 4 ° C에서 저장.
        참고: 최대 활용 효율 maleimide 기능성된 입자는 즉시 thiolated 단백질 섞일 때 발생 합니다.
  2. NHS 코팅 자석 입자 (그림 3)에 항 원 특정 및 물질로 신호 코트. 이 프로세스는 200에 대 한 설명 nm, NHS 코팅 superparamagnetic 나노 입자.
    1. 물의 resuspension 버퍼, 냉각 버퍼 및 스토리지 버퍼를 준비 합니다. 물의 resuspension 버퍼는 25 m m 2-(N-morpholino) 트윈 20 pH 6.0에 조정 0.01 %ethanesulfonic 산 (MES). 냉각 버퍼 pH 7.4에 Tris HCl의 100mm 솔루션입니다. 저장소 버퍼 10 mM PBS 및 0.01%의 솔루션은 pH 7.4에 트윈.
    2. 물의 resuspension 버퍼의 1 mL에 동결 건조 된 입자를 resuspend. 아무 집계는 표시 될 때까지 적어도 15 분 동안 적극적으로 소용돌이.
    3. 마그네틱 스탠드는 상쾌한 제거, 물의 resuspension 버퍼 및 유리 섬광 유리병에 0.5 mL와 함께 resuspend에 자석 입자를 놓습니다. 와 동 아니 집계는 표시 될 때까지
    4. Resuspended 입자의 1 밀리 그램 당 총 단백질의 0.1 밀리 그램을 추가 합니다. 혼합 하 고 혼합 하는 동안 2.5 h에 대 한 실 온에서 반응 소용돌이.
    5. 냉각 하는 버퍼의 0.1 mL를 추가 하 고 혼합 하는 동안 30 분 동안 실내 온도에 반응.
    6. 마그네틱 스탠드에 섬광 유리병을 놓고 입자를 세척 합니다. 상쾌한 명확 하 게 제거 될 때까지 기다립니다. 마그네틱 스탠드에서 입자를 제거, 아무 집계는 표시 될 때까지 물의 resuspension 버퍼 및 소용돌이의 1 mL를 추가 합니다. 이 과정을 세 번 반복 하 고 물의 resuspension 버퍼의 1 mL에 입자를 resuspend. 최대 6 개월까지 4 ° C에서 입자를 저장 합니다.
  3. 항 원 특정 물질로 신호 안티 biotin 코팅 자석 입자 (그림 4)에 코트. 이 과정은 50-100 nm, 안티 비오 superparamagnetic 나노 입자에 대 한 설명 합니다.
    1. Biotinylate MHC-Ig 또는 co-stimulatory 분자입니다.
      1. 0.5-2 단백질 농도 조정 mg/mL PBS 버퍼에서. 이온된 수에 10 mg/mL의 농도에서 sulfo NHS-비오 틴을 resuspend와 20-fold 어 금 니를 물질로 초과 항 체를 추가 합니다. 45 분 동안 실 온에서 품 어.
      2. 50 kDa MWCO, 원심 집중 장치를 사용 하 여 시간 PBS 3를 철저 하 게 세척 500 µ L의 최종 볼륨을 분 광 광도 계를 사용 하 여 항 체 용액의 농도 측정 될 때까지 집중 하는 제조 업체의 지시를 따릅니다.
    2. 어원이 biotinylated MHC-Ig 및 안티 biotin 나노 co-stimulatory 신호. 재고 안티 biotin 입자의 500 µ L, 0.5 nmol 물질로 항 체의 추가 및 하룻밤 4 ° C에서 품 어.
    3. 활용된 aAPC 나노 워시. 이러한 입자는 200 보다 작은 있기 때문에, 자기 열 젖은 및 마그네틱 스탠드에 넣어.
    4. 열에 입자/단백질 정지를 추가 합니다. 모든 단백질/입자를 완전히 열을 입력을 허용 합니다.
    5. 열 세 번 PBS의 0.5 mL를 추가 하 여 세척.
    6. 마그네틱 스탠드에서 열을 제거, 열, PBS의 0.5 mL을 추가 하 고 expulse 유리 섬광 유리병에 입자 aAPCs 플런저를 사용 하 여 여 elute. 최대 6 개월까지 4 ° C에서 입자를 저장 합니다.
      참고: 입자는 최대 6 개월 (냉동 하지 한다) 4 ° C에서 안정적입니다. 더 높은 온도 입자의 기능을 감소 하 고 일부 입자 집계 (데이터 표시 되지 않음) 관찰 되었습니다. 보관 하지 마십시오 실 온에서 시간의 연장된 기간에 대 한로이 크게 입자의 수명 감소.

3. 인공 항 원 제시 세포 나노 입자 형광 항 체 탐지를 사용 하 여에 단백질 콘텐츠 특징.

참고: 이것은 유용한 품질 관리 생산된 인공 항 원 제시 세포 의입니다. 또한, 물질로 신호 금액 일괄 처리 및 각종 aAPC 동등한 aAPC 복용량을 생산에 사용 됩니다 (예., 다른 크기).

  1. 코팅된 aAPCs의 입자 농도 측정 합니다.
    1. 재고 솔루션에서 결합형된 입자를 사용 하 고 잘 당 100 µ L 96 잘 플랫 조직 문화 접시에 걸쳐 PBS의 솔루션에서 1:2 복용량 적정을 확인.
    2. 405에서 접시-독서 분 광 광도 계에 입자를 읽고 nm 알려진된 입자 농도를 표준 곡선을 만들기.
    3. 활용된 aAPCs의 샘플을 받아, 100 µ L의 총 볼륨 PBS에 희석 하 고는 분 광 광도 계에 읽기.
  2. 조작된 aAPCs의 샘플을 제거 하 고 형광 항 체와 얼룩.
    1. 제거 하려면 얼마나 많은 샘플을 계산 하려면 입자 표면에 항 체의 수를 견적 한다.
      참고: 이러한 기술을 입자 표면적의 약 1000 항 체 / µ m2 의 밀도 가정 합니다. 형광 검출 하 수, 약 1011 MHC-Ig 또는 CD28 분자 형광 테스트 당 총 필요 합니다.
    2. PBS에서 100 µ L까지 aAPCs의 총 볼륨을가지고, 1: 100 희석에 착 항 체를 추가 하 고 1 h 4 ° c.에 품 어
      참고: 성공적으로 사용 하는 예 항 체는 FITC 활용 된 쥐-반대로 마우스 Ig λ1, λ2, λ3 경 쇄, MHC-Ig, 그리고 아르메니아/시리아 햄스터 IgG, 안티 FITC 활용된 마우스 복제 G192-1, 반대로 마우스 CD28 감지 감지 R26 46 복제.
  3. 입자를 세척 하 고 형광 플레이트 리더에 형광을 읽고.
    1. 자석으로 (2 단계에서에서 설명)로 얼룩진된 aAPC 분수 0.5 mL의 PBS로 세 번 세척.
    2. 0.5 mL의 PBS로 세척된 aAPCs elute
    3. 읽기 단계 3.1에서 흡 광도 사용 하 여 농도를 96 잘 플랫 플레이트에 eluted aAPCs의 100 µ L를 추가 합니다.
    4. 나머지 400 µ L를가지고, 두 200 µ L aliquots로 분할 하 고 검정, 폴리스 티 렌 96-글쎄, 플랫 플레이트에서 두 개의 우물을 추가 합니다. 솔루션의 100 µ L를 복용 하 고 각 PBS의 100 µ L 적어도 4 시간을가지고 다음 잘 혼합 하 여 접시를 1:2 비율로 적정.
      참고: 평균 여러 측정에서 소음을 줄이기 위해 측정의 복제 합니다.
    5. 같은 검은 96 잘 접시에서 PBS의 적어도 12 우물 1:2 비율로 아래로 넣는 200 µ L로 잘에서 1: 200에 그것을 추가 하 여, 얼룩 하는 데 사용 하는 형광 항 체의 표준 곡선을 확인 합니다.
    6. AAPC 및 형광 성 항 체는 접시에 후 형광 플레이트 리더와 함께 접시를 읽으십시오.
  4. 입자 당 단백질의 양을 계산 합니다. 항 체 농도 알려져 있는 표준 곡선 값을 비교 하 여 항 체의 농도 결정, 항 체를 감지 하 항 체 얼룩이 지기의 1:1 비율을 가정 합니다. 다음 흡 광도 분석 결과 의해 결정 입자의 농도와 검색 된 항 체의이 농도 분할 하는 것은 입자 당 항 체의 수를 줄 것 이다.

4. 준비 된 나노 인공 항 원 제시 세포와 항 원 특정 CD8 + T 세포를 풍부 하 게.

  1. CD8 + T 세포를 격리 합니다.
    1. 뒤에 자 궁 경부 전위 isoflurane에 노출에 의해 동물을 안락사.
    2. Wildtype C57BL/6j 생쥐에서 비장 및 림프절을 제거 하 고 PBS의 해결책에. 장기를 macerate 하 고 PBS의 빈번한 세척과 살 균 70 µ m 셀 거르는 통해 셀을 elute.
    3. 비-CD8 + T 세포를 제거 하려면 자동 CD8 + T 세포 격리 키트를 사용 하 고 제조업체의 지침을 따르십시오.
      참고: 각 항 조건 적어도 3 x 106 CD8 + T 세포를 요구 한다.
  2. CD8 + T 세포에 바인딩할 나노 aAPCs를 추가 합니다.
    1. 절연, 다음 0.5% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)와 2 mM EDTA는 PBS에서 100 µ L의 볼륨에 집중 한다.
    2. 수를 결정 1011 aAPC 바인딩된의 비율에 따라 계산 하 여 추가 하는 aAPCs의 펩 티 드-로드 MHC-Ig 모든 106 CD8 + T 세포에 대 한.
    3. 품 어 aAPC 입자 및 지속적인 살 균 5 mL 폴리스 티 렌에서 혼합으로 4 ° C에서 1 시간에 대 한 CD8 + T 세포 라운드 하단 튜브.
  3. 보충된 미디어와 elute 문화 CD8 + T 세포를 T 세포 성장 인자 (TCGF)를 준비 합니다.
    1. 보충된 미디어에 대 한 비 본질적인 아미노산, 1mm 나트륨 pyruvate, 비타민 솔루션, 92 µ M 2-mercaptoethanol, 10 µ M ciprofloxacin 및 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) x 0.4 x 1 (글루타민)와 완전 한 RPMI 1640 미디어를 보충.
    2. TCGF을 하려면 프로토콜 이미 설립 하 고 참조 여기9를 수행 합니다.
      참고: TCGF는 성장 하는 데 필요한 추가 자극 신호를 제공 하는 T 세포에 필수적인 인간의 면역 cytokines의 사내 칵테일. TCGF 알려진된 T 세포 stimulatory cytokines 일리노이-2, 등에 대 한 교환 될 수 있었다 일리노이-7, 또는 IL-15; 그러나, 각각 그에 따라 T 세포 응답을 극 수 있습니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 이러한 칵테일; 최적화 하지 따라서 다른 기술 농도 대 한 상담을 해야 하 고 조합 TCGF 예제와 함께 사용 하지 않으면 나열10,11.
  4. 워시와 aAPC와 CD8 + T 세포 혼합물을 풍성 하 게.
    1. 2 단계에서에서 설명한 대로 자석 입자 aAPCs 워시. 그러나, 0.5 %BSA 2 mM EDTA와 PBS 버퍼를 사용 하 여 먼저 씻고, 미디어, 보완 사용 하 여 두 번째 및 세 번째를 사용 하 여 보충 1% 미디어 TCGF.
    2. AAPCs 및 1% 보충된 미디어의 500 µ L의 농축된 CD8 + T 세포 들을 elute TCGF.
    3. 1% 보충된 미디어의 당 160 µ L에서 96 U 바닥 접시에 hemocytometer 및 격판덮개를 사용 하 여 셀 2.5 x 105 CD8 + T 세포/mL의 농도에서 TCGF.
    4. AAPCs와를 사용 하 여 분리 하는 경우만 펩타이드-MHC-Ig에 로드 표면 (co-stimulatory 신호 없음), 다음 완전 한 단계 4.5. AAPCs를 사용 하 여 두 펩 티 드 로드 MHC-Ig 표면 및 co-stimulatory 신호를 분리 하는 경우 다음 5 단계로 진행 합니다.
  5. Co-stimulatory 신호 농축된 분수를 표면에 코팅 하는 자기 입자를 추가 하 고 T 세포의 표면에 물질로 신호를 공동 클러스터를 자기 필드 추가.
    1. 농축된 분수 추가 아데닌 (또는 제어 aAPC 속성에 대 한 응용 프로그램 참조 섹션에 따라 큰) 물질로 항 체 펩 티 드 로드 MHC-Ig에는 입자의 수의.
    2. Co-stimulatory 마그네틱 입자 1 h 4 ° c.에 대 한 풍부한 CD8 + T 세포에 바인딩할 허용
    3. 1.9 cm (0.75 인치) 길이에서 두 N52 네오디뮴 디스크 자석 사이 문화 접시를 두어서 자기 필드를 추가 합니다.
      참고: 디스크 자석 N52 매우 강력한 필드가 있다. 한다 주의 둘 다 다른 제거 하기 어렵다 그리고 문화 접시에 그들을 퍼 팅 때 자석, 사이 스페이서가 그들을 저장 합니다. 최소화 하기 위해 인큐베이터의 금속 부품에 집착 자석, 50 mL 원뿔 튜브 스티로폼 용기 하단에 상단에에서 넣어.

5. 확장 하 고 준비 된 나노 인공 항 원 제시 세포와 항 원 특정 CD8 + T 세포를 감지.

  1. 습도 5%에서 96 U 바닥 잘 플레이트 aAPCs와 CD8 + T 세포를 추가 CO2, 3 일 동안 37 ° C 배양 기. 3 일에 피드 80 µ L 셀 당 2 %TCGF 장소 보충된 미디어의 인큐베이터에 다시 7 일까.
  2. 7 일에 계산에 대 한 하단 튜브 라운드 5 mL로 자극된 세포를 수확.
  3. 모두 한 번은 솔루션의 수확은, 0.05% 나트륨 아 지 드와 2 %0.5 ml PBS의 resuspend 수확된 셀 아래로 회전 FBS. Trypan 파랑으로 얼룩이 지 고는 hemocytometer에 의해 실행 가능한 세포를 계산.
  4. 항 원 특정 얼룩에 대 한 하단 튜브 라운드 두 개의 새로운 5 mL로 50000-500000 계산된 셀을 제거 합니다. 한 튜브 동족 펩 티 드 MHC 얼룩 사용 됩니다 그리고 다른 튜브 배경 얼룩 결정 하 비 동계어 얼룩에 사용 됩니다.
  5. 각 동계어를 비 동계어 튜브 100 µ L PBS의 0.05% 나트륨 아 지 드와 2%에서에서 1 µ g biotinylated MHC-Ig (를 사용 하 여 2 단계에서에서 설명 하는 기술)의 추가 allophycocyanin (APC)와 FBS-활용된 쥐 반대로 마우스 CD8a, 53-6.7 (희석 비율의 복제 1: 100) 1 h 4 ° c.에 대 한
  6. 보조 streptavidin 추가 하 고 살고 죽은 얼룩. 원심 분리를 통해 초과 biotinylated MHC-Ig PBS로 세척 한다. 다음 얼룩 1:350 비율 phycoerythrin (PE)의 모든 샘플-4 ° c.에서 15 분에 대 한 라이브/죽은 고칠 수 녹색 죽은 세포 얼룩 streptavidin 1:1000 비율을 표시
  7. 읽기 특이성 항 원 특정 셀의 수를 결정 하는 흐름 cytometer에서 모든 샘플.
    1. 초과 2 차 세척 및 라이브/죽은 원심 분리에 의해 얼룩 PBS 버퍼 0.05% 나트륨 아 지 드와 2%의 150 µ L 함께 resuspend FBS 교류 cytometer에서 읽을.
  8. 수와 데이터 분석 소프트웨어와 항 원 특정 세포의 %를 확인 합니다.
    1. 항 원 특정 세포의 %를 확인 하려면 해당 순서 라이브 +, 림프 구 + (앞으로 분산형 사이드 분산형에 의해), CD8 +와 이합체 +에 다음 문을 사용 합니다. 비-동족 얼룩을 동계어를 비교 하 여 이합체 + 게이트를 확인 합니다.
    2. 이합체 + 비 동계어 MHC-Ig 얼룩에서 동족 MHC-Ig 얼룩의 비율을 빼서 샘플에 항 원 특정 셀의 비율을 결정 합니다.
    3. 항 원 특정 셀의이 백분율을 사용 하 여, 농축 및 확장에서 항 원 특정 셀 결과의 수를 양보, 셀의 수에 의해 그것을 곱하면 됩니다.
      참고: 보정 설정 흐름 cytometer에 있기 때문에이 패널에 사용 된 fluorophores와 스펙트럼 중복 해야 합니다.

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결과

성공적인 농축 및 항 원 특정 T 세포의 확장을 완료 하려면 로드 펩 티 드 MHC-Ig와 co-stimulatory 분자 해야 성공적으로 연결할 수 aAPC 입자. 입자 부착의 3 방법에 따라, 우리 성공적 활용 절차 결과 (그림 5a)에 대 한 몇 가지 대표적인 데이터를 제공 합니다. 실제로, ligand 밀도가 너무 낮은 경우 다음 되지 것입니다이 선형 간격 100 ligands 주위에 발생 하는 항 원 특정 CD8 + T 세포의 효과적인 자극 우리의 경험 (그림 5b)7nm.

외 양적 형광 항 체 정보 및 유전자 변형 CD8 + T 세포 확장, 나노 aAPCs 동족 유전자 변형 항 원 특정 CD8 + T 세포...

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토론

우리는 새로운 항 원 특정 T 세포 격리 기술 나노 인공 항 원 제시 세포 (aAPCs)에 기반을 만들었습니다. 나노 aAPCs 펩 티 드-로드 MHC T 세포 항 원 특정 바인딩 및 co-stimulatory 활성화 함께 활성화를 허용 하는 표면에 합니다. aAPCs 상자성, 있으며 따라서 자기장을 사용 하 여 희귀 한 항 원 특정 T 세포를 풍부 하 게 사용할 수 있습니다. 우리는 최적화 하 고 주요 나노 크기, ligand 밀도, 그리고 ligand 선택과 바인딩, 농축, 활성화 및 셀-농축 (보충 파일 1-상자 1)에 대 한 영향의 속성을 공부.

따라서, 몇몇의 항 원 특정 CD8 + T 세포 확장에 농축 및 확장 프로시저 결과 thousand-fold 항 원 특정 비율 60% 높은 생산 고, 모두 인간과 murine 설정 (보조 파일 2-상자 2에서 에서 사용할 수 있습니다. ). 이러한 높은 숫자와 비율 항 ...

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공개 사항

저자 선언 다음 경쟁 금융 interest(s): NexImmune와 존스 홉킨스 대학 간의 라이선스 계약, 조나단 Schneck 대학이에 설명 된 제품의 판매에 의해 받은 로열티의 공유를 받을 권리가 있다 기사입니다. 그는 또한 NexImmune의 설립자 고 회사에서 주식을 소유 하 고. 그는 NexImmune의 이사회, 과학 자문 위원회의 회원으로 서 제공합니다. 이러한 준비의 용어를 검토 하 고 상충 정책에 따라 존스 홉킨스 대학에 의해 승인 되었습니다.

감사의 글

J.W.H.는 NanoBioTechnology, 국립 과학 재단 대학원 연구 친교 (DGE-1232825), 및 장학금 지원에 대 한 호 재단에 대 한 존스 홉킨스 연구소에서 NIH 암 나노기술 교육 센터를 감사합니다. 이 작품에서 건강의 국가 학회 (P01-AI072677, R01-CA108835, R21-CA185819), TEDCO/메릴랜드 혁신 이니셔티브, Coulter 재단 (JPS) 지원에 의해 투자 되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
DimerX I: 재조합 용해성 이합체 인간 HLA-A2:Ig 융합 단백질BD Biosciences551263
DimerX I: 재조합 용해성 이합체 마우스 H-2D[b]:IgBD Biosciences551323
DimerX I: 재조합 용해성 이합체 마우스 H-2K[b]:Ig Fusion ProteinBD Biosciences550750
Vivaspin 20 MWCO 50 000GE Life Sciences28932362
Vivaspin 2 MWCO 50 000GE 생명 과학28932257
정제 된 인간 베타 2 마이크로 글로불린바이오 라드PHP135
nanomag-d-spio, NH2, 100 nm 나노 입자Micromod79-01-102
Super Mag NHS 활성 비드, 0.2 µ m오션 나노텍SN0200 
Anti-Biotin MicroBeads UltraPureMiltenyi130-105-637
EZ-Link NHS-BiotinThermoFisher20217
Sulfo-SMCC Crosslinker ProteoChemc1109-100mg
2-Iminothiolane hydrochlorideSigma-AldrichI6256 Sigma 
96 웰 절반 면적 마이크로 플레이트, 검은 폴리스티렌Corning3875
FITC 쥐 안티 마우스 Ig, λ 1, &람다; 2, & &람다; 3 라이트 체인  복제   R26-46   BD Biosciences553434
FITC 마우스 안티-아르메니아 및 시리아 햄스터 IgG  복제   G192-1BD 생명과학554026
B6. Cg-Thy1a/Cy Tg(TcraTcrb)8Rest/J(형질전환 PMEL) 마우스Jackson Laboratory005023
C57BL/6J(B6 와일드타입) 마우스Jackson Laboratory000664
CD8a+ T 세포 분리 키트, 마우스Miltenyi130-104-075
MS 열Miltenyi130-042-201
Streptavidin-Phycoerythrin, SAv-PEBiolegend405203
N52 디스크 자석 0.75 인치 케이& J MagneticsDX8C-N52
APC 안티-마우스 CD8a 항체, 클론 53-6.7Biolegend100711
LIVE/DEAD 고정 가능한 녹색 데드 셀 스테인 키트, 488 nm 흥분용 써모피셔L-34969
LS 열 Miltenyi 130-042-401

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