재현할 수 dsRNA Microinjection 및 산란 검정 집 파리 모기에

성인 dipterans에 작은 생체, 핵 산 등을 제공 하는 Culicidae와 Muscidae에도 전하실을 입증 했다. 불 임 (때 독점적으로 유전자를 대상으로 성인의 고환에 표현)과 사망률 (때 대상 SNF7 및 스테로이드 수용 체 coactivator) 애벌레 Aedes aegypti생산 dsRNAs의 구두 글귀 보고 되었습니다^1,2 . 사망률 또한 애벌레 파리 자리 부채에 HSP70을 대상으로 관찰 되었습니다³. 그러나 이러한 phenotypic 효과,, 하지 설탕 식사^4,5성인 Ae aegypti dsRNA 먹이 후 이어지고 있다.

Microinjection 때 병원 체 또는 핵 산, 그로 인하여 유도 하는 조직의 반응^{5,6,,78,9,10 소개는 midgut를 우회 하는 데 사용 되었습니다.} . 몇몇 microinjection 기술은 존재 한다, 자동된 볼륨 배달 2.3 최저 허용 하는 마이크로프로세서 제어 인젝터 분사 볼륨의 시각적 측정을 필요로 하는 사내 생산된 기구에서 배열 하는 장비와 관련 된 nL ^{5 , 9 , 10 , 11}. ribosomal mRNAs를 표적으로 하는 RNA 간섭 (RNAi) 트리거 절지동물 소 틱 Rhipicephalus microplus, 다양 한와 Culex pipiens, Aedes aegypti 모기 난소 개발 중단 그리고는 집에서 파리 파리 자리 부채^5,9,,1213. 이러한 연구에서 산란의 장애 모니터링 종료 또는 자손의 표현 형 명단 수도는 접종의 효능을 결정 하기 위한 필수적 이었다. 이것은 같은 Wolbachia-비 전통적인 biocontrol 방법의 많은 것에서 중요 하 고 원하는 효과 남성 소개 (성적 비호 환성) 감염 및 RNAi 유도 무 균^{5은 대가족제 치명적인 표현 형의 형태 ,,914}. 사망률과 통치를 추적 하는 것은 특성화 및 매우 구체적인 biorationals (자연적 사건 병원 체 그리고/또한 자연 파생 상품)¹⁵의 개발 필요.

이 프로토콜 제공 성인 모기와 집 파리;에 대 한 자세한 microinjection 기술 종종 잘 문학에서 설명 하는 프로세스입니다. 또한, 산란 검정 방법론 성인 dipterans에 dsRNA 효과 적절 하 게 평가 하는 설명 합니다. 이러한 프로토콜 Aedes aegypti 및 파리 자리 부채 를 위해 특별히 개발 되었다 그러나 다른 종에 대 한 수정할 수 있습니다.

1. 곤충 준비

1. 몇 시간 동안 또는 CO₂ 를 2 분 노출 4 ° C에서 그들을 재미을 누른 다음 주사 전에 4 ° C에서 모기를 anesthetize. 감기 주사 전에 h 4 ° C 2\u20123에서 파리 anesthetize. 모기와 파리는 성관계를 산란 응답 변수 인지 확인 하십시오.
   참고: 모기 anesthetization 메서드는 종 및 변형에 따라 다릅니다, 그리고 예를 들어, Culex Aedes aegypti 보다 차가운 anesthetization에서 훨씬 빨리 복구 및 따라서 CO₂ 최저 바람직합니다.
2. 얼음, 신중 하 게 단계 모기 또는 파리 ventrally 그들을 부드러운 집게를 사용 하 여 노출 현미경 슬라이드 ~0.5 c m 간격에. 표준 슬라이드 6 모기의 두 행을 저장할 수 또는 6-7 집 파리. 모기 또는 슬라이드 처리를 돕기 위해 파리의 명확한 슬라이드의 왼쪽 이나 오른쪽 끝에 1-1.5 c m의 공간을 남겨 주세요.
3. 주입에 대 한 준비까지 큰 접시에 4 ° C에서 준비 된 곤충의 슬라이드를 계속.
   참고: Petri 접시 뚜껑을 통해 구멍을 드릴 때 상한 공기 변위에 의해 방해 되 고에서 곤충을 방지 도움이 됩니다. 몇 접시 바닥에 확보 유리 모 세관에 슬라이드 배치 페 트리 접시에서 제거를 쉽게 것입니다.

2. 곤충 주입

1. Estep 외 에 설명 된 대로 dsRNA를 준비 ⁵ 와 Sanscrainte 외. ⁹. 만약, 오염 물질의 무료 dsRNA 수 측정할 수 260 nm로₂₆₀ × 희석 비율 × 40 μ g/mL에서 계산 RNA 농도에서 흡 광도 측정 하는 분 광 광도 계를 사용 하 여.
2. 진정 표 또는 얕은 얼음 양동이 현미경 및 microinjector를 해 부 하도록 설정 냉 취 모기와 파리 (1.1-1.3 단계 및 그림 1참조)에 주사를 수행.
3. 유리 모 세관 바늘 끌어당기는 사람와 좋은 팁을 당겨 (설정: 히터 = 15 단위, 솔레노이드 = 4 A).
   주: 제조업체의 세부 사항에 대 한 재료의 표를 참조 하십시오.
4. 모 세관 바늘을 날카로운 포인트를 생산 하는 집게의 쌍을 곤란 하 게 하 여 제조업체의 지침과 휴식 바늘 팁에 의하여 microinjector에 넣으십시오.
   참고: 제안된 바늘 오프닝 크기는 모기에 대 한 ~ 150 µ m 및 집 파리에 대 한 ~ 250 µ m입니다.
5. 원하는 배달 볼륨에 대 한 microinjector를 설정 합니다. ~ 50 nL aliquots에서 초승달 모양 움직임은 쉽게 관찰 하 고 모기 microinjections에 대 한 권장. 가능한 경우, 빠른 주입 설정 가능 작성 및 추방 nuclease 무료 물 3 번 바늘을 씻어.
6. 주입 농도 100\u2012150 nL 모기에 대 한 원하는 복용량 그리고 500 nL 제공할 것입니다 같은 제공에 원하는 집 파리에 대 한 복용량에 대 한 솔루션을 준비 합니다.
   참고: 제안 초기 복용량: 1 µ g 대는 각 모기 및 각 집 파리^5,95 µ g.
7. 선택적으로 모기, Rhodamine B (시각화에 도움) 3.0 µ g/mL의 최종 농도에 솔루션을 추가 합니다.
   참고: 염료 복 부/가슴 교차로에서 복 부 표면에 거의 분명 표 피를 통해 주입 후의 핑크 색상으로 명확 하 게 표시 됩니다.
8. 하 주사 (파라핀 필름의 조각) 등 깨끗 한 표면에 유리 바늘으로 공기에서 빠는 없이 솔루션의 3-4 µ L 플라스틱 액체는 바늘에서 분배 하 여 섬세 한 작업와이 퍼와 물방울을 닦아 부드럽게 시작 될 때까지 반복 해 서 넣기 버튼을 눌러.
   참고: microinjectors의 일부 모델 필요 하지만 백필 주사기, 인젝터 재료의 테이블에서 에서 참조 하지 않습니다.
9. 울트라 벌금 포인트 마커를 사용 하 여 해시 마크 ~ 1 mm 떨어져 시작 액체 초승달 모양에서 바늘 칼을 그립니다. 이 초승달 모양 움직임을 시각화에 도움이 되며 솔루션은 주입 동안 모기를 입력 확인.
10. 진정 테이블 또는 얼음 (그림 1)에 바늘에서 모기 또는 파리 (로 단계 1.2-1.3에서에서 준비)의 슬라이드를 설정 합니다. 확인 현미경에서 그의 시야는 넓은 바늘에 솔루션 초승달을 볼 정도로.
11. 모기에 대 한 mesokatepisternum (그림 2A)의 중간 1/3로 바늘을 정렬 하 고 반대편에 배치 집게와 바늘에 대 한 모기를 보강 하는 동안 부드럽게 찌르는 바늘 팁 사용 하 여 표 피는 microinjector 마이크로 미터입니다.
12. 집 파리에 대 한 mesopleuron (그림 2B)와 바늘을 정렬 하 고 바늘에 대 한 비행을 보강 하면서 부드럽게 펑크 바늘 팁과 표 피.
13. 부드럽게 모기에 바늘을 슬라이드 또는 끝 중간 선 통과 될 때까지 신체를 비행.
    참고: 곤충에서 주입 된 액체 구슬에서 결과 수시로 너무 얕은 바늘을 삽입 (단계 2.15 참조).
14. 원하는 양의 액체 주입 되어 때까지 바늘에 액체 초승달의 움직임을 보면서, 넣기 버튼을 눌러. 모기에 대 한 경우 50.6 nL aliquots로 설정, ~ 100에 대 한 2 X를 눌러 nL 또는 3 배 ~ 150 nL. ~ 500 nL 주입 되어까지 넣기 버튼을 눌러 집 파리에 대 한 (즉, 69 nL aliquots와 7 X 483 눌러 nL).
15. 초승달 모양 이동 하지 않으면 천천히 모기 슬라이드 또는 초승달 모양 운동에 대 한 보고 하는 동안 바늘을 비행. 만약 주입된 솔루션 비즈 바늘 제거 또는 이동, 실패 하는 초승달 모양의 표 피에서의 부분 취소로 곤충이이 주입 실패 했다.
16. 10-15의 그룹에 성공적으로 삽입 된 모기 또는 3.5 온스 컵 개최를 취소 하는 5의 그룹에서 집 파리를 전송 합니다. 얇은 명주 그물 이나 그물을 커버 하 고 실내 온도에 복구.
17. 모기와 파리 (1-2 h) 회복, 후 10% 자당 해결책으로 흠뻑 목화 공을 통해 각 지주 컵을 반전.
    참고: 설탕 식사¹⁰에 쉽게 액세스를 제공 하 여 생존에 자당 면 에이즈 위에 컵의 반전
18. 단계 2.5 주입 솔루션 사이 바늘을 씻어. 완료 되 면 주입, 폐기 적절 한 sharps 용기에 바늘을 사용 합니다.

3. aedes aegypti 사망률과 산란 검정

1. 주사 후 3 일 동안 계속 10% 자당 모기 제공 가시 죽은 모기의 수를 기록.
2. (예: 콜라겐 소시지 케이싱) ≤12-인치 인공 막을 신선한 혈액 (즉, Aedes aegypti소)과 뜨거운 물 목욕에서 60 ° C에 열을 채우십시오.
3. 짧게 막 종이 타월에 압 연 하 여 건조 하 고 3.5 온스 투명 컵을 들고의 얇은 명주 그물 모자에 걸쳐 누워. 을 강화 하기 위해 먹이 phagostimulant 또는 핸들 케이스 표면에 인간의 휘발성을 떠나 깨끗 한 맨 손으로 따뜻하게 혈액 소시지를가 열 후 혈액 1 m m ATP 스파이크.
4. 혈액 공급, 후 10% 자당 지주 컵 위에 적셔 목화 공을 교체 하 고 모기 산란 컵을 전송 하기 전에 ~ 24 h 동안 휴식을 허용.
5. 작성 하 여 건설 산란 컵 취소 ~ 30 mL 이온된 H₂O와 씨앗 발 아 종이 조각을 배치 3.5 온스 검정 컵 (~ 4 c m 폭 및 5 cm 긴 능선 수직 실행) 측면 (그림 3A)에 대 한 컵의 아래쪽에 . 얇은 명주 그물 이나 그물을 커버 하 고 얇은 명주 그물 이나 그물 모자에 작은 슬릿 (~ 1 cm)를 잘라.
6. 24 시간 후 혈액 공급에서 작은 슬릿 (~ 1 cm) 지주 컵의 얇은 명주 그물 모자에 자르고 성공적으로 먹이 개별 여성 전송-복 부에 보이는 혈액 bolus로-산란 컵 (1 여성/산란 컵)으로 부드러운 입 포부에 의해. 10% 자당 포화 목화 공 함께 산란 모자에 작은 상처를 봉인.
7. 모기 완전히 일일 사망률을 추적 하는 동안 oviposit를 허용 하도록 5\u20127 일 ~ 27 ° C에서 컵을 개최. 해 범위에서 계란을 계산 합니다.

4. 파리 자리 부채 사망률과 산란 검정

1. 주사 후 3 일 동안 계속 10% 자당 파리 제공 가시 죽은 파리의 수를 기록.
2. 주입 후 3 일 짧게 모든 파리는 컵의 바닥에 움직이지 않는 때까지 들고 컵에 CO₂ 를 분배 하는 폴 리 에틸렌 튜브를 배치 하 여 파리를 anesthetize.
3. 깨끗 한 케이지 stockinette 소매 취재 열기 (10 cm, 그림 3B)와 4 L 플라스틱 용기 구성에 파리를 전송. 제공 된 파리 물 입자가 굵은 자당의 혼합물 우유, 가루 및 달걀 노 른 자는 8에 건조: 4 일간 (볼륨)에 의해 8:1 비율, 기록 하 고 죽은 제거 매일 날아.
4. 75% 밀 밀기 울 25% 수송과 가축 체중으로 사료와 혼합 하 여 신선한 비행 거리 애벌레 양육 매체에 대 한 마른 재료를 준비 합니다. (때까지 한 방울의 물 밖으로 겨우 압착 수) 62% 습기를 도달할 물을 추가 합니다.
5. 위의 신선한 애벌레 미디어의 1:1 혼합물에서 2.5 cm 직경 공 준비와 애벌레 중간 비행 "사용" (파리는 pupated 이전 매체). 검은 무명 천으로의 광장에 공을 랩, 중간 액체, 새 어 나온 때까지 가볍게 짠 다 다음 공 주위 장소에서 옷감을 고무 밴드를 사용 합니다.
6. 60 mL 컵에 볼을 넣고 5 h (그림 3B)에 대 한 비행 감 금 소에.
7. 산란 공을 달걀 린스를 계란 옷감의 주름에서 제거 되도록 합니다. 계란을 나누며 피펫으로 졸업된 20 mL 원심 분리기 튜브에 그들을 전송 하 고 클러스터를 흔들어.
8. 계란 정착 고 졸업된 튜브에 정착된 계란의 볼륨 때까지 기다립니다. 볼륨 최대 20 배 정착된 계란의 볼륨을가지고 충분 한 물을 추가 합니다. 기록 물 플러스 계란의 총 볼륨입니다.
9. 물과 계란 정지 자기 볶음 바 또는 활발 한 교 반 혼합 하는 동안 사용 1 mL 피펫으로 팁 (팁 잘라 끝) 라인의 일련에 사전 moistened 검은 헝겊 조각에 물과 달걀 현 탁 액의 0.5 mL를 분배 하. 계산 해 현미경 계란.
10. 단계 4.9 두 번 더 반복 합니다. 경우는 수 중 심각한 국외 자 (즉, 에 의해 다른 두 건의에서 다릅니다 > 35%), 4 수를 하 고 국외 자 무시.
11. 샘플 당 계란의 평균 수를 계산 하 고 2는 서 스 펜 션의 계란/mL 수로이 값을 곱하면. 단계 4.8에서에서 계란의 서 스 펜 션의 볼륨에 의해 얻은 달걀/mL 값을 곱하면 됩니다. 이것은 누워 계란의 총 수에 대 한 견적 이다.

모기에 dsRNA의 microinjection

이 microinjection 메서드는 여러 모기 속 (Aedes, Anopheles, Culex)에 걸쳐 유전자 발현, 사망률 및 산란 80 dsRNA 트리거에 대 한 응답을 평가 하 우리의 실험실에서 사용 되었습니다. Ae aegypti (ORL1952)의 식민지 변형에서 여성 dsRNA ribosomal 성적표 (참조 Estep 외. RPS6 및 RPL26에서에서 파생 된의 1 µ g 주입 dsRNA 생산 방법 및 시퀀스 데이터 5 ) 보여준 중요 한 다중 산란에 걸쳐 상대 식 (재)에서 감소 사이클 모기 제어 dsGFP 주사에 비해. Aedes aegypti 다시 2nd gonotrophic 주기 다음 측정 RPS6 식의 상당한 감소를 보여주었다 (P < 0.05) dsRPS6 같은 그룹 (그림 4)5 dsGFP 제어 스튜던트 t-검정에 의해 결정으로 주사 하는 모기에 .

통치는 여기 설명 된 산란 검정을 사용 하 여 개별 여성에서 평가 되었다. 3 일 후 주입 후 모기 혈액 공급, 개별 산란 컨테이너로 전송 완료를 허용 했다. 두 dsRPS6 Ae aegypti 취급에 대 한 첫 번째 gonotrophic 사이클에 대 한 평균 클러치 크기 크게 감소 (n = 102 여성, 1.3 ± 0.8 (평균 ± SE) 계란) 및 처리 하는 dsRPL26 (n = 86 여성, 4.0 ± 1.1 계란) dsGFP 주사에 비해 (n = 79 여성, 49.3 ± 3.5 계란 그림 5A). 두 번째 gonotrophic 주기 후 클러치 평가 또한 두 dsRNA 대우 그룹에 대 한 하지만 감소 효과 크기가 크게 감소 산란을 보였다. Ae aegypti 의 그룹 크기 변수 되었고 따라서 수단 분리 던의 테스트5에 의해 수행 됐다. 20-4 시간 사망률은 일반적으로 3% 이하로.

50 µ g 1에서 dsRPS6를 주입 하면 명확한 복용량 효력 관찰 되었다 여성 Ae aegypti, 및 클러치 크기 ng 25 ng/여성 dsRPS6 복용량 (그림 5B) 제외한 모든 주입 1 µ g/여성 dsGFP 컨트롤에 비해 크게 변화.

DsRNA 집의 microinjection 파리

식민지 파리 자리 부채 (정상 ORL)는 5 µ g의 dsRNA 구문 집 비행기 RPS6와 RPL26 증명서9에 대 한 설계와 함께 주입 했다. Ae aegypti에서 관찰 되었다 (그림 4 및 그림 5A)에 모두 특정 대 본 식 (RPS6 및 RPL26)의 상당한 감소와 클러치 크기 감소 관찰 되었다. 다시 중요 한 감소 같은 그룹의 dsGFP 제어 스튜던트 t-검정에 의해 결정 되었다 (P < 0.05) Holm Sidak 테스트 다른 M. domestica 에 대 한 클러치 크기 사이 의미를 결정 하는 데 사용 되었다 치료 그룹. DsGFP 파리를 먹이 틴데일 비스코 규모9에 별 정상 vitellogenin 증 착 했다 동안 난소 해 dsRPS6 및 dsRPL26 치료 감소 oogenesis를 보였다.

그림 1: 성인 모기 및 집 파리 microvolumes를 제공 하기 위한 Microinjection 설치. 주사는 현미경 슬라이드에서 진정 테이블 준비 냉 취 곤충에 수행 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2: Ae aegypti 및 M. domesticaMicroinjection 사이트. (A) 성인 Ae aegypti 는 mesokatepisternum의 중간 1/3에 주입 됩니다. (B) 성인 M. domestica 는 mesopleuron에 주입 됩니다. 화살표는 주사의 사이트를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3: 산란 검정 설치. (A) Ae aegypti 산란 분석 결과 산란 기판, 얇은 명주 그물 및 10% 자당 흠뻑 목화와 함께 출장으로 씨앗 발 아 종이 컵. (B) 성인 여성 M. domestica 산란 분석 결과 컨테이너에서와 음식 (A), 물 (B), 그리고 애벌레 미디어 (C). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4: Ae aegypti M. domestica 종의 dsRNAs 주사에서 RPS6의 상대 식입니다. Aedes aegypti 와 M. domestica 어느 제어 dsRNA (dsGFP)의 각각 1과 5 µ g을 주입 했다 또는 dsRNA 성적표 각 곤충에서 RPS6 또는 RPL26에 대 한 설계. 상당한 감소 (P < 0.05) RPS6의 식 모기와 파리 dsRPS6와 주입 파리 dsRPL26 (별표로 표시 된) 주사에 의해 관찰 되었다. 오차 막대는 평균 ± SE 나타내고 기본 열 번호 검사는 개인의 수를 나타냅니다. 이 그림 Estep 외 에서 수정 되었습니다. 5 와 Sanscrainte 외. 9. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 5: Ae aegypti 및 M. domestica 종의 dsRNAs 주사의 평균 클러치 크기입니다. (A) 계란 증 착 크게 감소 했다 (P < 0.05) Ae aegypti 에 어느 컨트롤의 각각 1과 5 µ g의 주사 후 M. domestica dsRNA (dsGFP) 또는 dsRNA 각 곤충에서 RPS6 또는 RPL26 성적에 대 한 설계. 별표는 같은 그룹의 dsGFP 컨트롤에서 상당한 차이 나타냅니다. 오차 막대는 평균 ± SE 나타내고 기본 열 번호 검사는 개인의 수를 나타냅니다. 이 그림 Estep 외 에서 수정 되었습니다. 5 와 Sanscrainte 외. 9. Ae aegypti 1000 ng/암 으로부터 50 ng/여성 dsRPS6 주사의 (B) 복용량 곡선 dsGFP 주입 동료에 비해 통치에 상당한 절감을 보여줍니다 (50, 100, 및 1000 ng/여성). 오차 막대는 복용량 당 36-81 개별 유기 체에서 평균 ± 95 %CI 나타냅니다. 문자로 포인트 대표 그룹 간의 중요 한 차이 (P < 0.05) ANOVA로 식별. 이 그림 Estep 외 에서 수정 되었습니다. 5. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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