Polyethyleneimine 코팅 된 산화 철 나노 입자 작은 간섭 RNA의 세포에 배달 하는 수단으로 생체 외에서 그리고 Vivo에서

요약

Polyethyleneimine (페이)를 사용 하는 방법 설명-siRNA와 transfecting 세포에 대 한 superparamagnetic 산화 철 나노 입자를 코팅. 이러한 나노 입자 세포 생체 외에서 그리고 vivo에서 및 침묵 대상 유전자 발현을 효율적으로 siRNA를 제공할 수 있습니다.

초록

면역 반응 조절에 그들의 중요 한 역할 때문에 세포 지속적으로 집중적인 연구의 대상이 되고있다 하 고 자가 면역 질환, 동맥 경화, 암 등 여러 질환에 유망한 치료 대상 대표. 프로브; 대 식 세포 기능을 조작 하는 선택의 귀중 한 접근은 RNAi 중재 한 유전자 침묵 그러나, siRNA와 대 식 세포의 transfection 종종 기술적으로 도전으로 간주 하 고, 현재, 대 식 세포를 siRNA 전송에 전념 하는 몇 가지 방법론을 사용할 수 있습니다. 여기, 우리는 siRNA의 세포 타겟된 배달에 대 한 차량으로 polyethyleneimine 코팅 superparamagnetic 철 산화물 나노 입자 (페이-SPIONs)를 사용 하 여 프로토콜을 제시. PEI SPIONs 바인딩 및 Fe: siRNA 무게 비율에 도달 하면 4 완전히 siRNA를 콘 덴 싱의 고 위에 할 수 있다. 생체 외에서이러한 나노 수 효율적으로 제공 siRNA transfection에 대 한 최적의 복용량에서 손상 세포 생존 능력 없이 대 식 세포와 같은 RAW 264.7 세포 라인에 뿐만 아니라 기본 세포로 하 고, 궁극적으로, 그들은 유도 siRNA 중재 대상 유전자 침묵입니다. SiRNA transfection 생체 외에서 사용 되 고, 떨어져 페이 SPIONs 세포에서 vivo에서를 siRNA를 제공 하기 위한 유망한 도구 있습니다. 자기적 성질 및 유전자 침묵 능력의 결합된 기능에 비추어 체계적으로 관리 페이-스파이/siRNA 입자 뿐만 아니라 대 식 세포 기능 조절 뿐만 아니라 몇 군데를 추적 세포 활성화 예상 된다. 페이-SPIONs 대 식 세포를 siRNA 전달, 안전, 간단 하 고 효과적인 nonviral 플랫폼을 대표 하는 본질적으로, 모두 생체 외에서 그리고 vivo에서.

서론

대 식 세포는 다른 금액에도 불구 하 고 모든 신체 조직에 배포 하는 타고 난 면역 세포의 유형입니다. 생산 함으로써 다양 한 cytokines 및 다른 중재자, 그들은 중요 한 역할을 재생 하는 미생물 병원 체 침입에 대 한 호스트 방어, 다음 부상, 조직 복구 및 조직의 항상성¹를 유지 하. 그들의 중요성 때문에 세포 지속적으로 집중적인 연구의 주제 되었습니다 합니다. 그러나, 유전자 조절 및 기능 연구에 있는 그것의 보급에도 불구 하 고 중재 하는 siRNA 유전자 침묵은 대 식 세포 때문에 성공 가능성이 이러한 셀-특히, 주 대 식 세포-는 종종 transfect 어렵다. 이 독성 연관 있는 세포 막 화학은 가장 잘 설립 transfection 접근 (예를 들면, 고분자와 지질)의 상대적으로 높은 수준의 관찰 작용 수 있다 또는 육체적으로 (예를 들어, electroporation 여 고 유전자 총) 교차 하는 그로 인하여 크게 줄이고 세포의 생존^2,3막 siRNA 분자를 방해 합니다. 또한, 대 식 세포는 전용된 phagocytes degradative 효소 풍부. 이러한 효소 siRNA, 유전자 특정 s....

프로토콜

관련 된 동물 동물에 따라 수행한 모든 방법을 조심 하 고 동남 대학, 중국의 지침을 사용 하 여.

1입니다. 페이 SPIONs의 준비

1. 올레산 수정 SPIONs의 준비
   1. FeCl₃•6H₂O와 FeSO₄•7H₂O N₂의 보호 아래 물에 용 해.
      1. 비 커에 FeCl₃•6H₂O의 28 g와 FeSO₄•7H₂O 이온된 물 80 mL에 20 g을 추가 합니다. 유리 도관을 통해 물에 N₂ 를 소개 하 고 고체 물질 해산 했다 때까지 저 어.
      2. 반응 혼합물 암모니아 물 (28%)의 40 mL의 추가 의해 따라 800 rpm의 교 반 속도로 72 ° C에가 열. 5 분 동안 저 어.
   2. 위에서 언급 한 솔루션에 dropwise 올레산의 9 mL를 추가 하 고 3 h 72 ° C에서 그것을 저 어.
   3. 차가운 실내 온도 (RT) 결과 솔루션. 자력 분리를 통해 솔루션을 침전.

결과

크기와 제타 페이-SPIONs이이 프로토콜을 사용 하 여 준비의 잠재력 29-48 nm의 범위에 있었다 (증가할수록 인덱스: 0.12-0.23) 및 30-48 mV, 각각. 그들은 분명 집계 없이 12 개월 동안 4 ° C에 물에서 안정 되어 있었다. 능력을 바인딩 그들의 siRNA를 평가 하려면 페이 SPIONs 다양 한 Fe: siRNA 무게 비율에 siRNA와 혼합 했다. 그림 1 는 Fe: siRNA 무게 비율에 도달 하면 4 그리고 위에, 무료 siRNA의 밴드 완전히 누락, 암시 하는 페이 SPIONs 성공적인 siRNA 바인딩을 보여 줍니다. 생물 의학 응용 프로그램에서 PEI의 주요 관심사는 그것의 독성, 높은 분자 무게와 높은 복용량에서 특히 강한 긍정적인 책임의 결과 이다. 같이 그림 2A, 페이-SPIONs는 제타와의 잠재적인 30.5 37 mV.......

토론

대 식 세포는 일반적으로 사용 되 nonviral 접근, electroporation, 양이온 리 등 지질 종에 의해 transfect 내 화물. 여기 우리 transfect siRNA와 대 식 세포를 안정적이 고 효율적인 방법을 설명 합니다. 현재 프로토콜을 사용 하 여, 이상 대 식 세포와 같은 RAW 264.7 세포 (그림 2B)와 쥐 복 막 대 식 세포¹⁸ 의 90% 수 수 페 세포 생존 능력의 중요 한 장애 없이 siRNA와. 이 메서드는 nanocarrier의 산화 철의 코어와 PEI의 셸 구성 전달 플랫폼 페이-스파이에 따라 다릅니다. 그래서, 프로토콜의 첫 번째 주요 단계 페이-SPIONs siRNA 전달에 적합의 합성입니다. 일반적으로, 페이 코팅 SPIONs 준비가 올레산 코팅 SPIONs에서 있는 올레산은 직접 교환 SPIONs의 표면에서 페이 또는 그 파생 상품¹⁵, 리.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DMEM	Gibco	C11995500BT	37°C에서 웜; C 사용 전 수조
소 태아 혈청	Gibco	A31608-02
페니실린/스트렙토마이신(1.5ml)	Gibco	15140122
테트라졸륨 기반 MTS 분석 키트	Promega	G3582	세포독성 분석용
RAW 264.7 세포주	Cell Bank of Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China	TCM13
조직 배양 플레이트(6-well)	코닝	3516
조직 배양 접시 (10cm)	코닝	430167
RNase-free 튜브 (1.5 ml)	AXYGEN	MCT-150-C
원심 분리기 튜브 (15 ml)	코닝	430791
트립신	Gibco	25200-056
Wistar 쥐	상하이 실험 동물 센터 중국어 아카데미 과학
바실러스 칼메트– 구에큐트; 린 동결 건조 분말	보조 관절염을 유발하기위한	중국 식품 의약 통제
siRNA	GenePharma (상하이, 중국)
Cy3-siRNA	RiboBio (광저우, 중국)
폴리에틸렌 이민 (10 kDa)	알라딘 화학 시약 (주)
암모니아 물	알라딘 화학 시약 Co., Ltd.
올레산	알라딘 화학 시약 Co., Ltd.
Dimethylsulfoxide	Aladdin 화학 시약 Co., Ltd.
FeSO4• 7H2O	Sinopharm 화학 시약 Co., 주식	회사 10012118
FeCl3• 6H2O	Sinopharm 화학 시약 Co., Ltd	10011918
Dimercaptosuccinicic acid	Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.
한외여과 튜브	Millipore	UFC910096
Tetramethylammonium hydroxide solution	Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.
입자 크기 및 제타 전위 분석기	Malvern, England	Nano ZS90

쥐에서 국립 연구소E107079A112077O108484D103272D107254T100882