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방법 논문

선 동적인 장 질병 마우스 모델에서 창 자 염증 단백질 폐지를 신호 하는 맛의 효과

8.3K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/58668

⸱

2018년 11월 9일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Life Sciences, Zhejiang University, 2Monell Chemical Senses Center

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기에 우리가 dextran 황산 나트륨 (DSS)에 면역 반응에 맛보기 관련 유전자의 무효의 효과 조사 하기 위해 프로토콜을 제시-선 동적인 장 질병 (IBD) 마우스 모델을 유도.

초록

선 동적인 장 질병 (IBD)는 면역-관련 위장 장애, 궤 양성 대 장 염 및 Crohn의 질병, 전세계 사람들의 수백만의 삶의 질에 영향을 주는 등 중 하나입니다. IBD 증상 복 통, 설사, 직장 출혈, 본질적인 microbiota, 음식 구성 요소, 장 상피 세포, 면역 세포 간의 상호 작용에서 발생할 수 있습니다. 그것은 장 상피와 면역 세포에 표현 된 각 주요 유전자는 콜론에 염증에 미치는 영향을 평가 하기 위해 특별 한 중요성 의입니다. G 단백질 결합 맛 수용 체, G 단백질 소 단위 α-gustducin와 다른 신호 단백질을 포함 하 여 창 자에서 발견 되었습니다. 여기, 우리가 사용 하 여 α-gustducin 대표 dextran 황산 나트륨 (DSS) 설명-창 자 점 막 면역과 염증에 미각 유전자 돌연변이의 효과 평가 하 IBD 모델을 유도. 이 메서드는 화학적으로 유도 된 IBD 모델 유전자 녹아웃 기술을 결합 하 고 따라서 다른 유전자를 exuberate 수 있습니다 또는 콜론에 DSS 유도 된 면역 반응을 저해할 뿐 아니라 미각 유전자 무효의 결과 평가에 적용할 수 있습니다. 돌연변이 쥐를 일정 기간 동안 자신의 몸 무게의 자, 직장 출혈 모니터링 및 기록에 대 한 DSS와 함께 관리 됩니다. 관리 하는 동안 다른 timepoints에서 일부 마우스 안락사는, 크기 및 그들의 spleens와 콜론의 무게 측정 그리고 창 자 조직 수집 및 처리 조직학 및 유전자 표정 분석. 데이터는 과도 한 체중 감소, 설사, 장 출혈, 조직 손상 및 염증 대 야생-타입 마우스에 α-gustducin 녹아웃 결과 표시. 마우스 긴장, 주택 환경, 그리고 다이어트에 의해 유발된 염증의 심각도 영향을 DSS 농도 및 관리 기간 파일럿 실험의 최적화가 특히 중요 합니다. 이러한 요소를 조정 하 여 두 안티-과 프로-염증 성 효과 평가 하기 위해이 메서드를 적용할 수 있습니다.

서론

선 동적인 장 질병 (IBD), (CD), 크 론 병 및 궤 양성 대 장 염 (UC)의 두 가지 주요 형태는 multifactorial 병 인1,2 장의 만성 remittent 또는 진보적인 선 동적인 조건 특징 . IBD의 개발 다이어트, 항생제 사용, 같은 유전자로 특정 환경 요인에 따라 달라 집니다 중요 한 병원 성 감염. 그러나, 병 인 및 IBD 기본 규정 분자 메커니즘 여전히 명확 하지 않다. 따라서, 많은 화학적으로 유도 된 IBD 동물 모델이 건설 고 pathogenesis 및 규제 메커니즘 윤곽을 그리 다 고 인간 치료제3의 효과 평가에 적용 되었습니다.

맛 수용 체 G 단백질 결합 된 수용 체 (GPCRs) 이며 두 가지 주요 유형으로 분류 됩니다: 난 (T1Rs)을 입력 하 고 유형 II (T2Rs) 달콤한, umami, 그리고 쓴 화합물을 검출 하는. 맛 신호 폭포 tastant 바인딩 T1Rs 또는 T2Rs, 활성화는 heterotrimeric G 단백질의 α-gustducin와 Gβγ 이합체로 구성 된와 Gβγ subunits의 출시를 선도 시작 됩니다. Gβγ moiety 차례로 다운스트림 이펙터 효소 phospholipase C-β2 (PLC-β2) 자극. 활성화 된 PLC-β2 phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate 두 세포내 이차 메신저 [이노 시 톨-1,4,5-trisphosphate (IP3) 및 diacylglycerol], 그리고 IP3 바인딩 하로 hydrolyzes 그리고의 채널 수용 체 IP3 열 R3, 바인딩과 그물에서 칼슘 이온을 방출. 결국 일시적인 수용 체 잠재력 이온 채널 Trpm5의 열고 릴리스는 미각 신경4,,56,7에 신경 전달 물질 ATP의 리드. 그러나, 짠 맛과 신 맛의 신호 경로, umami, 다 정하고 쓴 맛8에서 다르고 독립적인 있습니다. 또한, 맛 GPCRs의 구성 요소 및 다운스트림 단백질 다양 한 여분 구강 조직에 존재합니다. 최근 연구는 α-gustducin 표시, 맛 신호의 주성분 장내 점 막에서 표현 될 발견 된다. 더 연구는 이러한 맛 신호 구성 요소 추가-구강 조직을9,10의 기능을 이해 필요 합니다.

여기에 설명 된 메서드 외 구강 조직에 표현 하는 미각 신호 단백질의 기능을 특성화 하는 데 사용 됩니다. 우리는 화학적으로 유도 된 대 장 염 모델 입맛에 신호 폭포를 묘사에 대 한 개발 된 유전자 변형 마우스 선 결합. 절차적 결함과 인간의 궤 양성 대 장 염을 병 적인 유사성 때문에 크게는 dextran 황산 나트륨 (DSS)-유도 IBD 모델은 다양 한 화학적으로 유도 된 대 장 염 모델11중 가장 널리 이용 되는. 이 연구에서 우리가 사용 α gustducin 불충분 한 쥐 대표 마우스 선으로 1) 조직의 형태학 적 변화를 분석 하 고 2)의 표현에 차이 시 금 창 자 점 막 면역과 염증에 α-gustducin의 소설 기능을 크린 시 토 킨 결에 염증에 관련 된 양적 및 질적으로 미각 신호 (단백질과 다른 단백질에에서 표현)의 기여 장 염증, 조직 손상 하 때 결정 유전자 변형된 마우스의 유전자에 대 한 라인이 메서드를 사용할 수 있습니다. 관심은 사용할 수 있습니다. 이 방법의 이점은 모두 화학 DSS의 행동 및 관심사의 유전자의 결핍에서 발생 하는 통합된 데이터를 얻기 위해 사용자가 활성화 됩니다. 이 방법은 그것의 감도 증가 하 고 세포 및 분자 수준에서 미묘한 장 변화를 공개를 더 개선할 수 있습니다.

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프로토콜

쥐를 포함 하는 모든 실험 검토 하 고 기관 동물 관리와 Zhejiang 대학 사용 위원회에 의해 승인 했다. 이 프로토콜을 수행 하기 전에 적절 한 개인 보호 장비를 착용 하는 것이 좋습니다.

1입니다. 마우스 및 DSS의 준비

  1. 유지는 녹아웃 (α-gustducin-/-) 마우스 및 나이, 성별 및 몸 무게 일치 야생-타입 컨트롤 (α-gustducin+ +) 개별적으로 깨끗 한 장에 C57BL/6 쥐.
    참고: 녹아웃 쥐 20 세대 이상 C57BL/6 마우스 backcrossed 되어 있고 거의 100 %C57BL / 6 유전 배경.
  2. Dextran 압력가 물 1 L에 황산 나트륨 (DSS) 가루 30 g을 분해. 혼합 때까지 솔루션 최종 작업 농도 3% (w/v) 되도록 명확 하 게 된다.
    참고: DSS 솔루션 저장할 수 있습니다 1 주까지 동안 실내 온도에 또는 4 ° C에서 사용까지.

2. 유도 및 쥐에 DSS Colitis의 평가

  1. 무게 고 각 마우스의 초기 몸 무게를 기록 합니다. 표준 플라스틱 감 금 소에는 쥐를 개별적으로 배치 및 레이블 새 장을.
  2. 일반 3%는 두 그룹의 쥐가 7 일의 총에 대 한 DSS 솔루션 물 마시는 바꾸기 광고 libitum액세스할.
  3. 마우스의 몸 무게를 측정, DSS 솔루션 소비를 기록 하 고 수집 하 고 DSS 관리 동안 매일 각 마우스의 대변 검사. 설사, 직장 출혈의 심각도 관찰 하 고이 DSS 유도 질병 색인12로 변환.
  4. 실험 기간 동안 초기 체중 및 질병 색인에 비해 체중 감소의 비율 대 장 염의 증상을 평가 하 계산 됩니다.
    참고: 질병 색인 설사, 직장 출혈의 관찰을 결합 하 여 득점 하 고 다음과 같이 정의 됩니다: 0 (정상의 자, 혈액), 1 (부드러운의 자, 혈액), 2 (부드러운의 자, 작은 혈액), 3 (매우 부드러운의 자, 겸손 한 출혈), 4 (물 대변, 중요 한 출혈)12. 질병 색인 매일 각 마우스에 대 한 분석 이다.
  5. 7 일 DSS 치료의 끝으로 쥐 자 궁 경부 전위에 의해 희생 하 고 나머지 실험으로 진행.

3입니다. 조직 샘플의 준비

  1. 부정사 위치에 마우스를 놓고 70% 에탄올과 복 부의 피부를 청소 합니다. 복 부 구멍을 노출 하는 작은 위 가진 복 부에 3 cm 긴 중간 절 개를 확인 합니다.
  2. 집게의 쌍을 사용 하 여 신중 하 게 다른 조직에서 비장을 분리 다음 비장을 제거 하 고, 그것의 크기를 측정.
  3. 식별 및 콜론 집게와 들어올린 주변 mesentery에서 분리. 맹 및 직장 표시 될 때까지 전체 결 장 밖으로 당겨.
  4. Colonocecal 여백에와 각각 인접 하 고 원심 콜론을 골반에 깊은 transecting에 의해 콜론을 격리 합니다. 다음, 측정 하 고 절연된 콜론의 길이 기록 합니다. 수 해 동안 저 승 조직을 손상 하지 않도록 주의 하십시오.
  5. 10 mL 주사기는 eluate 완전히 취소 될 때까지 대변과 혈액을 제거 하는 gavage 바늘 갖춘 차가운 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)의 10 mL와 콜론을 플러시.
  6. 조직학 식별을 위해 분할 조직 샘플 동등 하 게 세 부분으로: 근 위, 중간, 그리고 원심. 다음, 수정 조직 4 %paraformaldehyde (PFA)와 하룻밤에 4 ° c.
  7. 사이토카인 발현의 분석에 대 한 액체 질소로 급속 하 게 전체 콜론을 고정 하 고 사용까지-80 ° C에서 그것을 저장 합니다.

4. 조직학 DSS 유도 Colitis의 심각도 평가

  1. 되며 고 오신 (H & E) 얼룩
    1. 고정, 후 잠수함 1 x PBS 15 mL 튜브에서 하룻밤에 30% 자당 해결책에서 조직 cryoprotect을 샘플.
    2. 최적의 절삭 온도 (10 월) 화합물에 조직을 포함 하 고 OCT 견고까지-20 ° C에서 그것을 배치.
    3. cryostat는 조직을 포함 하는 10 월 블록 전송 12 µ m 및 슬라이스 cryostat에 두께 다이얼을 설정 하 고 12 µ m 두께 냉동된 섹션을 수집.
    4. 뜨거운 접시에 20 분 동안 65 ° C에서 cryostat에서 수집 된 조직 단면도 열.
    5. 씻고 증류수에 간단히 섹션. 5 분에 대 한 솔루션을 얼룩이 지는 hematoxylin와 얼룩 고 이후 5 분 동안 수돗물 실행 린스.
    6. 0.5% 염 산-에탄올 30 s와 린스 그들 실행에 1 분 동안 수돗물에 대 한 섹션을 구분 합니다. 다음, 1 분에 대 한 1 x PBS에 세척을 수행 하 고 이후 5 분 동안 수돗물 실행 린스.
    7. 10 s. Counterstain 오신 2 분에 대 한 솔루션을 얼룩이 지기를 위해 각각 70%, 75%, 80%, 및 95% 알코올에 조직 단면도의 세척을 수행 합니다.
    8. 각 시간 5 분 동안 95% 알코올을 2 변경 절대 알코올의 탈수를 수행 합니다. 5 분 동안 크 실 렌의 변화 2에 분명.
    9. 각 마우스의 근 위, 중간, 그리고 원심 콜론의 조직 손상 유전자 녹아웃 및 야생-타입 그룹은 위의 H & E 염색의 결과에 따라 점수.
      참고: 질병 인덱스는 상피의 손상과 다음과 같이 정의 되는 점 막, submucosa, muscularis, 그리고 serosa 지역, 염증의 결합 된 점수: 0 (조직 손상 및 염증), 1 (초점 조직 손상과 염증), 2 (누 덕 누 덕 조직 손상과 염증), 고 3 (확산 조직 손상과 염증)12,13. 결 장의 근 위, 중간, 그리고 원심 부분에 대 한 마우스 당 3 개의 점수는 다음 각 동물에 대 한 총 점수 표현 됩니다. 각 그룹에 대 한 평균 점수 다음 계산 됩니다.
  2. Immunohistochemistry14
    1. 뜨거운 접시에 20 분 동안 65 ° C에서 cryostat에서 수집 된 조직 단면도 열. 1 x PBS 3 시간, 10 분에에서 섹션을 씻어. 내 인 성 과산화 효소를 제거 하기 위해 10 분 동안 3%의 과산화 수소의 조직 단면도 품 어. 섹션 3 번 더 세척. 조직 1 시간 실 온에서 버퍼 (BSA는 3%, 0.3% 비 이온 세제, 2% 염소 혈 청, 1 x PBS에 0.1% 나트륨 아 지 드) 또는 더 차단으로 차단 합니다.
    2. 다음과 같은 면역 세포 유형 특정 기본 항 체를 포함 하는 솔루션으로 블로킹 버퍼를 대체: CD45 백혈구에 대 한, CD3 T 세포에 대 한, B 셀 B220, 대 식 세포에 대 한 CD11b 및 호 중구에 대 한 Ly6G. 4 ° C에서 밤새 품 어.
    3. 포부에 의해 조직 섹션에서 기본 항 체를 제거 합니다. 1 x PBS 3 시간, 10 분에 대 한 섹션을 씻어. Biotinylated 이차 항 체와 streptavidin HRP 복잡 한 실 온에서 부 화 뒤와 섹션을 품 어.
    4. 빛 또는 어두운 갈색 색상을 개발 하 고 시각화 immunoreactive 셀에 3, 3'-diaminobenziding (DAB) 솔루션 섹션을 품 어.
    5. 되며와 0.3% (v/v) 희석 암모니아 섹션 counterstain 10 배 확대 현미경 아래에서 밝은 필드 이미지를 가져가 라.
    6. 식별 하 고 계량 상피와 lamina propria (상피) 아래에 표시 된 면역 세포의 인구는 이미지 처리 프로그램을 사용 하 여 여 2 마스크 설정: 색상 큐브 기반 기능에 첫 번째 마스크를 사용 하 여 색상 검출 설정 임계값 측정 색된 소량 반응 영역; 두 번째 마스크를 사용 하 여 상피 및 검사 섹션에서 층 류 오는의 총 영역을 결정 하. Immunoreactive 셀 인구의 비율로 시험된 직물의 총 면적을 침투 셀의 착 색 영역을 표현 한다.

5. DSS 유도 Colitis의 진 식 평가

  1. DSS 처리 유전자 녹아웃-80 ° C 냉동 고에서 야생-타입 마우스에서 콜론 조직 검색 그리고 25 mg의 조직, 세포의 용 해 버퍼의 0.6 mL을 추가 균질 화기에 균질.
  2. 총 RNA, 및 어떤 오염 게놈 DNA를 제거 하는 DNase를 추출 하는 RNA 추출 키트의 프로토콜을 따릅니다.
  3. 추출 된 RNA의 품질을 확인 하는 agarose 젤을 실행 합니다. 자사의 28S RNA 밴드 18 밴드 보다 밝은 경우에, 그것은 사용 가능한입니다. microspectrophotometer에 RNA 농도 결정 하는 RNA 샘플의 1 µ L를 가져가 라.
  4. 20 mM 올리고 (dT)12,13,14,15,16,,1718 뇌관의 2.5 µ L와 Moloney murine 백혈병의 1 µ L 총 RNA의 믹스 1 µ g 바이러스 (MMLV) 역전사 준비는 cDNA를 60 분 동안 42 ° C에서 품 어.
  5. TNF, IFN-γ, 일리노이 대 한 정방향 및 역방향 정량 Pcr 뇌관의 0.5 µ L 1µL는 cDNA의 혼합 하 여 실시간 PCR 반응 설정-13-5, 일리노이, 일리노이-10, TGF-β1, 및 β-말라 형광 녹색 염료 x 2 뿐만 아니라 제어로.
  6. 다음 매개 변수는 정량 실행: 10 95 ° C의 45 주기 다음 10 분 동안 95 ° C s, 25 ° C 50 s 및 20 72 ° C s.
  7. 2-ΔΔCt 방법15를 사용 하 여 유전자 발현의 상대적 부 량을 계산 합니다. 비교적에 녹아웃 vs진 식 수준 분석. 야생-타입 마우스입니다.

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결과

DSS 유도 IBD 절차 관리 3%에 의해 설립 되었다 DSS α-gustducin-녹아웃 (KO) 및 야생-타입 (WT) 쥐에 식용 수에서. WT 쥐에 비해, 녹아웃 쥐와 과도 한 체중 감소, 설사, 장 출혈 (그림 1) 더 가혹한 colitis 전시. 7 일 DSS 관리 후 조직의 무결성에 차이 H & E 조직학 방법으로 얼룩을 사용 하 여 분석 되었다 그리고 더 악화 조직 손상이 WT 쥐 ( 보다 녹아웃 쥐의 근 위, 중간, 그리고 원심 콜론에서 발견 되었습니다. 그림 2). 또한, 과도 한 면역 활성화 대 식 세포, 호 중구 등 다양 한 염증 세포의 침투와 대 장 염에 지도 했다. Immunohistochemical 분석 면역 세포에 대 한 다양 한 마커를 사용 하 여 면역 세포 침투 α-gustducin 결핍에 영향을 받는지 확인 하기 위해 실행 되...

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토론

이 메서드는 quantitively에 채택 될 수 있다 염증 DSS 유도 IBD 마우스 모델에서 특정 미각 유전자의 돌연변이의 효과 결정. 활용, IBD의 최적의 유도 중요 한 단계입니다. Colitis의 개발은 마우스 스트레인, 주택 환경, 장내 microflora, 뿐만 아니라 관심의 유전자를 포함 한 여러 요인에 의해 영향을 받습니다. 다른 복용량을 테스트 하는 쥐의 작은 숫자와 DSS 관리의 기간 파일럿 실험을 수행 하는 것이 좋습니다. 파일럿 실험, 체중 감소, 설사, 장 출혈, 그리고 조직 손상 등 미세한 변화가 심한 증상, 면역 세포 침투와 관련 된 염증 및 cytokines의 식 수준 변화 되어야 합니다. 분석 하 고 컨트롤 그룹을 DSS16,17,,1819없이 식 수에 비해. DSS-치...

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공개 사항

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

감사의 글

이 작품은 국립 자연 과학 재단의 중국 (81671016, 31471008, 및 31661143030) 및 건강의 국가 학회 (DC010012, DC015819)에서 교부 금에 의해 및 Siyuan 재단에 의해 지원 됩니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
항체
CD45BD Biosciences550539
CD3BD Biosciences555273
B220BD Biosciences550286
CD11bBD Biosciences550282
Ly6GBD Biosciences551459
< strong>시약
Dextran Sulfate Sodium Salt (DSS)MP Biomedicals2160110
Streptavidin-HRP complexBD Pharmingen 551011
H& E 염색 키트BBI Life SciencesE607318
Phosphate Buffered Saline (PBS)Sangon BiotechB548117
FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)Roche4913850001
MMLV Reverse Transcriptase, GPRClontech,TaKaRa639574
TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit TaKaRa9767
BD 10 mL 주사기BD Biosciences309604
기기 및 장비
균형
가위 
펜치
원심분리기
qPCR 기계
염색 항아리
소프트웨어
Imag-Pro Plus 미디어 사이버네틱스, Inc. 

참고문헌

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