선 동적인 장 질병 마우스 모델에서 창 자 염증 단백질 폐지를 신호 하는 맛의 효과

요약

여기에 우리가 dextran 황산 나트륨 (DSS)에 면역 반응에 맛보기 관련 유전자의 무효의 효과 조사 하기 위해 프로토콜을 제시-선 동적인 장 질병 (IBD) 마우스 모델을 유도.

초록

선 동적인 장 질병 (IBD)는 면역-관련 위장 장애, 궤 양성 대 장 염 및 Crohn의 질병, 전세계 사람들의 수백만의 삶의 질에 영향을 주는 등 중 하나입니다. IBD 증상 복 통, 설사, 직장 출혈, 본질적인 microbiota, 음식 구성 요소, 장 상피 세포, 면역 세포 간의 상호 작용에서 발생할 수 있습니다. 그것은 장 상피와 면역 세포에 표현 된 각 주요 유전자는 콜론에 염증에 미치는 영향을 평가 하기 위해 특별 한 중요성 의입니다. G 단백질 결합 맛 수용 체, G 단백질 소 단위 α-gustducin와 다른 신호 단백질을 포함 하 여 창 자에서 발견 되었습니다. 여기, 우리가 사용 하 여 α-gustducin 대표 dextran 황산 나트륨 (DSS) 설명-창 자 점 막 면역과 염증에 미각 유전자 돌연변이의 효과 평가 하 IBD 모델을 유도. 이 메서드는 화학적으로 유도 된 IBD 모델 유전자 녹아웃 기술을 결합 하 고 따라서 다른 유전자를 exuberate 수 있습니다 또는 콜론에 DSS 유도 된 면역 반응을 저해할 뿐 아니라 미각 유전자 무효의 결과 평가에 적용할 수 있습니다. 돌연변이 쥐를 일정 기간 동안 자신의 몸 무게의 자, 직장 출혈 모니터링 및 기록에 대 한 DSS와 함께 관리 됩니다. 관리 하는 동안 다른 timepoints에서 일부 마우스 안락사는, 크기 및 그들의 spleens와 콜론의 무게 측정 그리고 창 자 조직 수집 및 처리 조직학 및 유전자 표정 분석. 데이터는 과도 한 체중 감소, 설사, 장 출혈, 조직 손상 및 염증 대 야생-타입 마우스에 α-gustducin 녹아웃 결과 표시. 마우스 긴장, 주택 환경, 그리고 다이어트에 의해 유발된 염증의 심각도 영향을 DSS 농도 및 관리 기간 파일럿 실험의 최적화가 특히 중요 합니다. 이러한 요소를 조정 하 여 두 안티-과 프로-염증 성 효과 평가 하기 위해이 메서드를 적용할 수 있습니다.

서론

선 동적인 장 질병 (IBD), (CD), 크 론 병 및 궤 양성 대 장 염 (UC)의 두 가지 주요 형태는 multifactorial 병 인^{1,2 장의 만성 remittent 또는 진보적인 선 동적인 조건 특징} . IBD의 개발 다이어트, 항생제 사용, 같은 유전자로 특정 환경 요인에 따라 달라 집니다 중요 한 병원 성 감염. 그러나, 병 인 및 IBD 기본 규정 분자 메커니즘 여전히 명확 하지 않다. 따라서, 많은 화학적으로 유도 된 IBD 동물 모델이 건설 고 pathogenesis 및 규제 메커니즘 윤곽을 그리 다 고 인간 치료제³의 효과 평가에 적용 되었습니다.

맛 수용 체 G 단백질 결합 된 수용 체 (GPCRs) 이며 두 가지 주요 유형으로 분류 됩니다: 난 (T1Rs)을 입력 하 고 유형 II (T2Rs) 달콤한, umami, 그리고 쓴 화합물을 검출 하는. 맛 신호 폭포 tastant 바인딩 T1Rs 또는 T2Rs, 활성화는 heterotrimeric G 단백질의 α-gustducin와 Gβγ 이합체로 구성 된와 Gβγ subunits의 출시를 선도 시작 됩니다. Gβγ moiet....

프로토콜

쥐를 포함 하는 모든 실험 검토 하 고 기관 동물 관리와 Zhejiang 대학 사용 위원회에 의해 승인 했다. 이 프로토콜을 수행 하기 전에 적절 한 개인 보호 장비를 착용 하는 것이 좋습니다.

1입니다. 마우스 및 DSS의 준비

1. 유지는 녹아웃 (α-gustducin^-/-) 마우스 및 나이, 성별 및 몸 무게 일치 야생-타입 컨트롤 (α-gustducin^{+ +}) 개별적으로 깨끗 한 장에 C57BL/6 쥐.
   참고: 녹아웃 쥐 20 세대 이상 C57BL/6 마우스 backcrossed 되어 있고 거의 100 %C57BL / 6 유전 배경.
2. Dextran 압력가 물 1 L에 황산 나트륨 (DSS) 가루 30 g을 분해. 혼합 때까지 솔루션 최종 작업 농도 3% (w/v) 되도록 명확 하 게 된다.
   참고: DSS 솔루션 저장할 수 있습니다 1 주까지 동안 실내 온도에 또는 4 ° C에서 사용까지.

2. 유도 및 쥐에 DSS Colitis의 평가

1. 무게 고 각 마우스의 초기 몸 무게를 기록 합니다. 표준 플라스틱 감 금 소에는 쥐를 개별적으로 배치 및 레이블 새 장을.
2. 일반....

결과

DSS 유도 IBD 절차 관리 3%에 의해 설립 되었다 DSS α-gustducin-녹아웃 (KO) 및 야생-타입 (WT) 쥐에 식용 수에서. WT 쥐에 비해, 녹아웃 쥐와 과도 한 체중 감소, 설사, 장 출혈 (그림 1) 더 가혹한 colitis 전시. 7 일 DSS 관리 후 조직의 무결성에 차이 H & E 조직학 방법으로 얼룩을 사용 하 여 분석 되었다 그리고 더 악화 조직 손상이 WT 쥐 ( 보다 녹아웃 쥐의 근 위, 중간, 그리고 원심 콜론에서 발견 되었습니다. 그림 2). 또한, 과도 한 면역 활성화 대 식 세포, 호 중구 등 다양 한 염증 세포의 침투와 대 장 염에 지도 했다. Immunohistochemical 분석 면역 세포에 대 한 다양 한 마커를 사용 하 여 면역 세포 침투 α-gustducin 결핍에 영향을 받는지 확인 하기 위해 실행 되.......

토론

이 메서드는 quantitively에 채택 될 수 있다 염증 DSS 유도 IBD 마우스 모델에서 특정 미각 유전자의 돌연변이의 효과 결정. 활용, IBD의 최적의 유도 중요 한 단계입니다. Colitis의 개발은 마우스 스트레인, 주택 환경, 장내 microflora, 뿐만 아니라 관심의 유전자를 포함 한 여러 요인에 의해 영향을 받습니다. 다른 복용량을 테스트 하는 쥐의 작은 숫자와 DSS 관리의 기간 파일럿 실험을 수행 하는 것이 좋습니다. 파일럿 실험, 체중 감소, 설사, 장 출혈, 그리고 조직 손상 등 미세한 변화가 심한 증상, 면역 세포 침투와 관련 된 염증 및 cytokines의 식 수준 변화 되어야 합니다. 분석 하 고 컨트롤 그룹을 DSS^16,17,,1819없이 식 수에 비해. DSS-치.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
항체
CD45	BD Biosciences	550539
CD3	BD Biosciences	555273
B220	BD Biosciences	550286
CD11b	BD Biosciences	550282
Ly6G	BD Biosciences	551459
< strong>시약
Dextran Sulfate Sodium Salt (DSS)	MP Biomedicals	2160110
Streptavidin-HRP complex	BD Pharmingen 551011
H& E 염색 키트	BBI Life Sciences	E607318
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sangon Biotech	B548117
FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)	Roche	4913850001
MMLV Reverse Transcriptase, GPR	Clontech,TaKaRa	639574
TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit	TaKaRa	9767
BD 10 mL 주사기	BD Biosciences	309604
기기 및 장비
균형
가위
펜치
원심분리기
qPCR 기계
염색 항아리
소프트웨어
Imag-Pro Plus	미디어 사이버네틱스, Inc.